CN103045636B - 在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽nz2114的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法，通过构建含有经过酵母偏爱密码子优化编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，并转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生抗菌肽NZ2114。本发明通过优化抗菌肽NZ2114基因序列，构建特异表达载体，首次实现了抗菌肽NZ2114在毕赤酵母中的高效表达，产量突破克级水平，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题，并建立完善的纯化体系，可实现规模化生产，可应用于抗菌药物开发，饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

Description

在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法。

背景技术

抗菌肽（AMP）是生物体内具有生物活性的小分子多肽，主要特点如下：抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，而且对真菌，原虫乃至病毒和肿瘤细胞都有杀伤或抑制作用(Brandenburg,Merres et al.2012)。由于其突出的生物学特性，最有潜力作为型新安全无害抗生素替代品，从而备受科学界关注(Eckert2011;Brandenburg,Merres等，2012)。

Plectasin是2005年由Mygid等人从来源于北欧松林地表腐生子囊菌（Pseudoplectania nigrella）中分离得到一种具有抗菌功能的抗菌肽，也是首例真菌防御素。Plectasin基因开放阅读框编码一个95个残基长的前体肽，由一个信号肽序列（残基1-23），一个前片断（残基23-55）和一个40个残基的C端区域的成熟多肽（残基56-95），与几种无脊椎动物防御素存在50-55%序列相似性。Plectasin成熟多肽由40个AA组成，含有6个Cys残基和5个lys残基，一个区别的四肽（DEDD）模式，分子量为4,398.80Da，净电荷在＋1到＋3之间变化，主要取决于它的两个组氨酸的离子状态。其6个Cys在分子内形成3对二硫键（Cys4-Cys30，Cys15-Cys37，Cys19-Cys39），二级结构由三对二硫键稳定的一个N端的α-螺旋和C端的两个反向平行的β-折叠结构以及螺旋和折叠结构之间的Loop区组成(Mygind,Fischer等，2005)。

NZ2114是新型的抗菌肽，属于真菌防御素Plectasin的突变体。D.Raventós等（2005）基于提高该真菌防御素对耐药金黄色葡萄球菌的抗菌活性，通过高通量突变筛选到一个对金黄色葡萄球菌具有强烈抑菌活性的突变体(Raventos,Taboureau等，2005)。Brinch（2010）等对NZ2114胞内和胞外杀菌活性做了综合研究，结果显示，NZ2114对MRSA、VRSA、MSSA具有较强的胞内和胞外杀菌活性，与达托霉素相当，而胞内杀菌活性甚至优于万古霉素(Brinch,Tulkens等，2010)。D.Andes等（2009）对14株金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA和耐青霉素的肺炎链球菌FRSP），结果显示NZ2114的MIC相对于本体防御素增加30倍之多（0.06μg/ml~2.0μg/ml）(Andes,Craig等，2009)，进而通过小鼠感染模型对其药物动力学进行相关研究，结果显示，皮下注射30min后小鼠血液中NZ2114浓度达到峰值，其药物半衰期为0.38到1.0h，同时对NZ2114的蛋白结合率进行了检测，结果表明NZ2114蛋白结合率为80%(Andes,Craig等，2009)。D.Andes等（2009）还对NZ2114抗生素后效应（PAE）参数进行研究，其对感染肺炎链球菌（S.pneumoniaestrain ATCC10813，MIC,0.06mg/ml)）小鼠注射单剂量为10、40和60mg/kg后其PAE分别为2.3、4.5、7.7h，而NZ2114对金黄色葡萄球菌（S.aureus strain ATCC25923，MIC，1.0mg/ml)的PAE分别为1.2、2.6、4.6h。而且相关研究表明，NZ2114以高于MIC单剂量处理的金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌在12~15h内停止用药，病原菌不会出现反弹。金黄色葡萄球菌是世界范围内流行的易感病原菌，容易引起人败血症，表皮及软组织感染，肺炎等疾病(Diekema,Pfaller等，2001)。随着人类抗生素大量频繁使用，加上金黄色葡萄球菌自身易获得耐药性，大量MRSA菌株不断在临床或社区发现，以致形成了两大类型：医院获得型MRSA（HA-MRSA）和社区感染型MRSA（CA-MRSA）(Rountree and Freeman1955;Chambers and DeLeo2009;Elston,Meigh等，2009;Skov and Jensen2009;Eckert2011)，对人类健康造成巨大威胁。研究开发新型杀灭金黄色葡萄球菌的抗生素替代品对于预防和治疗由金黄色葡萄球菌，特别是MRSA引起中疾病具有重要意义。

抗菌肽替代传统抗生素应用于由细菌感染所引起的各种疾病一直备受科学界关注，也是人类对抗各种病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌谱过宽，稳定性不好，具有细胞毒性，抗菌活性不足，用药多样性，生产成本高（基因克隆表达产量太低和化学合成成本过高）等一直是抗菌肽应用中面临的挑战(Eckert2011)。抗菌肽NZ2114具有抗菌谱窄，不具有细胞毒性，抗菌活性强等优点。目前，关于抗菌肽NZ2114相关研究中使用的NZ2114均为化学合成(Andes,Craig等，2009;Brinch,Tulkens等，2010;Xiong,Hady等，2011)，且未见有关其基因克隆表达方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种含有编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，包括诱导型启动子、位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码抗菌肽NZ2114的DNA序列，所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA。

已知抗菌肽NZ2114（菌丝霉素衍生物）的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

前述的表达载体，其中所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列是按照酵母所偏爱的密码子进行优化的序列，具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

前述的表达载体，出发载体优选为pPICZαA。

前述的表达载体，在编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列的5’端连接有XhoI酶切位点，且在XhoI酶切位点的5’端连接有保护碱基CCG；在编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端连接有XhaI酶切位点，且在XhaI酶切位点的3’端连接有保护碱基GC。

本发明还提供含有上述表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞优选为毕赤酵母，更优选为毕赤酵母X-33基因工程菌。

本发明还提供一种重组巴斯德毕赤酵母菌（Pichia pastoris）X-33/NZ2114，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2012年12月13日，保藏号CGMCC No.6987。

本发明还提供培养上述毕赤酵母X-33基因工程菌的方法，包括以下步骤：

1）种子液的制备：从YPD平板挑取酵母转化子单菌落，接种于含100μg/ml zeocin的10ml YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养18-24h，以1%接种量接种于200ml YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养16-18h，至OD_600nm值为6，即得种子液；

2）发酵培养：25℃~29℃下，按10%的接种量将上述种子液加入2L基础盐培养基中，调pH值至5.0，加入9.6ml PMT1，通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20%以上；

3）饲喂碳源：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80%以上，开始流加含12‰PMT1的50%葡萄糖溶液，流加速度为12~24ml/L/min，连续流加6~8h，转速上调至1000rpm；

4）甲醇诱导：流加葡萄糖后，饥饿半小时，开始补加100%甲醇，由第一小时的流速1ml/L/min逐渐增加到第六小时的6ml/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调至5.5，控制溶氧在20%以上，至发酵结束；

其中，步骤2）中使用的基础盐培养基配方为：45g葡萄糖、50gNH₄H₂PO₄、20g K₂SO₄、15g MgSO₄·7H₂O、6g KH₂PO₄、0.4g CaSO₄和1.5g KOH，加水定容至1L。

本发明还提供上述毕赤酵母X-33基因工程菌分泌的重组蛋白的纯化方法，其包括对发酵液进行透析脱盐、冷冻干燥、复溶和离子交换层析等步骤。

本发明进一步提供一种在重组毕赤酵母中表达抗菌肽NZ2114的方法，其是利用上述表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生抗菌肽NZ2114。

本发明通过优化抗菌肽NZ2114基因序列，构建特异表达载体，首次实现了抗菌肽NZ2114在毕赤酵母中的高效表达，产量突破克级水平，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题，并建立完善的纯化体系，可实现规模化生产，可应用于抗菌药物开发，饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCR法扩增NZ2114基因的产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M：标准DNA markerII，上样量为5μl；1：以pF1、pR1为引物，PUC57-NZ2114为模板的PCR扩增产物，上样量为2μl。

图2为本发明实施例2中大肠杆菌DH5α阳性转化子鉴定结果；其中，1-8：1-8号转化子（pF1、pR1）特异性引物PCR产物，点样量为5μl；9-16：1-8号转化子的AOX通用引物PCR产物，点样量5μl；M：标准DNA MarkerII。

图3为本发明实施例3中重组pPICZαA-NZ2114载体线性化电泳结果；其中，M：Trans5K DNA marker，点样量为5μl；1：线性化的重组载体pPICZαA-NZ2114，点样量为5μl；2：没有被线性化的重组载体pPICZαA-NZ2114，上样量为5μl。

图4为本发明实施例3中重组酵母菌株X-33的鉴定结果；其中，M：50bp DNA marker，上图1-15：1-15号重组酵母转化子；下图1-15：16-30号重组酵母转化子。

图5为本发明实施例4中N7、N10、N13重组酵母菌株摇瓶水平发酵上清抑菌试验结果；其中，Amp：点样量为10μl的1000×氨苄青霉素；空载体：pPICZαA空质粒重组转化子120h发酵液上清；X-33：毕赤酵母X-33原始菌株120h发酵液上清；N7、N10、N13：表示编号为7、10、13号的NZ2114重组酵母转化子。

图6为本发明实施例4中N7、N10、N13重组酵母菌株120h诱导摇瓶水平发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果；其中，1、2、3分别为N7、N10、N13转化子120h摇瓶水平诱导发酵液上清10μl上样量；M为超低分子量蛋白Marker。

图7为本发明实施例4中N13重组酵母菌株诱导发酵120h后发酵上清抑菌活性检测结果；其中，Amp：点样量为10μl的1000×氨苄青霉素；空载体：pPICZαA空质粒重组转化子120h发酵液上清；X-33：毕赤酵母X-33原始菌株120h发酵液上清；1-3：N13转化子摇瓶水平三个平行样120h发酵上清，上样量为50μl。

图8为本发明实施例4中N13重组酵母菌株摇瓶水平29℃不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M：超低分子量蛋白marker；1：pPICZαA空质粒重组转化子120h发酵液上清10μl；2：毕赤酵母X-33原始菌株120h发酵液上清10μl；3-8：N13重组酵母菌株诱导表达0h、24h、48h、72h、96h、120h发酵上清10μl。

图9为本发明实施例5中N13重组酵母菌株29℃高密度发酵不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测及抗菌活性检测结果；其中，A为Tricine-SDS-PAGE检测29℃诱导不同诱导时间重组酵母菌株蛋白表达情况。M：超低分子量蛋白marker；1-6：分别表示诱导0h、24h、48h、72h、96h、120h发酵上清液，上样量为5μl；B为29℃诱导下不同诱导时间点发酵液上清对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抗菌活性检测。Amp：10μl；1000×氨苄青霉素；1-11：分别表示诱导0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h发酵上清，上样量为25μl。

图10为本发明实施例5中29℃诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中总蛋白浓度和菌体湿重随时间变化曲线。

图11为本发明实施例5中29℃诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中抗菌肽NZ2114浓度和菌体湿重随时间变化曲线

图12为本发明实施例5中N13重组酵母菌株25℃高密度发酵不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测及抗菌活性检测结果；其中，A为Tricine-SDS-PAGE检测25℃诱导不同诱导时间重组酵母菌株蛋白表达情况。M：超低分子量蛋白marker；1-6：分别表示诱导0h、24h、48h、72h、96h、120h发酵上清液，上样量为5μl；B为25℃诱导不同诱导时间点发酵液上清对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抗菌活性检测。Amp：10μl；1000×氨苄青霉素；1-11：分别表示诱导0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h发酵上清，上样量为25μl。

图13为本发明实施例5中25℃诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中总蛋白浓度和菌体湿重随时间变化曲线。

图14为本发明实施例5中25℃诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中抗菌肽NZ2114浓度和菌体湿重随时间变化曲线。

图15为本发明实施例6中抗菌肽NZ2114纯化及鉴定结果；其中，M：超低分子量蛋白marker；A为发酵液纯化前后的Tricine-SDS-PAGE电泳检测，1：发酵液；2：纯化后rNZ2114，上样量为10μl；B为发酵液质谱图；C为纯化后的rNZ2214质谱图。

图16为本发明实施例8中抗菌肽NZ2114溶血性实验结果。

图17为本发明实施例9中抗菌肽NZ2114理化性质分析结果；其中，A为温度对抗菌肽NZ2114活性的影响。1-5：分别为4℃、40℃、60℃、80℃、100℃处理1h抗菌肽NZ2114溶液；1`-5`：分别经过4℃、40℃、60℃、80℃、100℃处理1h的PBS缓冲液。B为pH对抗菌肽NZ2114活性的影响。1-5：分别表示抗菌肽NZ2114在pH为2、4、6、8、10的缓冲液中，37℃孵育12h后的抗菌活性；1`-5`:分别不含抗菌肽NZ2114的pH为2、4、6、8、10的缓冲液，37℃孵育12h后的抗菌活性。

图18为本发明实施例10中抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线；其中，A：甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（MSSA）ATCC25923；B：耐甲氧西林型金黄色葡萄球菌（MRSA）ATCC43300。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）。

以下实施例中使用的酶和试剂：限制性内切酶、pfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Biolabs、Invitrogen和Promega公司。四种dNTP购自Promega公司。DNA和蛋白质分子量标准为Biolabs产品。其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

以下实施例中涉及的培养基配方：

LB培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母浸提取物5g/l，NaCl10g/l；固体LB培养基则加入2%的琼脂糖。

低盐LB培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母浸提取物5g/l，NaCl5g/l；固体低盐LB培养基则加入2%的琼脂粉。

MH培养基：酪蛋白水解物17.5g/l，牛肉浸粉5g/l，淀粉1.5g/l；固体MH培养基则加入2%的琼脂粉。

YPD培养基：蛋白胨20g/l，酵母浸提取物10g/l，葡萄糖20g/l；固体YPD培养基则加入2%琼脂粉。

YPDS培养基：蛋白胨20g/l，酵母浸提取物10g/l，山梨醇182.2g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉20g/l。

BMGY培养基（/L）：酵母浸提取物10g，蛋白胨20g，10%甘油100ml，13.4%无氨基酸酵母氮源（YNB）100ml，0.02%生物素2ml，1mol/l磷酸缓冲液，pH6.0，100ml。

BMMY培养基（/L）：酵母浸提取物10g，蛋白胨20g，0.5%甲醇溶液100ml，13.4%无氨基酸酵母氮源（YNB）100ml，0.02%生物素2ml，1mol/l磷酸缓冲液，pH6.0，100ml。

有关LB培养基、低盐LB、MH、YPD、YPDS、BMGY、BMMY等培养基的使用参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。

以下实施例中涉及的基因扩增及转化子鉴定方法为PCR法及DNA测序法。

以下实施例中涉及的蛋白检测方法为Tricine-SDS-PAGE，参照2006。

以下实施例中涉及的蛋白质浓度测定方法为考马斯亮蓝法。

以下实施例中涉及的蛋白分子量的确定方法为MALDI-TOF MS法。

以下实施例中涉及的蛋白纯化的方法为基于离子层析法。

以下实施例中涉及的发酵方法为高密度发酵法。

以下实施例中涉及的菌种和质粒概述于表1：

表1供试菌种和质粒

实施例1抗菌肽NZ2114基因片段的获得

1.1抗菌肽NZ2114基因表达序列的优化

根据酵母密码子表Pichia pastoris[gbpln]:137CDS's(81301codons)：

根据抗菌肽NZ2114的AA序列：GFGCNGPWNEDDLRCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY（SEQ ID No.1），设计抗菌肽NZ2114编码基因，通过密码子优化后DNA序列（rNZ2114）如下：

GGT TTT GGT TGT AAC GGT CCA TGG AAC GAA GAT GATTTG AGA TGT CAT AAC CAT TGT AAG TCT ATT AAG GGT TACAAG GGT GGT TAC TGT GCT AAG GGT GGT TTT GTT TGT AAGTGT TAC（SEQ ID No.2）。

序列特征：149bp；类型：核酸；链型：双链；拓扑结构：线性；GC%：40.9%。分子类型：双链DNA。

1.2基因表达框的设计

为了有效终止rNZ2114翻译表达，两个连续的TAA终止密码子插入rNZ2114编码序列的C端。为了能实现rNZ2114在毕赤酵母中实现天然分泌表达，信号肽切割位点kex2位点插入rNZ2114的N端。为了能实现rNZ2114基因克隆表达，在NZ2114基因两端设计XhoI、XbaI核酸内切酶位点；为了有效提高XhoI、XbaI核酸内切酶的切割效率，在XhoI、XbaI核酸内切酶位点两端分别插入保护碱基。

表达框基因设计如下（SEQ ID No.3）：

保护碱基

XhoI

Kex2

NZ2114

终止密码子

XhaI

保护碱基

表达框基因序列为：

ctcgag

GGT TTT GGT TGT AAC GGT CCA TGG AAC GAA GAT

Kex2G F G C N G P W N E DGAT TTG AGA TGT CAT AAC CAT TGT AAG TCT ATT AAG GGT TAC AAGD L R C H N H C K S I K G Y KGGT GGT TAC TGT GCT AAG GGT GGT TTT GTT TGT AAG TGT TAC taa taaG G Y C A K G G F V C K C Y※※tctaga

其中，斜体为保护碱基，下划线处为酶切位点，斜体加下划线处为Kex2基因表达产物切割识别序列。

将两个连续的TAA终止密码子插入rNZ2114编码序列的C端，从而有效终止rNZ2114的翻译表达。

将信号肽切割位点kex2位点插入rNZ2114的N端，以实现rNZ2114在毕赤酵母中的天然分泌表达。

在NZ2114基因两端设计XhoI、XbaI核酸内切酶位点，以实现rNZ2114基因的克隆表达。

在XhoI、XbaI核酸内切酶位点两端分别插入保护碱基，从而有效提高XhoI，XbaI核酸内切酶的切割效率。

1.3PCR扩增NZ2114基因表达框

将设计好的NZ2114基因表达框交由生工生物工程有限公司合成。将基因整合到pUC57质粒载体上，为了获得大量NZ2114基因，设计一对PCR扩增引物进行PCR扩增：

pF1：5′-CCGCTCGAGAAGAGAGGTTT-3′

pR1：5′-GCTCTAGATTATTAGTAACAC-3′

以重组的pUC57质粒为模板，反应体系如下：

PCR反应体系如下：

反应条件如下：

PCR产物经PCR产物试剂盒（购自天根生物有限公司）纯化回收，获得高纯度的NZ2114基因片段，-20℃保存备用。图1所示为PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳的检测结果。

实施例2酵母重组表达载体的构建

1.1将实施例1获得的NZ2114基因片段经XhoI和XbaI核酸内切酶双酶切后回收转化片段。同时，用XhoI和XbaI双酶切pPICZαA载体（购自Invitrogen）。

双酶切体系如下：

酶切条件：37℃水浴4h。

酶切产物用DAN产物回收试剂盒回收（购自天根生物有限公司），-20℃保存备用。NZ2114基因和pPICZαA载体经过XbaI和XhoI双酶切消化后，用T4 DNA连接酶将NZ2114基因与线性化的pPICZαA载体进行连接。连接体系如下：

连接条件：25℃，1h。

1.2将获得的重组载体转化到大肠杆菌DH5α中：取出-80℃冷冻保存大肠杆菌DH5α感受态细胞，立即置于冰上化冻。然后取出90μl感受态细胞加入到1.5ml灭菌离心管，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，然后迅速置于42℃水浴锅热激90s，快速置于冰上冰浴2min。然后，向每个离心管中加入500μl低盐LB培养基（不含抗生素），混匀，37℃，100rpm培养1-2h。然后低转速5000rpm离心2min，去上清，加200μl低盐LB培养基重悬，取100μl重悬菌液涂布在含有25μg/mlzeocin低盐LB固体平板上，37℃，倒置培养，16-18h。

1.3大肠杆菌DH5α阳性转化子鉴定

挑取在低盐LB平板上长出的单菌落接种于10ml LB液体培养基中（含25μg/ml zeocin），37℃，250rpm过夜培养，通过菌落PCR鉴定阳性转化子。挑取经通用引物和特异引物验证的阳性转化子接种于10ml低盐LB液体培养基中（含25μg/ml zeocin），37℃，250rpm过夜培养，取500μg送上海生物工程有限公司测序，与设计基因序列进行比对，从DNA水平上验证外源基因插入是否完全正确。

（1）3`,5`AOX-通用引物检测

3`AOX:5`-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3`

5`AOX:5`-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3`

菌落PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

（2）pF1,pR1特异性引物检测

pF1：5`-CCGCTCGAGAAGAGAGGTTT-3`

pR1：5`-GCTCTAGATTATTAGTAACAC-3`

菌落PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带（图2）。测序结果如SEQ ID No.4所示。测序结果表明，NZ2114基因片段插入位点、方向及序列完全正确，与设计相符。

（3）重组pPICZαA-NZ2114载体提取:挑取鉴定正确的大肠杆菌DH5α阳性转化子，接种于10ml含25μg/ml zeocin抗生素的低盐LB液体培养基，37℃，250rpm过夜培养.采用质粒小提试剂盒提取大肠杆菌DH5α中重组质粒。

实施例3含NZ2114基因的重组酵母菌株X-33的制备

1.1重组pPICZαA-NZ2114载体线性化

将实施例2中获得的重组pPICZαA-NZ2114载体用BglII核酸内切酶线性化后用于酵母转化。

线性化体系如下：

反应条件：37℃，4h。

电泳结果（图3）显示：pPICZαA-NZ2114重组载体完全线性化。

1.2毕赤酵母X-33感受态的制备

挑取毕赤酵母菌株X-33（购自Invitrogen）单菌落接种至10ml YPD培养基中，250rpm，30℃振荡培养过夜，1%的接种量接种毕赤酵母X-33过夜培养物至50ml YPD培养基中，250rpm，30℃振荡培养至OD_600nm=1.3-1.5，4℃4000rpm，离心5min，去上清液，50ml冰预冷的无菌水重悬菌体，4℃4000rpm，离心5min，去上清液，25ml冰预冷的无菌水重悬菌体，4℃4000rpm，离心5min，去上清液，2ml冰预冷的1M山梨醇重悬菌体，4℃4000rpm，离心5min，去上清液，200μl冰预冷的1M山梨醇重悬菌体，90μl/管分装直接用于电转化，现制备现用。

1.3电转化

向90μl酵母感受态细胞中加入1-5μg线性化的质粒（溶于10μl TE缓冲液中），轻轻混匀，转至冰预冷的电转杯中，冰上放置5min，电转，参数为1200V，25μF，400Ω。电转后立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液，混匀转入2ml离心管中，30℃，复苏2h,取100μl复苏后的菌液涂布在含有100μg/ml zeocin抗生素的YPDS平板上，29℃倒置培养，直至长出单菌落。

1.4含有NZ2114基因的重组酵母菌株X-33鉴定

（1）重组酵母菌株X-33基因组提取：挑取YPDS平板上的重组转化子于10ml YPD液体培养（含100μg/ml zeocin）中，29℃，250rpm振荡培养过夜，取1ml菌液，5000rpm离心5min，去上清，500μlPBS重悬菌体，8000rpm离心5min，去上清，100μl TE重悬，沸水浴10min，-80℃冷冻30min，沸水浴10min，4000rpm离心5min取上清即酵母基因组作为PCR鉴定阳性转化模板DNA。

（2）PCR方法鉴定阳性转化子：重组酵母基因组作为模板，以NZ2114特异性引物：F1：5`-CCGCTCGAGAAGAGAGGTTT-3`；R1：5`-GCTCTAGATTATTAGTAACAC-3`进行PCR鉴定，设计包含目的基因片段的PCR产物长度为108bp；PCR产物电泳结果显示在100bp处出现条带，与设计产物长度相符。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR鉴定结果（图4）表明：4-15，16-28，30号重组酵母转化子为阳性转化子，可用于后续的诱导表达。

实施例4摇瓶水平高效表达NZ2114重组酵母菌株筛选

1.1挑取实施例3中鉴定得到的阳性重组酵母转化子，接种于10mlYPD液体培养基（含100μg/ml zeocin）中，30℃，250rpm培养16-18h，以1%接种量将过夜菌液接种于10ml BMGY培养基中，30℃，250rpm培养至OD600nm约5.0，收集菌液，4℃，4000rpm，离心5min，去上清液，收集菌体，用50ml BMMY培养基重悬细胞至OD_600nm约为1.0，将上述菌液转移至250ml摇瓶中，加盖4层灭菌纱布，放入摇床继续培养，此时计为初始诱导0h，随后，每24h加100%甲醇至终浓度0.5%，诱导120h，并在0h、24h、48h、72h、96h、120h取500μl，12000rpm离心10min，收集上清液，-20保存备用。

1.2重组酵母菌株诱导表达水平检测及筛选表达水平最高的重组菌株

（1）重组酵母发酵液抗菌活性检测

抑菌圈分析(Zhang,Yang等，2011)被用来检测重组酵母发酵液抗金黄色葡萄球菌活性。S.aureus ATCC25923作为受试菌。挑取S.aureusATCC25923单菌落接种于10ml MH培养基中，37℃，250rpm培养OD_600nm=0.4,1%接种于50mlMH培养基中，混匀，迅速倒入19cm×19cm的方形培养皿中，待凝固后，在培养基表面小心放置牛津杯，分别加入50μl发酵液，以10μl1000×Amp为阳性对照。通过此种方法筛选出三株高活性的重组酵母菌株，分别命名为N7、N10、N13重组酵母菌株。

抑菌试验结果（图5）表明：N7、N10、N13三株重组酵母菌株均有表达，且活性随诱导时间积累而增强，而对照空载体和空菌株没有抗菌活性，阳性对照Amp对金黄色葡萄球菌有抗菌活性。根据抗菌活性可以知道，N13转化子在120h诱导时发酵上清具有更强的活性。

（2）组酵母分泌蛋白水平检测

对（1）中获得的高活性的重组酵母菌株进一步采用Tricine-SDS-PAGE分析重组NZ2114表达水平。

结果见图6，从蛋白电泳图谱来看，N7、N10、N13表达水平相当，结合抗菌活性检测结果，确定N13为最优重组酵母菌株。

（3）最优转化子N13摇瓶水平诱导表达探究

按照实施例3中描述的方法对N13转化子，菌株编号X-33/NZ2114（保藏号CGMCC No.6987）摇瓶诱导表达水平进行检测。设三个平行进行相同的处理后，检测结果如图7所示。N13重组酵母菌株摇瓶水平29℃不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果如图8所示。

实施例5不同温度下重组酵母菌株N13的高密度发酵

1.129℃重组酵母菌株N13的高密度发酵

从YPD平板挑取N13转化子单菌落，接种于装液量为10ml YPD液体培养基（含100μg/ml zeocin）的50ml摇瓶中，29℃250rmp，18-24h，以1%接种量接种于装液量为200ml YPD种子液培养基的1L摇瓶中，29℃250rmp，16-18h，OD_600nm约为6，作为高密度发酵种子液备用。

采用5L发酵罐（BIOSTATB plus,Sartorius Stedim Biotech）进行高密度发酵，发酵过程分为三个阶段：（1）菌体生长阶段：加入2L基础盐培养基，121℃灭菌20min，冷却至29℃，调节pH到5.0，加入9.6ml PMT1，接入200ml菌液（1：10），通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20%以上；（2）流加葡萄糖生长阶段：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80%以上，开始流加50%葡萄糖溶液（12‰PMT1），流加速度为24ml/L/min，连续流加6h，转速上调至1000rpm，其它发酵条件不变；（3）甲醇过渡诱导阶段：发酵条件变化，流加葡萄糖6h后，饥饿半小时，开始补加100%甲醇，由第一小时的流速1ml/L/min逐渐增加到第六小时的6ml/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调为5.5，控制溶氧在20%以上，其他发酵条件不变，直至发酵结束。

从过渡诱导开始，每隔12h取5ml样品，用于检测菌体湿重和蛋白表达情况分析，及抗菌活性分析，结果如图9所示。图10为29℃诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中总蛋白浓度和菌体湿重随时间变化曲线。图11为29℃诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中抗菌肽NZ2114浓度和菌体湿重随时间变化曲线。

结果表明，29℃，120h诱导表达后总的蛋白表达水平达到3500mg/L，目的蛋白NZ2114浓度达到1083mg/L。

1.225℃重组酵母菌株N13的高密度发酵

从YPD平板挑取N13转化子单菌落，接种于装液量为10ml YPD液体培养基（含100μg/ml zeocin）的50ml摇瓶中，29℃250rmp，18-24h，以1%接种量接种于装液量为200ml YPD种子液培养基的1L摇瓶中，29℃250rmp，16-18h，OD_600nm约为6，作为高密度发酵种子液备用。

采用5L发酵罐（BIOSTATB plus,Sartorius Stedim Biotech）进行高密度发酵，发酵过程分为三个阶段：（1）菌体生长阶段：加入2L基础盐培养基，121℃灭菌20min，冷却至25℃，调节pH到5.0，加入9.6ml PMT1，接入200ml菌液（1：10），通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20%以上；（2）流加葡萄糖生长阶段：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80%以上，开始流加50%葡萄糖溶液（12‰PMT1），流加速度为12ml/L/min，连续流加8h，转速上调至1000rpm，其它发酵条件不变；（3）甲醇过渡诱导阶段：发酵条件变化，流加葡萄糖6h后，饥饿半小时，开始补加100%甲醇，由第一小时的流速1ml/L/min逐渐增加到第六小时的6ml/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调为5.5，控制溶氧在20%以上，其他发酵条件不变，直至发酵结束。

从过渡诱导开始，每隔12h取5ml样品，用于检测菌体湿重和蛋白表达情况分析，结果如图12所示。图13为25℃诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中总蛋白浓度和菌体湿重随时间变化曲线。图14为25℃诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中抗菌肽NZ2114浓度和菌体湿重随时间变化曲线。

结果表明，25℃，120h诱导表达后总的蛋白表达水平达到2310mg/L，目的蛋白NZ2114浓度达到1310mg/L。

实施例6抗菌肽NZ2114的纯化

根据实施例5中获得的含有抗菌肽NZ2114的发酵液，经过1KD截留分子量的透析袋4℃透析，每2h换水一次，换水6次，收集透析后的发酵液，-80℃过夜冷冻，低温真空冷冻干燥机（-54℃，0.016mba）冻干，取一定量冻干粉用A液（20mM PBS pH6.7），复溶后上样。

纯化条件：

A：20mM PBS pH6.7     B：20mM PBS pH6.7+1M NaCl

洗脱条件：先14%B洗脱，后用60%B洗脱；v=3ml/min，电导<205S/cm。

收集60%洗脱峰，经1KD截留分子量透析袋4℃透析，每2h换水一次，换水6次。收集透析后的透析液，低温真空冷冻干燥机（-54℃，0.016mba）冻干，即获得纯度高于94%的抗菌肽NZ2114冻干粉产品。

纯化结果如图15所示。纯化后的质谱图显示rNZ2114分子量与理论分子量相符，且没有出现其它杂峰，同过Band scale软件分析得到纯度为94.8%。

实施例7抗菌肽NZ2114抗菌活性检测

根据实施例6中获得大量的抗菌肽NZ2114冻干粉，用无菌生理水配制浓度为1280μg/mL的抗菌肽NZ2114和氨苄青霉素及万古霉素溶液，2倍倍比稀释至终浓度0.625μg/mL，将不同浓度的抗菌肽NZ2114溶液，氨苄青霉素溶液及万古霉素溶液分别加到无菌96孔细胞培养板中，每孔10μL，每个样品三个平行，相同量（10μL）无菌生理盐水作为生阳性对照，制备MIC板。金黄色葡萄球菌采用MH液体培养基培养，37℃振荡培养至OD_600nm=0.4，将金黄色葡萄球菌菌液制备成浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经37℃孵育后的无菌MH液体培养基1000倍稀释后，向制备好的MIC板样品孔中每孔加90μL菌悬液，37℃恒温孵育16-18h观察并记录实验结果。取MIC、2MIC、4MIC、8MIC浓度值的菌液10倍梯度稀释后涂布于MH固体培养基，37℃恒温孵育24h，直至长出菌落，菌落计数，并计数，菌落数是低于初始接种时99.9%的最低浓度即为抗菌肽NZ2114对应金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度（MBC）。测定结果如表2所示。

表2抗菌肽NZ2114抗金黄色葡萄球菌的活性检测结果

注：SJU20040，SJU20027为临床分离的MRSA。

实施例8抗菌肽NZ2114的细胞毒性实验

通过检测抗菌肽NZ2114溶液对人红细胞溶血性实验来检测抗菌肽NZ2114的细胞毒性，参考Cho and Lee（2011）的方法。

根据实施例6中获得大量的抗菌肽NZ2114冻干粉，将抗菌肽NZ2114溶解于无菌生理盐水中，配置成浓度为256μg/ml的母液，2倍倍比稀释终浓度为2μg/ml。采集一定量人血液，制成8%红细胞悬浮液，各取100μl红细胞悬浮液和抗菌肽NZ2114溶液，加入96孔板，37℃孵育1h，1500rpm离心5min，吸取上清至ELISA酶标板检测540nm下紫外吸光值。生理盐水和0.1%Triton X-100分别为0%和100%溶血对照实验。溶血程度计算公式如下（参考Jung,Park等，2007）：溶血度（%）=[(Abs_540nm抗菌肽NZ2114－Abs_540nm生理盐水)／(Abs_540nm0.1%Triton X-100－Abs_540nm生理盐水)]×100%

结果如图16所示。

实施例9抗菌肽NZ2114的理化性质检测

1.1温度对抗菌活性影响

根据实施例6中获得大量的抗菌肽NZ2114冻干粉，取一定量抗菌肽NZ2114冻干粉，溶解于PBS（pH6.0）缓冲液中，制备成终浓度为64μg/ml抗菌肽溶液，分装成五管，每管50μl，分别在4、40、60、80、100℃下水浴1h，以等体积PBS缓冲液做相同处理作为对照。按实施例4中所述的方法（抑菌圈分析）检测抗菌活性变化情况，结果如图12所示。

1.2pH对抗菌活性影响

根据实施例6中获得大量的抗菌肽NZ2114冻干粉，取一定量的抗菌肽NZ2114冻干粉溶解于甘氨酸-盐酸缓冲液（pH2.0）、glycine-HCl缓冲液(pH2.0)、醋酸钠缓冲液（pH4.0）、磷酸钠缓冲液（pH6.0）、Tris-HCl缓冲液（pH8.0）、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH10.0）配置成终浓度为64μg/ml的不同pH环境的抗菌肽溶液，37℃孵育12h，以相同处理的对应pH缓冲液作为对照。按实施例4中所述的方法（抑菌圈分析）检测抗菌活性变化情况，结果如图17所示。

实施例10抗菌肽NZ2114杀菌动力学曲线测定

通过时间-杀菌曲线来反应抗菌肽NZ2114的杀菌动力学。金黄色葡萄球菌ATCC25923和ATCC43300被用做受试菌。挑取ATCC25923和ATCC43300单菌落接种于MH液体培养基，37℃200rpm过夜培养，然后以1%接种量接种于10ml新鲜的MH液体培养基中，37℃200rpm培养至对数期（OD_600nm=0.4），将此时期菌液用新鲜的MH培养基稀释至1×10⁵cfu/ml菌浓，作为测试菌液。加入终浓度分别为1×、2×、4×MIC浓度的抗菌肽NZ2114溶液，37℃200rpm培养。同时，不加抗菌肽NZ2114的菌液和加入2×MIC终浓度的万古霉素分别作为对照试验。在0、2、4、6、12、24h时间点分别取100μl菌液样品，并做10倍梯度稀释，取100μl不同梯度的稀释液涂布在MH固体平板上，37℃倒置培养48h，统计单菌落数，绘制时间-杀菌曲线。结果图18所示。

本发明成功优化了编码抗菌肽NZ2114基因，并构建了pPICZαA-NZ2114重组表达载体，经BglII线性化后成功转化到毕赤酵母X-33中获得N7、N10、N13三株表达水平较高的重组酵母菌株，抗菌肽NZ2114在毕赤酵母X-33中实现了高水平的分泌表达。将重组酵母N13进行高密度发酵后，对其总蛋白浓度，抗菌肽NZ2114浓度及生物量进行检测，结果显示120h发酵后总蛋白浓度达到3500mg/l，抗菌肽NZ2114浓度达到1083mg/l，生物量达到472g/l。并通过一步纯化法获得>94%纯度的抗菌肽NZ2114产品，回收率约为50%，产量约为500mg/l。对纯化后的抗菌肽NZ2114进行了抗菌活性检测，结果显示，其抗金黄色葡萄球菌ATCC25923的最低抑菌浓度（MIC）值为0.03μM，抗耐药金黄色葡萄球菌ATCC43300的MIC值为0.9μM，而最低杀菌浓度（MBC）分别为0.06μM和0.9μM）。通过pH及热稳定性试验表明，抗菌肽NZ2114可以在较宽广的pH范围内（pH2-10）具有抗金黄色葡萄球菌活性，且热稳定性好，80℃加热1h活性没有损失，100℃加热处理1h也依然具有抗菌活性。另外，通过时间-杀菌曲线结果反应抗菌肽NZ2114在短时间内（2h）就能快速杀灭90%以上的金黄色葡萄球菌（包括MRSA）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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Claims (8)

1.一种含有编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，其特征在于，包括诱导型启动子、位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码抗菌肽NZ2114的DNA序列，所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA；

所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列如SEQ ID No.2所示；

所述表达载体的出发载体为pPICZαA。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，在编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列的5’端连接有XhoI酶切位点，且在XhoI酶切位点的5’端连接有保护碱基CCG；在编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端连接有XhaI酶切位点，且在XhaI酶切位点的3’端连接有保护碱基GC。

3.含有权利要求1或2所述表达载体的宿主细胞。

4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其为毕赤酵母。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其为毕赤酵母X-33基因工程菌。

6.权利要求5所述基因工程菌的培养方法，包括以下步骤：

1）种子液的制备：从YPD平板挑取酵母转化子单菌落，接种于含100μg/ml zeocin的10ml YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养18-24h，以1%接种量接种于200ml YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养16-18h，至OD_600nm值为6，即得种子液；

2）发酵培养：25℃～29℃下，按10%的接种量将上述种子液加入2L基础盐培养基中，调pH值至5.0，加入9.6ml PMT1，通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20%以上；

3）饲喂碳源：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80%以上，开始流加含12‰PMT1的50%葡萄糖溶液，流加速度为12～24ml/L/min，连续流加6～8h，转速上调至1000rpm；

4）甲醇诱导：流加葡萄糖后，饥饿半小时，开始补加100%甲醇，由第一小时的流速1ml/L/min逐渐增加到第六小时的6ml/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调至5.5，控制溶氧在20%以上，至发酵结束；

其中，步骤2）中使用的基础盐培养基配方为：45g葡萄糖、50gNH₄H₂PO₄、20g K₂SO₄、15g MgSO₄.7H₂O、6g KH₂PO₄、0.4g CaSO₄和1.5g KOH，加水定容至1L。

7.一种在重组毕赤酵母中表达抗菌肽NZ2114的方法，其是利用权利要求1或2所述的表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生抗菌肽NZ2114。

8.重组毕赤酵母菌（Pichia pastoris）X-33/NZ2114，其保藏编号为CGMCC No.6987。

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