CN103966186A - 一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶a的热稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶工程技术领域，涉及一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法。本发明以枯草芽孢杆菌脂肪A为研究对象，首先从RCSB数据库中获取其晶体结构，再利用分子动力学分析其不同Loop区域的柔性；经由上述理性分析，并结合“脯氨酸效应”理论，将筛选得到柔性较高Loop区域的甘氨酸残基突变为脯氨酸；再通过分子动力学模拟验证筛选得到的突变结果；最终，通过枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株的热稳定性实验，验证热稳定性改造的热点残基。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，涉及一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法。
背景技术
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，是一种特殊的酯键水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反应，生成脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯。枯草芽孢杆菌分泌的脂肪酶A是一类在食品、医药、化工等领域具有良好应用前景的生物催化剂。枯草芽孢杆菌脂肪酶是最小的α/β折叠脂肪酶，且缺乏多数脂肪酶都具有的α螺旋形成的“盖子结构”，从而没有其它脂肪酶具有的界面激活效应。但是枯草芽孢杆菌脂肪酶A对温度极其敏感，在温度超过40℃时，其酶活会急剧下降。
酶的热稳定性是酶的重要属性之一，热稳定性酶具有提高化学反应速率、简化工艺、降低成本、提高产品质量、活性稳定、耐贮藏等优点。因而寻找耐温性酶，提高酶的热稳定性一直是生产和科研关注的热点。虽然目前已经有大量的关于酶热稳定性改造研究的报道，但是传统的理性设计方法受到蛋白质结构及功能关系复杂性的限制，而非理性设计方法则需要面临筛选容量大、过程复杂等难题，这两种方法各自的缺点在一定程度上限制了蛋白质改造领域的工作进展。
发明内容
本发明的技术目的是针对现有技术的不足，结合脯氨酸效应提出一种高效的计算机辅助筛选提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法。
本发明的技术目的可通过如下技术方案实现：基于脯氨酸效应提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A（Bacillus subtilis lipase A， PBD: 1I6W）热稳定性的方法，包括如下步骤：
1）获取枯草芽孢杆菌脂肪酶A晶体结构，通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较高的Loop区域；
2） 结合脯氨酸理论效应分析确定位于柔性较高Loop区域的甘氨酸（Gly）残基；
3）基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子动力学模拟技术解析将相关甘氨酸位点置换为脯氨酸后对枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构稳定性的影响；
4）构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体并验证其热稳定性，获得热稳定性得到提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株。
优选的，步骤1）所述的获取枯草芽孢杆菌脂肪酶A晶体结构并通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较高的Loop区域的方法为：通过检索蛋白数据库(Protein data bank)RCSB数据库得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A（PBD: 1I6W）的晶体结构，使用软件Pymol0.9分析枯草芽孢杆菌脂肪酶A的三维结构,利用分子动力学方法，得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A的Rmsf（Root mean square fluctuation）值，从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶A柔性较大的区域。
优选的，步骤2）所述的结合脯氨酸效应分析确定柔性较高区域的甘氨酸（Gly）残基的方法为：根据步骤1）得到的枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSF图，利用Pymol可视化软件，确定位于柔性较高Loop区域的Gly残基作为突变位点突变为Pro，分别为Gly153Pro、Gly155Pro、Gly158Pro、Gly111Pro、Gly116Pro、Gly46Pro、Gly52Pro。
优选的，步骤3）所述的采用分子动力学模拟技术解析将相关甘氨酸位点置换为脯氨酸后对稳定枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构的影响的方法为：通过分析均方根偏差RMSD（Root Mean Square Deviation）与均方根涨落RMSF（Root Mean Square Fluctuation）参数，来分析引入的Pro突变位点对枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的贡献，确定得到提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的重要氨基酸位点是Gly52Pro和Gly158Pro。
优选的，分子动力学模拟技术具体为：所有动力学模拟均采用GROMACS4.5.4进行，体系在中性条件下，溶剂模型SPC，力场为GROMOS9653a6，温度为400K，相应地抗衡离子中和体系电荷；体系首先采用最速下降法能量最小化（Steepest Descent）进行优化；然后固定蛋白，采用压力（Parrinello-Rahman）与温度（V-rescale）进行500 ps约束优化；最后进行分子动力学模拟，放松蛋白，时间步长为2 fs，模拟时间为10 ns。体系每隔1 ps收集一次数据。
优选的，步骤4）所述的分子生物学构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株的方法是采用全质粒扩增的方式进行突变：首先，设计分别含有Gly52Pro和Gly158Pro的引物，用primSTAR对全质粒进行扩增，突变质粒分别转入DH5α，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，再转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养；提取质粒，并转入BL21（DE3），涂布平板，构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变菌BL21-pET22b-LipA。
本发明的有益效果在于：
本发明以枯草芽孢杆菌脂肪酶A（PDB：1I6W）为研究对象，在计算机辅助设计的基础上将脯氨酸理论应用于枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性改造上，通过分子动力学模拟技术直接分析其三维结构找出相关的脯氨酸位点，并预测定点突变枯草芽孢杆菌脂肪酶A后对其稳定性的影响。既避免了现有技术中非理性设计方法需要面临的筛选容量大、过程复杂等难题，同时简化了理性设计方法使得蛋白质的定点突变更具有针对性，并最终成功实现了枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性的显著提高，通过本发明的方法得到的突变菌LipAG52P、 LipAG158P在50℃下保温1小时后的相对残余酶活是原始菌（LipA）的倍数分别为2.99倍和2.32倍。
附图说明
图1本发明枯草芽孢杆菌脂肪酶A筛选热稳定点示意图。
图2 枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSD随时间变化的演示图。
图3 在300K平衡时间段，枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSF。
图4 LipGly52Pro与LipGly158Pro的RMSD随时间变化的演示图。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
本发明中，脯氨酸效应是指脯氨酸（Pro）受其吡咯烷环的束缚而具有更小的构象自由度，同时限制其前面氨基酸的构象空间，因此它比其他氨基酸更能增加蛋白质的刚性；相对地，甘氨酸（Gly）没有侧链且具有灵活的构象，可增加蛋白质的柔性。因此适当的引入Pro，可降低蛋白质去折叠时的骨架熵从而达到提高蛋白质的热稳定性的作用。
实施实例1
本实施例说明本发明的步骤1）的获取枯草芽孢杆菌脂肪酶A晶体结构并通过分子动力学手段分析其中柔性较高Loop区域的方法。以枯草芽孢杆菌脂肪酶A（Bacillus subtilis LipA，PDB：1I6W）为研究目标，通过RCSB数据库检索得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A的晶体结构；将获得的枯草芽孢杆菌脂肪酶A进行20 ns分子动力学模拟（图2），提取平衡时间段分析枯草芽孢杆菌脂肪酶A的均方根涨落RMSF（图3）。
实施实例2
本实施例说明本发明的步骤2）的结合脯氨酸效应分析确定柔性较高Loop区域的甘氨酸（Gly）残基为突变位点的方法。根据步骤1）得到的枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSF图，通过Pymol可视化软件结合“脯氨酸效应”理论分析，最终，本轮的筛选得到的突变位点结果是：Gly153、Gly155、Gly158、Gly111、Gly116、Gly46、Gly52。
实施实例3
本实施例说明步骤3）的通过分子动力学模拟分析，将筛选得到的Gly残疾突变为为Pro对枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性影响的方法。
利用在线服务器SWISS-Model构建Gly153Pro、Gly155Pro、Gly158Pro、Gly111Pro、Gly116Pro、Gly46Pro、Gly52Pro突变体，并利用Verify_3D对构建的突变体模型进行评估与优化。枯草芽孢杆菌脂肪酶A及其突变体的动力学模拟采用GROMACS4.5.4软件包进行。模拟的步骤主要包括以下几个步骤：
第一步采用pdb2gmx命令添加蛋白中缺失的氢原子。并采用立方体盒子填充SPC溶剂水模型与GROMOS9653a6力场。该命令为：
pdb2gmx -f LipA.pdb -o.gro -p LipA.top -i .itp -water spc -ignh
editconf -bt cubic -f LipA.gro -o LipA.gro -d 0.9
第二步采用genbox命令为立方体盒子填充水分子。并修改top文件中水分子数目。该命令格式为：
genbox -cp LipA.gro -cs spc216.gro -o LipA_b4em.pdb -p LipA.top
第三步利用genion命令加入相应地抗衡离子来中和体系电荷，同时修改top与gro文件水分子与离子数目，使数目相匹配。该命令格式为：
grompp -f em.mdp -c LIPA_b4em.pdb -p LIPA.top -o LIPA_em.tpr
genion -s LipA_em.tpr -o LipA_ion.pdb -pname CL -np 5 -g LipA_ion.log
第四步将优化信息写入二进制文件tpr中，利用grompp与mdrun进行模拟体系的能量最小化；模拟体系采用最小下降能量最优化(Steepest Descent)发进行1000步优化。然后，在温度(V-rescale)400K与压力(Parrinello-Rahman)1.0Bar条件下进行500 ps溶剂最小化。最后，在没有约束条件下进行10 ns动力学模拟。所有模拟体系每隔1.0 ps收集一次数据。该命令格式为：
grompp -f em.mdp -c LipA_ion.pdb -p LipA.top -o LipA_em.tpr
mdrun -v -s LipA_em.tpr -o LipA_em.trr -c LipA_b4pr.pdb -e em.edr -g em.log
grompp -f pr.mdp -c LipA_b4pr.pdb -p LipA.top -o pr.tpr
mdrun -s pr.tpr -o pr.trr -c LipA_b4md.pdb -e pr.edr -g pr.log
grompp -f md.mdp -c LipA_b4md.pdb -p LipA.top -o md.tpr
mdrun -s md.tpr -o md.trr -c LipA_md.pdb -e md.edr -g md.log
经过分子动力学模拟发现，在400K温度下，分析LipA与突变体的RMSD（图4），证实Gly52Pro与Gly158Pro可能提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性。
实施实例4
本实施例说明构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株（Gly52Pro、Gly158Pro），并验证突变株的热稳定性，得到热稳定性提高后的枯草芽孢杆菌脂肪酶A的方法。
本发明人是通过枯草芽孢杆菌168菌株（Bacillus subtilis 168）的基因序列，GenBank登录号为AL009126.3。设计引物，通过PCR扩增得到脂肪酶A基因。所采用的实验方法包括聚合酶链式反应（PCR）技术；DNA的抽提、双酶切、链接等分子操作技术，以枯草芽孢杆菌168菌株基因为模版，扩增出脂肪酶A的基因序列，把这一段目的基因连接到表达质粒pET-22b上，然后导入大肠杆菌进行高效表达，从而获得该基因表达的目的蛋白，确定其基因的功能和酶学特性。具体步骤包括：
1.枯草芽孢杆菌168菌株的培养
枯草芽孢杆菌168菌株（Bacillus subtilis 168），从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，接种于LB培养基（g/L）：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl10，然后在37℃恒温摇床上振荡培养10h，离心收集菌体用于DNA的提取。
2.枯草芽孢杆菌168菌株脂肪酶A的克隆
通过NCBI已报道序列，设计以下PCR引物：
引物1：5’-CCGCATATGGCTGAACACAATC-3’
引物2：5’-CCCAAGCTTATTCGTATTCTGGC-3’。
上下游引物的5’端分别设计了NdeΙ和HindΙΙΙ酶切位点用于连接到表达载体pET22b，以枯草芽孢杆菌168菌株DNA为模版进行PCR扩增，PCR条件为; 94 ℃预变性2 min；94 ℃30秒，56 ℃30秒，72度2 min；35个循环后72℃延伸10 min。将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为629bp，与预期结果相符，然后将PCR产物纯化后连接到Takara的pMD20-T载体上进行测序分析。然后利用NdeΙ和HindΙΙΙ进行双酶切操作，再与同样利用NdeΙ和HindΙΙΙ进行双酶切的表达载体pET22b进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选验证得到表达重组质粒pET22b-LipA。
把表达重组质粒pET22b-LipA转化到大肠杆菌BL21（DE3）菌株的感受态细胞中，挑取转化子于含50 μL/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37 ℃摇床上培养约2 h，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度达到0.5 mmol/L，置于30 ℃摇床上继续培养6-8 h进行诱导表达。
发酵液离心收集菌体，用发酵液同等体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体，然后使用超声波破碎细胞，至菌液澄清后于12000 rpm/min条件下离心15 min收集上清，所收集的上清液即为枯草芽孢杆菌脂肪酶的粗酶液。
分子生物学构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A大肠杆菌工程菌BL21-pET22b-LipA。采用全质粒扩增的方式进行突变：
引物1：
S链：5’-CGCCATTTATAACAATCCACCGGT-3’
A链：5’-ACCGGTGGATTGTTATAACTTGGG-3’
引物2：
S链：5’-CGCCATGTTGGACACATCCCCCT-3’
A链：5’-GCTGTACAGAAGGGGGATGTCTTGGG-3’
引物上分别含有Gly52Pro和Gly158Pro，用primSTAR对全质粒进行扩增，PCR反应液：5*Prime STAR Buffer（Mg+ plus）10mL，dNTP Mixture（各2.5mM）4Μl，Prime2（10μM）1μL，模版DNA<200ng，Prime STAR HS，DNA Polymerase（2.5U/μL）0.5Μl，灭菌蒸馏水补充至50μL。
突变质粒分别转入DH5α，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，转接LB液体培养基中过夜培养，提取质粒并转入BL21（DE3），涂布平板，构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变菌。
验证突变株的热稳定性，将原始菌突变菌转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，IPTG诱导产酶，离心收集细胞，破碎，上清液用Ni柱分离纯化。将原始菌与突变菌的发酵液在55 ℃下分别保存5、60、120 min后，测定残余酶活力。
测定蛋白含量：采用Bradford法，以牛血清蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线，分别测定原始菌与突变菌发酵液中蛋白含量。
测定酶活：采用p-NPP法测脂肪酶活力，分别设置空白对照，240 μL底物溶液，10 μL酶液40 ℃下反应10 min，波长405 nm下测定酶活。突变菌与原始菌酶液分别经过5、60、120 min保温处理后，突变菌（LipAG52P、 LipAG158P）相对残余酶活是原始菌（LipA）的倍数数据如表1。
[0033] 表1 突变菌相对残余酶活是原始菌（LipA）的倍数
| Time/min | 5 | 60 | 120 |
| Fold（LipAG52P/LipA） | 2.71 | 2.72 | 2.99 |
| Fold（LipAG158P/LipA） | 1.76 | 1.78 | 2.32 |
Claims (6)
1.一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性的方法，其特征在于包括如下步骤：
1) 获取枯草芽孢杆菌脂肪酶A晶体结构，通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较高的Loop区域；
2) 结合脯氨酸理论效应分析确定位于柔性较高Loop区域的甘氨酸残基；
3) 基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子动力学模拟技术解析将相关甘氨酸位点置换为脯氨酸后对枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构稳定性的影响；
4) 构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体并验证其热稳定性，获得热稳定性得到提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1）所述的获取枯草芽孢杆菌脂肪酶A晶体结构并通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较高的Loop区域的方法具体为：通过检索蛋白数据库RCSB数据库得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A的晶体结构，使用软件Pymol0.9分析枯草芽孢杆菌脂肪酶A的三维结构，利用分子动力学方法，得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A的Rmsf值，从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶A柔性较大的区域。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2）所述的结合脯氨酸理论效应分析确定位于柔性较高Loop区域的甘氨酸残基的方法是：根据步骤1）得到的枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSF图，利用Pymol可视化软件，结合脯氨酸效应理论,确定位于柔性较高Loop区域的Gly残基作为突变位点突变为Pro，分别为Gly153Pro、Gly155Pro、Gly158Pro、Gly111Pro、Gly116Pro、Gly46Pro、Gly52Pro。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）所述的采用分子模拟技术解析将相关甘氨酸位点置换为脯氨酸后对枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构稳定性的影响的方法：通过分析均方根偏差RMSD与均方根涨落RMSF参数，来分析引入的Pro突变位点对枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的贡献，确定得到提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的重要氨基酸位点是Gly52Pro和Gly158Pro。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于分子动力学模拟技术具体为：所有动力学模拟均采用GROMACS4.5.4进行，体系在中性条件下，溶剂模型SPC，力场为GROMOS9653a6，温度为400K，相应地抗衡离子中和体系电荷；体系首先采用最速下降法能量最小化（Steepest Descent）进行优化；然后固定蛋白，采用压力Parrinello-Rahman，与温度V-rescale进行500 ps约束优化；最后进行分子动力学模拟，放松蛋白，时间步长为2 fs，模拟时间为10 ns；体系每隔1 ps收集一次数据。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）所述的分子生物学构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株的方法是采用全质粒扩增的方式进行突变：首先，设计分别含有Gly52Pro和Gly158Pro的引物，用primSTAR对全质粒进行扩增，突变质粒分别转入DH5α，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，再转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养；提取质粒，并转入BL21（DE3），涂布平板，构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变菌BL21-pET22b-LipA。
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