CN104726360A - 一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用 - Google Patents

一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明名称为一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用。本发明涉及基因工程技术领域，目的在于构建一种大肠杆菌与乳酸杆菌之间的穿梭载体，该载体被命名为pZLT3，其包含有如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明的载体的突出优点在于：首次利用植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL(保藏号为：CGMCC No.6936)菌株中天然质粒pZL3为骨架，其包含有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。构建适用于大肠杆菌和乳酸杆菌的穿梭载体，这种载体在大肠杆菌和乳酸杆菌中都具有稳定遗传的特点。同时，由于乳酸菌天然质粒pZL3中包含乳酸菌细菌素蛋白表达的编码基因及全部调控基因，构建的穿梭载体可以直接用于在乳酸杆菌中表达乳酸菌细菌素蛋白。

Description

一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌与乳酸杆菌之间的穿梭载体制备方法及应用穿梭载体表达乳酸菌素，本发明的穿梭载体可用于在乳酸杆菌中进行蛋白的表达应用。
背景技术
食品在加工、贮藏、运输等过程中，易受到有害微生物的污染而导致腐败变质或食物中毒的发生，采用添加防腐剂来抑制微生物的生长，是防止食品腐败变质的重要手段。研究表明，一些化学防腐剂有致癌性、致畸性和引起食物中毒现象发生，对人体健康影响较大，它的应用越来越受到众多国家的限制。而生物防腐剂是近年来发现的一类新型的天然防腐剂，具有无毒、安全、性能稳定、适用性广等优点。
乳酸菌素是某些乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌生物活性的肽或前体，对革兰氏阳性菌具有较好的选择性抑制生长能力，而且对热及酸碱稳定性较好，可被人体蛋白酶降解等特点，因此乳酸菌素是天然安全的生物防腐剂。自1969年英国食品防腐剂委员会和世界卫生组织联合食品添加剂专家委员会确认Nisin(乳酸链球菌素)为食品防腐剂以来，Nisin作为第一个应用于食品中的乳酸菌素，以其生产基因稳定、抑菌范围较广、食用安全而陆续被许多国家所接受。
在众多的乳酸菌素中，II a类乳酸菌素因其良好的稳定性和高效的抑菌活性引起了人们的关注。研究表明，而II a类乳酸菌素大多属于质粒编码，质粒的拷贝数及稳定性决定了乳酸菌素的产量。因此，筛选高拷贝，稳定性好的乳酸菌天然质粒是提高乳酸菌产量的关键。
本发明的目的利用从植物乳杆菌中分离得到的内源性质粒pZL3为骨架，以来源于原核表达载体pET30a(+)的大肠杆菌复制子ori和卡那霉素抗性表达盒kan，构建一种能够在大肠杆菌和乳酸杆菌中进行稳定遗传的穿梭载体。并且，利用制备的穿梭载体在干酪乳酸菌中表达乳酸菌素。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株具有抗单核细胞增生李斯特菌活性，含有天然质粒的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL。
本发明所提供的植物乳杆菌植物亚种是：植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL，已于2012年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.6936。保藏地址：北京市朝阳区大屯路 中国科学院微生物研究所。 
上述具有抗单增李斯特菌活性，含天然质粒的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL属于本发明保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用方法。
申请人构建得到一种大肠杆菌与乳酸杆菌穿梭载体pZLT3，它是通过如下步骤获得的：
(1)以保藏号为CGMCC No.6936的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL中的内源性天然质粒pZL3为骨架，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1(已经提交Genebank：KJ767737)。采用限制性内切酶KpnI和NcoI进行双酶切后，回收酶切后的质粒大片段。
(2)以载体pET30a(+)为模板，进行一次PCR扩增，得到含有质粒复制起始点的DNA片段ori和卡那霉素抗性基因表达盒kan，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2。采用限制性内切酶KpnI和NcoI将PCR产物进行双酶切后，回收酶切后的PCR产物。
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的片段采用T4DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定，得到穿梭载体pZLT3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
应用构建的大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3转化干酪乳杆菌KL1，表达乳酸菌细菌素，方法如下：
(1)挑取新鲜培养的干酪乳杆菌KL1单菌落，接种于5mL MRS液体养基中， 37℃静止培养12h。
(2)按1∶20的比例接种到MRS培养液中，37℃继续培养至OD600为0.6左右；将培养液转移到预冷的500mL离心管中，冰上放置10min；4℃5,000r/m离心5min，用50mL冰冷的EPWB缓冲液(6mmol/L NaH2PO4(pH8.0)，1mmol/L MgCl2)洗涤3次；用50mL冰冷的EPB溶液(6mmol/L NaH2PO4(pH8.0)，1mmol/L MgCl2，0.2mol/L蔗糖)洗涤一次，用适量冰冷的EPB缓冲液悬浮，分装每管350μl待用。
(3)电转化：将20μl提取的重组质粒pZLT3与350μl干酪乳杆菌KL1感受态细胞轻柔混合，冰浴10min。将感受态细胞和连接产物的混合物转入预冷的2mm电转化杯中，2000V电击一次，之后迅速加入500μ1冰预冷的MRS液体培养基，37℃静止培养2h。
(4)取200μl菌液涂布于含有20μg/mL卡那霉素的MRS琼脂培养基上，37℃培养24h。
(5)挑取重组载体pZLT3阳性的转化干酪乳杆菌KL1-pZLT3，接种于10mL含有20μg/mL卡那霉素的MRS液体培养基中，37℃培养过夜，乳酸菌素表达分析。
上述的大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用方法属本发明保护范围。
更详细的技术方案及其应用参见《具体实施方式》。
本发明的积极效果是：
1.使用成熟的大肠杆菌ori家族复制子作为穿梭载体的元件之一，使得在大肠杆菌中提取该穿梭载体时一次可获得较大量的质粒DNA，方便后续的DNA操作。
2.将来源于植物乳杆菌的质粒复制子与大肠杆菌中的质粒复制子相结合，相比单独使用广宿主范围的复制子，获得的穿梭载体在乳酸杆菌不同菌株的可用范围会更广泛。
3.由于乳酸菌素的编码基因存在于天然质粒pZL3中，自身带有完整的表达元件，包括乳酸菌素编码基因，免疫蛋白编码基因、转运蛋白编码基因等。 因此，可以更好的在乳酸菌中表达乳酸菌素蛋白。
序列表SEQ ID NO：1是植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒pZL3的完整核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：2是以pET30a(+)为模板，PCR扩增得到的含有质粒复制起始点的DNA片段ori和卡那霉素抗性基因表达盒kan的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：3是构建的大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3的核苷酸序列。
附图说明
图1为pZL3载体图谱
图2为大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pZLT3构建示意图
图3为应用穿梭载体pZLT3在干酪乳杆菌KL1中表达乳酸菌素
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒的提取与鉴定
1、植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒的提取
挑取植物乳杆菌Zhang-LL单菌落，接种于5mL的MRS培养基中，37℃培养16h。将菌液5,000rpm离心5min，弃去上清液，将菌体重悬于250μl缓冲液I(20mg/mL溶菌酶，50mM葡萄糖，25mM Tris-Cl，10mM EDTA，pH 8.0)中，37℃放置1h，加入250μl缓冲液II(0.2N NaOH，1％SDS)中，混匀，室温放置5min，加入350μl缓冲III(3M醋酸钾，2M醋酸)，混匀，室温放置10min。12,000rpm离心10min，吸取700μl上清液至一新的离心管中，加入700μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液，剧烈震荡混匀。12,000rpm离心10min，吸取700μl上清液至一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30min。12,000rpm离心10min，弃上清溶液，加入500μl乙醇溶液(70％)，混匀。12,000rpm离心10min，弃上清，将离心管室温放置10min至乙醇充分挥发，加入50μl去离子水溶解质粒，-20℃储存待用。
2、植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒pZL3序列分析
提取得到的植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，切胶回收大小约为13kb的质粒pZL3。回收得到的质粒pZL3使用限制性内切酶KpnI(NEB)进行单酶切，得到酶切的质粒。将酶切后的质粒pZL3与同样经过KpnI(NEB)酶切的载体pET30a(+)使用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素(100μg/ml)抗性筛选阳性转化子，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定，确认重组质粒后进行测序分析(上海生工)。序列分析结果如序列表SEQ ID NO：1，并已提交Genebank(KJ767737)；绘制载体图谱如附图1所示。
实施例2、大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3的构建
穿梭载体pZLT3构建过程如附图2所示：
1、pZL3质粒的双酶切
质粒pZL3使用KpnI(NEB公司)和NcoI(NEB公司)进行双酶切反应，体系如下：
10*Buffer 2μl
KpnI 1μl
NcoI 1μl
pZL3质粒 5μl
去离子水 11μl
37℃反应1h，65℃反应5min终止反应。
2、大肠杆菌复制子的PCR扩增
以原核表达载体pET30a(+)为模板，扩增大肠杆菌复制子及卡那霉素抗性盒，上游引物序列：5‘AGGTACCCCCAGTCAC 3’，下游引物序列：5‘CCATGGCGCTCATGAATTAATT 3’，反应条件如下：
10*Buffer 2.5μl
上游引物(10μM) 1μl
下游引物(10μM) 1μl
dNTP(10mM) 1μl
pET30a(+) 0.5μl
ExTaq(TaKaRa) 1μl
去离子水 18μl
反应参数，95℃5min，然后进行下列循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物经上海生工生物工程有限公司测序，结果如序列表SEQ ID NO：2。
3、大肠杆菌复制子PCR产物的双酶切 
PCR产物使用KpnI(NEB公司)和NcoI(NEB公司)进行双酶切反应，体系如下：
10*Buffer 2μl
KpnI 1μl
NcoI 1μl
PCR产物 5μl
去离子水 11μl
37℃反应1h，65℃反应5min终止反应。
4、大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3的构建
将步骤1得到的酶切载体和步骤3得到的酶切PCR产物进行连接，体系如下：
10*T4DNA连接酶Buffer 1μl
pZL3酶切产物 3μl
PCR酶切产物 3μl
T4DNA连接酶(Promega) 1μl
去离子水 2μl
16℃连接2h，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/ml卡那霉素的LB平板筛选阳性转化。挑取阳性转化菌落，接种与LB液体培养基(100μg/ml卡那霉素)，碱裂解法提取质粒，获得大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭载体pZLT3，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3。
实施例3、大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3表达乳酸菌素的应用
1、大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭载体pZLT3转化干酪乳杆菌KL1
将构建得到的大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭载体pZLT3转化干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1(CGMCC No.1809)，方法步骤如下：
(1)挑取新鲜培养的干酪乳杆菌KL1单菌落，接种于5mL MRS液体养基中，37℃静止培养12h。
(2)按1∶20的比例接种到MRS培养液中，37℃继续培养至OD600为0.6左右；将培养液转移到预冷的500mL离心管中，冰上放置10min；4℃5,000r/m离心5min，用50mL冰冷的EPWB缓冲液(6mmol/L NaH2PO4(pH8.0)，1mmol/LMgCl2)洗涤3次；用50mL冰冷的EPB溶液(6mmol/L NaH2PO4(pH8.0)，1mmol/LMgCl2，0.2mol/L蔗糖)洗涤一次，用适量冰冷的EPB缓冲液悬浮，分装每管350μl待用。
(3)电转化：将20μl提取的重组质粒pZLT3与350μl干酪乳杆菌KL1感受态细胞轻柔混合，冰浴10min。将感受态细胞和连接产物的混合物转入预冷的2mm电转化杯中，2000V电击一次，之后迅速加入500μl冰预冷的MRS液体培养基，37℃静止培养2h。
(4)取200μl菌液涂布于含有20μg/mL卡那霉素的MRS琼脂培养基上，37℃培养24h。
2、乳酸菌素的表达分析
挑取重组载体pZLT3阳性的转化干酪乳杆菌KL1-pZLT3，接种于10mL含有20μg/mL卡那霉素的MRS液体培养基中，37℃培养过夜。以干酪乳杆菌KL1为阴性对照，进行如下的乳酸菌素抑菌活性分析：
(1)以单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)为指示菌，挑取指示菌单菌落于TSBYE培养基，37℃培养12h。
(2)指示菌菌株稀释至107cfu/mL，与加热融化的TSBYE固体培养基混匀后，倾注约15mL于平皿中，待其凝固后，轻轻放上已灭菌的牛津杯，取100μL乳酸菌菌株发酵上清液加入牛津杯中。于4℃冰箱扩散4h后，置于37℃温箱中培养12h，观察抑菌圈的出现，结果见附图3。
由图3可知，干酪乳杆菌KL1-pZLT3能够成功表达乳酸菌素，对指示菌单 核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)具有明显的抑菌作用，而对照的野生型干酪乳杆菌KL1则不产生乳酸菌素。说明构建的大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体pZLT3能够在干酪乳杆菌KL1中成功地表达乳酸菌素。
本专利所属项目1：科技部国家科技重大专项“抗病转基因羊新品种培育”子课题“抗病转基因羊扩繁体系的建立/抗病转基因羊抗病、生产性能及安全评价”
项目编号：2013ZX08008-005
项目起止时间：2013.01-2013.12
项目负责人：刘慧
本专利所属项目2：“十二五”农村领域国家科技计划课题“动物源食品HACCP体系建设及致病菌高通量检测技术”
项目编号：2012BAD28B02-01
项目起止时间：2012年1月1日-2015年12月31日
项目负责人：孔保华 。

Claims (2)

1.植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL CGMCC No.6936。
2.一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3的构建及应用方法，其特征在于：(1)以保藏号为CGMCC No.6936的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)Zhang-LL中的内源性天然质粒pZL3为骨架，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1；采用限制性内切酶KpnI和NcoI进行双酶切后，回收酶切后的质粒大片段；(2)以载体pET30a(+)为模板，进行一次PCR扩增，得到含有质粒复制起始点ori的DNA片段和卡那霉素抗性基因表达盒kan，其PCR扩增得到的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2；采用限制性内切酶KpnI和NcoI将PCR产物进行双酶切后，回收酶切后的PCR产物；(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的片段采用T4DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定，得到穿梭载体pZLT3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；(4)构建的大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3转化干酪乳杆菌KL1，表达乳酸菌细菌素蛋白。
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