CN102080079B - 新型抗菌肽Misgurin突变体的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型抗菌肽Misgurin突变体的制备方法与应用。技术方案是：在天然Misgurin的氨基酸序列的C未端引入谷氨酰胺，设计一种新型Misgurin突变体，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型Misgurin突变体全基因，构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA-M，载体电击法转化宿主细胞SMD1168，筛选获得高效表达菌株，在合适的培养条件下，每毫升表达上清中含重组新型Misgurin突变体达100微克。所得产品对金黄色葡萄球菌、猪沙门氏菌和猪致病性大肠杆菌K88、K99、987P均具有较好的抑杀活性，对临床细菌性疾病的防治具有显著的效果。

Description

新型抗菌肽Misgurin突变体的制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术高科技研究领域，涉及一种新型抗菌肽Misgurin突变体，更具体地是关于重组新型抗菌肽Misgurin突变体的制备方法及其在控制和防治细菌性疾病中的应用。

背景技术

抗菌肽(antibacterial peptides，ABP)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离子小肽，是生物先天免疫的重要组成成分。抗菌肽的作用机制与传统抗生素不同，是最具开发前景的抗生素替代品。与传统的抗生素相比，抗菌肽具有独特的抑杀菌机制，不易使菌体产生耐药性突变。抗菌肽还可针对性的抑制真菌、病毒、寄生虫和肿瘤，生物活性比传统抗生素更为广泛。

Misgurin是一种高效广谱的强碱性抗菌多肽，其抗菌能力是magainin II的6～12倍，而没有明显的溶血活性，成为最具开发和应用潜力的抗菌肽之一(Park C B，Lee J H，Park I Y，Kim M S and Kim S C.A novel antimicrobial peptide from the loach Misgurnus anguillicaudatus.FEBS Lett，1997，411：173-178.)。1997年Park C B等首次采用匀浆、离心、C18反相色谱、肝素琼脂亲和色谱、C18反相色谱五步法从泥鳅中分离纯化到抗菌肽Misgurin，1克泥鳅中仅分离纯化到0.1微克抗菌肽Misgurin。可见，从泥鳅中提取抗菌肽Misgurin，工序繁琐、成本高、得率低。另一方面，固相合成价格相当昂贵，不适合我国国情，难以应用于实际临床。随着基因工程技术的发展，采用人工合成的方法来获得目的基因，再通过基因工程方法进行微生物发酵生产抗菌肽更具实际意义。2002年龚杰万等将Misgurin基因多拷贝同向串连，并将其克隆于表达质粒pPIC9K中，电转化至毕赤酵母菌株GS115，筛选出整合有多拷贝外源基因的重组子，但在论文中没有提到重组蛋白的抗菌活性(龚杰万.mae和misgurin两种基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达.暨南大学，博士学位论文，2002.48-57.)。目前尚未有成功利用基因工程技术手段生产出有活性的抗菌肽Misgurin的报道，也无商品化新型抗菌肽Misgurin突变体的报道。由于抗菌肽Misgurin市场前景非常广阔，用量较大，因此为提高生产效率，降低成本，获得具有活性的重组抗菌肽Misgurin，已成为将抗菌肽Misgurin转化为生产力迫切需要要解决的首要问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题与不足，获得具有抗菌活性的重组抗菌肽Misgurin及其制备方法。本发明对Misgurin进行了突变改造，获得的Misgurin突变体具有明显的抗菌活性。本发明还设计了可在酵母宿主细胞中高效分泌表达的新型抗菌肽Misgurin突变体基因，提供一种用酵母细胞表达新型Misgurin突变体的制备方法，以简化生产步骤，提高效率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

Misgurin属天蚕素族抗菌肽，天蚕素族抗菌肽的一级结构存在很多相似之处。它们的N端富含亲水性的氨基酸残基，特别是碱性氨基酸如Arg(精氨酸)和Lys(赖氨酸)；而C端则含有较多的疏水性氨基酸残基，其末端都酰胺化，C末端酰胺化对抗菌肽的活性至关重要(肖业臣，温硕洋，黄亚东，杨婉莹，曹阳.昆虫抗菌肽和抗真菌肽结构与功能的关系及分子设计.昆虫学报.2004，47(5)：659-669.窦非，谢维，董雪吟，徐贤秀.抗菌肽CMIV末端结构对其活性的影响.中国科学(C辑)，2000，30(1)：59-64.)。为了获得具有更高活性的抗菌肽Misgurin，本发明在参考文献报道的天然抗菌肽Misgurin的氨基酸序列的基础上，设计了含谷氨酰胺的新型抗菌肽Misgurin突变体。

根据宿主细胞毕赤酵母偏好的密码子，采用全人工合成的方法获得一种Misgurin突变体全基因。

通过基因工程的方法，以上述设计合成的Misgurin突变体DNA序列，构建重组毕赤酵母分泌型表达载体，载体电击法转化宿主细胞，筛选获得高效表达重组酵母菌株。在合适的培养条件下，特别是将诱导培养基的初始pH值调整为3.0～5.0，经甲醇诱导表达获得具有较高抗菌活性的重组Misgurin突变体。每毫升表达上清中，重组Misgurin突变体的表达量达100微克，相当于1000克泥鳅中提取的抗菌肽Misgurin。产物表达水平、抗菌活性，以及对细菌性疾病的临床防治研究均表明，本发明所述方法在重组Misgurin突变体的基因工程生产上取得了突破性的进展，为Misgurin突变体的大规模生产、临床应用和深入研究提供了充足的物质来源。

上述重组酵母菌株，为被重组毕赤酵母分泌型载体转化的毕赤酵母菌pPICZαA-M/SMD1168株，重组毕赤酵母分泌型载体，为含有新型抗菌肽Misgurin突变体成熟肽基因的酵母表达载体pPICZαA-M。

本发明制备新型抗菌肽Misgurin突变体的方法，与现有的从组织中提取抗菌肽Misgurin相比，具有如下优点：

A本发明所述的新型抗菌肽Misgurin突变体是在天然抗菌肽Misgurin的羟基端增加了一个谷氨酰胺，提高了其抗菌活性。

B本发明人工设计合成的Misgurin突变体基因选用毕赤酵母偏爱密码子，有利于密码子在毕赤酵母中的识别和表达，从而可达到高效表达的目的。

C本发明提供的Misgurin突变体重组细胞诱导培养基的初始pH值为3.0～5.0，实现了Misgurin突变体在毕赤酵母中的高效表达，且表达产物分泌在细胞外，简化了分离纯化步骤，提高了重组基因产物的生产效率。

D本发明制备的Misgurin突变体具有较好的抗菌活性，制备方法简单：诱导培养后即可获得具有抗菌活性的Misgurin突变体，而且适合大规模培养。

E本发明制备的Misgurin突变体具有广谱抗菌活性：对金黄色葡萄球菌、猪沙门氏菌等革兰氏阳性菌和猪致病性大肠杆菌K88、K99、987P等革兰氏阴性菌均具有良好的抗菌作用，对控制和防治细菌性疾病将发挥重要的作用。

F本发明制备的Misgurin突变体抗菌作用强：对金黄色葡萄球菌、猪沙门氏菌、猪致病性大肠杆菌K88、K99、987P的最小抑菌浓度分别为1.56、6.25、6.25、6.25、6.25μg/mL，显示出较强的抗菌作用。

G本发明制备的新型抗菌肽Misgurin突变体临床使用效果好：临床试验表明，Misgurin突变体作为预防应用，可明显提高雏鸡保护率，其中中高剂量组可达到100％保护，和卡那霉素对照组效果相当，但雏鸡平均体重高于卡那霉素对照组。

附图说明

图1为分泌型表达载体pPICZαA-M的构建示意图。

图2为分泌型表达载体pPICZαA-M的鉴定电泳图，图中1～4为所挑选的4个质粒DNA作模板，以Misgurin突变体特异性引物M1和M2进行PCR扩增的PCR产物。M为DL2000 DNAMarker(宝生物工程(大连)有限公司)。电泳分析结果显示，所扩增出的DNA片段大小为93bp左右，表明Misgurin突变体基因已经成功的连接到转移载体上，测序结果也表明目的片断已正确插入穿梭载体中。含有Misgurin突变体基因的分泌型表达载体pPICZαA-M构建成功。

图3为转化子的PCR鉴定电泳图，图中1为SMD1168对照。2为pPICZαA-M/SMD1168M。3为阴性对照，M为DL2000 DNA Marker(宝生物工程(大连)有限公司)。电泳分析结果显示，以重组菌pPICZαA-M/SMD1168的基因组作模板时，能扩增出257bp左右DNA片段，这是因为在构建pPICZαA-M时，双酶切除去87bp后又插入81bp的Misgurin突变体基因片段，表明Misgurin突变体基因已经成功的整合到宿主菌SMD1168的基因组上。

图4为表达的Misgurin突变体对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。图中M是Misgurin突变体。P是空载体转化子阴性对照。Amp⁺(Amp)和S(Streptomycin)为阳性对照。

具体实施方式

1.设计含有谷氨酰胺的Misgurin突变体，并人工合成Misgurin突变体基因

本发明人经过深入而广泛的研究，在参照GenBank中misgurin(Gene Bank P81474)的氨基酸序列的基础上，设计成了含有谷氨酞胺的Misgurin突变体，以增强其抗菌活性。同时选用酵母偏爱密码子设计Misgurin突变体基因，并在其N端加上α信号肽Kex2裂解位点，以保证所分泌表达的抗菌肽具有天然N端，同时两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入载体pPICZα-A中。

2.构建分泌型的酵母表达载体(如图1所示)

将经XhoI和XbaI酶切的含有Misgurin突变体基因的回收产物与经同样酶切回收的表达载体pPICZαA按一定的比例混匀，连接，转化，筛选，获得含有Misgurin突变体基因的重组克隆，扩增后提取质粒，以Misgurin突变体特异性引物M1和M2进行PCR鉴定(如图2所示)，鉴定正确的阳性质粒pPICZαA-M送大连Takara公司测序。

3.筛选获得高表达抗菌肽Misgurin突变体酵母工程菌株

(1)PICZαA-M质粒的线性化与回收

大量提取pPICZαA-M质粒，用SacI单酶切使其线性化，反应体系为：

ddH₂O                 160μL

10×Buffer            20μL

pPICZαA-M质粒        15μL

SacI                  5μL

总体积200μL，充分混匀后37℃温浴2h，然后取2μL酶切产物在1％琼脂糖上电泳，观察是否完全线性化。向上述线形化pPICZαA-M质粒中补加240μL水后加入等体积的酚、酚:氯仿、氯仿各抽提一次。每次均以12000r/min离心5min，后取上清加入1/10体积3M pH5.2NaAC和2.5倍体积的预冻无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，12000r/min离心5min，用80％乙醇洗涤2次，在超净台中吹干，用灭菌双蒸水溶解后稀释为终浓度为2μg/μL，-20℃保存。

(2)酵母感受态细胞的制备

无菌操作，用接种环迅速蘸取冻存的巴斯德毕赤酵母菌SMD1168少许，划线接种于不含Zeocin的固体YPD平板上，倒置于温箱中，30℃培养。

待平板上长出单个菌落，挑取形态均一的单个菌落，接种于含5mL液体YPD的50mL锥形瓶中，30℃，200r/min振摇培养过夜。

取0.5mL振摇培养过夜的菌液接种于含50mL液体YPD的200mL锥形瓶中，30℃振摇培养过夜。

取菌液于50mL离心管中，2500r/min离心4℃5min后收集细胞。

用50mL预冷灭菌的双蒸水轻轻吹打开细胞，1500r/min 4℃离心5min后收集细胞。

用25mL灭菌冰冷双蒸水轻轻重悬细胞，1500r/min 4℃离心5min后收集细胞。

再用10mL灭菌冰冷1M D-山梨糖醇轻轻重悬细胞，1500r/min 4℃离心5min后收集细胞。

用灭菌冰冷1M D-山梨糖醇轻轻重悬细胞，并使细胞终浓度OD600＝1.0，即得感受态细胞。

(3)酵母菌株的电转化与筛选

取5μL约10μg经SacI单酶切线性化的表达质粒pPICZαA-M加入80μL感受态细胞悬液中。充分混匀后加入到预冷的0.2cm的石英电转杯中，将该石英电转杯放于冰上5min。

擦干石英电转杯外壁上的水分，放入BioRad GenePulse电转化仪的槽中以1.5kV，20μF，200Ω的条件电击，结束后，立即加入1mL 1mol/L冰浴的D-山梨醇，混匀。

将杯中的内含物转移到5mL灭菌离心管中，30℃温箱中静置1.5h。

取0.1mL转化物均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS(1％yeast extraet，2％peptone，2％dextrose，1mol/L，sorbitol，2％agar)选择平板上，30℃孵育3～5天。

待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL，500μg/mL，1000ug/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为高拷贝重组菌株。

另外，将pPICZαA载体酶切线性化后，同样电转化制备空载体重组菌株pPICZαA/SMD1168，作为后续工作的对照。

4.重组菌的PGR鉴定

酵母基因组DNA的提取

挑取10～20个单菌落于2mLYPD液体培养基中，30℃、250r/min振荡培养。

将1.5mL过夜培养液转到1.5mL Eppendorf管中，12000rpm室温离心1min，弃上清。

细胞重悬于50μL STES缓冲液中，向酵母悬液中加入50μL酸洗过的玻璃珠。每管加入20μLTE(pH 7.6)，然后加入60μL苯酚∶氯仿(25∶24)，盖紧盖子。

先振荡1min，使有机相和水相充分混合，然后每振荡30s就将Eppendorf管插在冰上，重复振荡6次。

12000rpm，室温离心8min，将上层的水相转移到一个新的1.5mL的Eppendorf管中。

依次加入1/10体积的3mol/L的NaAc(pH 5.2)、2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20min。12000rpm 4℃离心10min，去上清，沉淀用75％的乙醇洗涤1次。12000rpm 4℃离心2min，去上清，空气干燥沉淀后，将沉淀溶解于40μL TE Buffer(pH 7.6)，该溶液即为基因组样品。取5μL样品作琼脂糖电泳检测。使用前将基因组样品在沸水中煮5min，然后立即插在冰上或-20℃冻存备用。

以上述提取的酵母基因组DNA为模板，用Misgurin突变体特异性引物M1和3’AOX1通用引物进行PCR扩增鉴定，扩增体系如下：

混匀，瞬间离心。98℃预变性2min，98℃预变性1min，进入PCR循环：98℃15s，55℃20s，72℃1.5min，共30个。最后72℃延伸4min，取PCR产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并记录拍照。因为在构建pPICZαA-M时，双酶切除去87bp后又插入81bp的Misgurin突变体基因片段，理论上阳性重组子能扩增出特异的257bp DNA片段。而以宿主菌SMD1168和对照重组菌pPICZαA/SMD1168基因组作模板均不能扩增出DNA片段，鉴定结果显示阳性重组子pPICZαA-M/SMD1168基因组作模板扩增出257bp左右DNA片段(如图3所示)，表明Misgurin突变体基因已经成功的整合到宿主菌SMD1168的基因组上。

5.毕赤酵母阳性转化子诱导表达抗菌肽Misgurin突变体

将筛选到的阳性重组子单菌落接种(于含50μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃、200rpm振摇培养18个小时。取此菌液按2％体积比转接于含BMGY培养基的250mL锥形瓶中，瓶口用三层灭菌医用纱布封口，以保证足够的通氧量，28℃200rpm摇振培养18～24h左右。4℃4000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀。沉淀菌体用pH值为3.0～5.0的BMMY培养基重悬，28℃200rpm继续培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100％甲醇使终浓度达1％。于0，24h，48h，72h，96h和120h取样一次，4℃12000rpm离心10min，收集上清，按常规方法进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，并以金黄色葡萄球菌Cowanl为试验菌株，用标准琼脂孔穴扩散法测定其抗菌活性，筛选表达量高的重组子进行大规模诱导培养。

6.毕赤酵母表达的重组Misgurin突变体的最小抑菌浓度(MIC)测定

用液体生长抑制法测定重组Misgurin突变体对金黄色葡萄球菌、猪沙门氏菌、猪致病性大肠杆菌K88、K99、987P的MIC，将能完全抑制菌体生长的最低蛋白浓度确定为MIC。将活化培养的菌液用LB培养基稀释至10⁶CFU/mL，分别取50μL加到96孔培养板上，然后分别加入稀释的新型抗菌肽Misgurin(浓度分别为100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.12μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL，0.39μg/mL，0.20μg/mL)的溶液50μL，37℃孵育24h后用自动酶标仪测定OD600确定结果。重组Misgurin突变体对金黄色葡萄球菌、猪沙门氏菌、猪致病性大肠杆菌K88、K99、987P的最小抑菌浓度分别为1.56、6.25、6.25、6.25、6.25μg/ml。

7.毕赤酵母表达的重组Misgurin突变体对致病性大肠杆菌感染雏鸡的防治效果

试验以AA肉仔鸡为对象，随机平均分为高、中、低剂量试验组、卡那霉素对照组、感染对照组和生理盐水对照组6组，每组10羽，分别于21日龄攻毒致病性大肠杆菌5×108个菌/羽，于攻毒同时口服相应剂量重组抗菌肽，连用3d，定期观察鸡生长性能、精神状态，统计死亡率、保护率。试验结果表明，重组Misgurin突变体作为预防应用，可明显提高雏鸡保护率，其中中高剂量组可达到100％保护，和卡那霉素对照组效果相当，但雏鸡平均体重高于卡那霉素对照组，而感染对照组的死亡率达80％。本试验针对自主研发的新型抗菌肽Misgurin突变体进行了初步的动物学保护试验，取得了较满意的结果，为下一步的大规模临床试验和应用提供了依据。

SEQUENCE LISTING

<110>上海市农业科学院畜牧兽医研究所

<120>新型抗菌肽Misgurin突变体的制备方法与应用

<130>说明书

<160>2

<170>Patentln version 3.3

<210>1

<211>93

<212>DNA

<213>人工设计

<220>

<221>CDS

<222>(16)..(84)

<220>

<221>mutation

<222>(79)..(81)

<400>1

gctctcgaga aaaga aga caa aga gtt gag gag ttg tcc aag ttc tcc aag    51

                 Arg Gln Arg Val Glu Glu Leu Ser Lys Phe Ser Lys

                 1               5                   10

aag ggt gct gct gct aga aga aga aag caa tga tctagaagt               93

Lys Gly Ala Ala Ala Arg Arg Arg Lys Gln

        15                  20

<210>2

<211>22

<212>PRT

<213>人工设计

<400>2

Arg Gln Arg Val Glu Glu Leu Ser Lys Phe Ser Lys Lys Gly Ala Ala

1               5                   10                  15

Ala Arg Arg Arg Lys Gln

            20

Claims (7)

1.一种抗菌肽Misgurin突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述抗菌肽Misgurin突变体的制备方法，步骤如下：

(1)设计抗菌肽Misgurin突变体，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成Misgurin突变体全基因；

(2)将人工合成的Misgurin突变体基因克隆入酵母表达载体pPICZαA中，构建分泌型表达载体pPICZαA-M，电转化到宿主细胞中；

(3)筛选整合有Misgurin突变体基因的重组细胞；

(4)重组细胞的诱导表达与生物活性测定。

3.根据权利要求2所述抗菌肽Misgurin突变体的制备方法，其特征在于通过在天然Misgurin的羧基端引入谷氨酰胺的方法增加抗菌肽的酰胺化程度，获得高效的Misgurin突变体。

4.根据权利要求2所述抗菌肽Misgurin突变体的制备方法，其特征在于该Misgurin突变体DNA分子与来源于泥鳅的天然抗菌肽Misgurin DNA分子相比，全部突变替换为毕赤酵母偏爱的密码子，并且在3’端增加了CAA末端。

5.根据权利要求2所述抗菌肽Misgurin突变体的制备方法，其特征在于所构建的重组载体为含有Misgurin突变体成熟肽基因的酵母表达载体pPICZαA-M。

6.根据权利要求2所述抗菌肽Misgurin突变体的制备方法，其特征在于其中所使用的宿主细胞为毕赤酵母SMD1168株。

7.根据权利要求2所述抗菌肽Misgurin突变体的制备方法，其特征在于诱导培养基的初始pH值为3.0～5.0。 

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