CN107699507A - 一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，该毕赤酵母依次经过pTRP‑NZ2114、pPIC9K‑NZ2114、pPIC6αA‑NZ2114三种不同菌丝霉素表达载体转化，并且每次转化得到的菌株选用不同的抗生素高拷贝筛选，得到菌丝霉素高表达量的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母中菌丝霉素的最高表达量达6.0g/L，大大高出目前已公开的技术；同时三种表达载体选用三种不同的整合位点，提高了多拷贝菌株中基因组的菌丝霉素表达盒的分散性，在一定程度上减少了菌丝霉素表达盒拷贝数的丢失，从而提高菌株的稳定性。

Description

一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母
技术领域
本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，特别涉及一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母。
背景技术
菌丝霉素（Plectasin）是由丹麦诺维信公司从腐生子囊菌假黑盘菌（Pseudoplectania nigrella）中分离得到的首例真菌防御素（专利WO 2003044049 A1）。菌丝霉素基因的完整开放阅读框编码一个长为95个氨基酸的多肽，共由3部分组成。信号肽序列（1～23位氨基酸）、前肽（24～55位氨基酸）和C-末端成熟肽（56～95位氨基酸）。成熟的菌丝霉素由40个氨基酸残基组成，其二级结构属于α-β模型，由一个α-螺旋和两个反平行的β-折叠组成，其中包含三个二硫键(Cys4-Cys30，Cys15-Cys37，Cys19-Cys39)，其净电荷数为+1～+3。NZ2114突变体是诺维信公司对菌丝霉素基因通过高通量突变筛选获得的含3个氨基酸突变的变异体。与菌丝霉素相比，NZ2114突变体对金黄色葡萄球菌的抑制作用显著提高。
菌丝霉素对革兰氏阳性细菌具有明显杀伤作用，包括：链球菌属，葡萄球菌属，肠球菌属，棒状杆菌属和杆状菌属。尤其值得注意的是，菌丝霉素对肺炎链球菌的杀菌效果与万古霉素和青霉素的杀菌效果相当。菌丝霉素具有良好的盐离子耐受能力、pH稳定性和热稳定性。同时，菌丝霉素无细胞毒性、无溶血性及脑脊液渗透性好，是治疗革兰氏阳性细菌引起的疾病的潜在药物，具有广阔应用前景。
菌丝霉素的生产方式主要有三种：提取、化学合成和生物合成。腐生子囊菌中的菌丝霉素含量非常少，因此通过提取方式获得菌丝霉素是非常不经济的。化学合成得到的菌丝霉素，由于无法形成二硫键，因此菌丝霉素的空间结构不正确，抑菌活性大幅减少。还需要后续操作重新形成二硫键，步骤繁琐，价格昂贵，不适合大规模生产。生物合成主要通过基因工程手段构建工程菌株异源表达菌丝霉素，主要有原核表达和真核表达系统。中国专利授权号CN103374579B提供了一种菌丝霉素和硫氧还蛋白融合表达的大肠杆菌工程菌，摇瓶产量为0.124g/L融合蛋白。中国专利授权号CN104232712B提供了一种分泌表达菌丝霉素的酿酒酵母工程菌，摇瓶产量为0.143g/L总蛋白。中国专利申请号201611052836.1提供了一种菌丝霉素和SUMO融合表达的枯草芽孢杆菌工程菌，摇瓶产量为5.5mg/L菌丝霉素。上述表达系统的菌丝霉素产量都非常低。
毕赤酵母表达系统是最常用的蛋白表达系统之一，已有上千种蛋白在毕赤酵母中成功表达，并有多种蛋白实现工业化生产。中国专利授权号CN103045636B提供了一种分泌表达菌丝霉素的毕赤酵母工程菌，发酵罐产量为1.3g/L菌丝霉素。该专利通过单拷贝菌丝霉素表达载体pPICZαA-NZ2114整合至X-33毕赤酵母基因组，再通过博来霉素抗生素筛选高拷贝菌株。由于在一次转化过程中表达载体在基因组中发生多次整合的概率极低，导致筛选菌株的基因拷贝数不高，所以通过该方法获得的工程菌的菌丝霉素表达量低，筛选工作量大。同时，该表达载体是以AOX1启动子作为整合为点，因此这些多拷贝菌株的载体整合片段都是相互邻近的，在传代过程中会由于同源重组的原因导致基因拷贝数逐渐减少，引起菌株不稳定。
可见，现有技术还有待改进和提高。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种重组菌丝霉素的毕赤酵母，旨在解决现有技术中通过毕赤酵母表达菌丝霉素的表达量低，筛选工作量大，而且菌株在传代过程中基因拷贝数逐渐减少，菌株不稳定的问题。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母,其中，该毕赤酵母分别经过三种不同菌丝霉素表达载体转化，并且每次转化得到的菌株选用不同的抗生素高拷贝筛选；
其中，所述菌丝霉素表达载体依次为：pTRP-NZ2114、pPIC9K-NZ2114、pPIC6αA-NZ2114。
所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X-33基因工程菌，所述菌丝霉素包括如SEQ ID No.1所示的DNA序列。
所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.25～4mg/mL的博来霉素。
所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，所述菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114转化的感受态细胞包括毕赤酵母X-33、毕赤酵母GS115、毕赤酵母SMD1168。
所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pPIC9K-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.25～4mg/mL G418。
所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pPIC6αA-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.1-1mg/mL Blasticidin。
所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，所述的菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114的载体骨架为pPICzαA,整合位点为毕赤酵母基因组TRP2基因片段，所述的表达载体pPIC9K-NZ2114的整合位点为His4，所述的表达载体pPIC6αA-NZ2114的整合位点为AOX1。
所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，所述的TRP2基因片段的5’端连接有BamHI酶切位点GGATCC，TRP2基因片段3’端添加BglII酶切位点AGATCT。
所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，所述重组菌丝霉素的诱导表达方法包括以下步骤：
S001.制备种子液：挑选经上述三种表达载体转化后制备的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母细胞，接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备得到一级种子液；取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备得到二级种子液；
S002.发酵培养：将步骤S001中制备的二级种子液全部接种于5L发酵罐中，加入2L BSM培养基，控制温度30℃±0.5℃，溶氧20%±5%，PH为5.0±0.5；
S003.饲喂碳源：步骤S002的培养基中的甘油耗尽后，流加10%甘油；
S004.甲醇诱导：步骤S003的培养基中的甘油耗尽后，直至溶氧上升至90%，饥饿半小时，流加甲醇诱导菌丝霉素表达，共诱导72h。
所述的高效分泌表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，其保藏编号为GDMCCNo.60234。
有益效果：
本发明提供了一种菌丝霉素的毕赤酵母，所述毕赤酵母通过3种菌丝霉素表达载体转化，每一次转化利用不同的抗生素进行高拷贝菌株筛选，得到菌丝霉素高表达量的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母中菌丝霉素的最高表达量达6.0g/L，大大高出目前已公开的技术；同时三种表达载体选用三种不同的整合位点，提高了多拷贝菌株中基因组的菌丝霉素表达盒的分散性，在一定程度上减少了菌丝霉素表达盒拷贝数的丢失，从而提高菌株的稳定性。
附图说明
图1为本发明提供的菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114示意图。
图2为所述菌丝霉素表达载体pPIC9K-NZ2114示意图。
图3为所述菌丝霉素表达载体pPIC6αA-NZ2114示意图。
图4为Top10/pTRP菌落PCR电泳验证图。
其中，M：1kb plus DNA marker;C-：空菌株对照，E.coli Top10，无条带；C+：合成质粒对照，pUC-TRP，扩增条带约1kb； 1：pTRP验证，扩增条带约1kb。
图5为pTRP-NZ2114、pPIC9K-NZ2114、pPIC6αA-NZ2114三个菌丝霉素表达载体菌落PCR电泳验证图。
其中，M：1kb plus DNA marker；C+：空质粒对照，pPICzαA，扩增条带约0.6kb；C-：空菌株对照，E.coli Top10，无条带；1：pTRP-NZ2114验证，扩增条带约0.7kb；2：pPIC9K-NZ2114验证，扩增条带约0.7kb；3：pPIC6αA-NZ2114验证，扩增条带约0.7kb。
图6为PLE-1筛选示意图。
注：发酵液稀释5倍后再进行抑菌圈检测。
图7为PLE-2筛选示意图。
注：发酵液稀释20倍再进行抑菌圈检测。
图8为PLE-3筛选示意图。
注：发酵液稀释30倍再进行抑菌圈检测。
图9为菌丝霉素发酵上清液蛋白电泳示意图。
其中，Marker：蛋白标准分子量marker；PLE-1～3：三种菌丝霉素表达工程菌发酵液样品。
图10为菌丝霉素质谱检测图。
图11为菌丝霉素发酵上清液抑菌圈检测结果图。
具体实施方式
本发明提供一种重组菌丝霉素的毕赤酵母，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母,其中，该毕赤酵母分别经过三种不同菌丝霉素表达载体转化，并且每次转化得到的菌株选用不同的抗生素高拷贝筛选；
其中，所述菌丝霉素表达载体依次为：pTRP-NZ2114、pPIC9K-NZ2114、pPIC6αA-NZ2114。
本发明中所述毕赤霉素通过三种菌丝霉素表达载体转化X-33毕赤酵母工程菌，每一次转化利用不同的抗生素进行高拷贝的菌株筛选，大大地提高了所述菌丝霉素的表达量。
优选地，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X-33基因工程菌，所述菌丝霉素包括如SEQID No.1所示的DNA序列：
1 GGTTTCGGTT GTAACGGACC TTGGAACGAA GATGATCTGA GGTGCCATAA
TCACTGTAAG
61 TCAATCAAGG GATATAAGGG AGGTTACTGT GCCAAAGGTG GATTTGTTTG
CAAATGCTAC
121 AA
优选地，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.25～4mg/mL的博来霉素。
优选地，所述菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114转化的感受态细胞包括毕赤酵母X-33、毕赤酵母GS115、毕赤酵母SMD1168中的一种；本实施例中，优选毕赤酵母X-33工程菌。
本实施例中，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pPIC9K-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.25～4mg/mL G418（Geneticin,遗传霉素）。
本实施例中，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pPIC6αA-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.1-1mg/mL Blasticidin（杀稻瘟菌素）。
优选地，所述的菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114的载体骨架为pPICzαA,整合位点为毕赤酵母基因组TRP2基因片段，所述的表达载体pPIC9K-NZ2114的整合位点为His4，所述的表达载体pPIC6αA-NZ2114的整合位点为AOX1；三组不同的表达载体选用不同的整合位点，使得到的多拷贝菌株中基因组的菌丝霉素表达盒呈现相对分散的状态，在一定程度上减少菌丝霉素表达和拷贝数的丢失，从而提高菌株稳定性。
具体地，所述的TRP2基因片段的5’端连接有BamHI酶切位点GGATCC，TRP2基因片段3’端添加BglII酶切位点AGATCT。
本实施例中，所述重组菌丝霉素的诱导表达方法包括以下步骤：
S001.制备种子液：挑选经上述三种表达载体转化后制备的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母细胞，接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备得到一级种子液；取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备得到二级种子液；
S002.发酵培养：将步骤S001中制备的二级种子液全部接种于5L发酵罐中，加入2L BSM培养基，控制温度30℃±0.5℃，溶氧20%±5%，PH为5.0±0.5；
S003.饲喂碳源：步骤S002的培养基中的甘油耗尽后，流加10%甘油；甘油能够提供使所述菌种快速生长的碳源，而且甘油便宜，容易得到，效果稳定，在使用过程中可以直接被磷酸化，从而被所述菌种利用，提高了所述菌种的生长速率；流加甘油可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧矛盾，避免在培养基中积累有毒代谢物，不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题。
S004.甲醇诱导：步骤S003的培养基中的甘油耗尽后，直至溶氧上升至90%，饥饿半小时，流加甲醇诱导菌丝霉素表达，共诱导72h；所述培养基甲醇诱导后6000×g离心5min，取上清液检测，得到的是重组菌丝霉素蛋白浓度。
所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母（Pichia pastorisX33 PLE-3），现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510075，保藏日期2017年9月14 日，保藏编号GDMCC No.60234。
下列实施例中未注明具体条件的实验操作，均参照《分子克隆实验指南》（Molecμlar Cloning：A Laboratory Manual，2002）中所述的条件进行。
DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶均购于New England Biolabs，X-33毕赤酵母及其表达载体购于Invitrogen。
实施例1 菌丝霉素表达载体的构建
1.1 基于毕赤酵母密码子偏好性设计菌丝霉素NZ2114基因
根据毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子偏好性
密码子 使用频率‰ 数量
UUU 24.1 1963
UCU 24.4 1983
UAU 16.0 1300
UGU 7.7 626
UUC 20.6 1675
UCC 16.5 1344
UAC 18.1 1473
UGC 4.4 356
UUA 15.6 1265
UCA 15.2 1234
UAA 0.8 69
UGA 0.3 27
UUG 31.5 2562
UCG 7.4 598
UAG 0.5 40
UGG 10.3 834
CUU 15.9 1289
CCU 15.8 1282
CAU 11.8 960
CGU 6.9 564
CUC 7.6 620
CCC 6.8 553
CAC 9.1 737
CGC 2.2 175
CUA 10.7 873
CCA 18.9 1540
CAA 25.4 2069
CGA 4.2 340
CUG 14.9 1215
CCG 3.9 320
CAG 16.3 1323
CGG 1.9 158
AUU 31.1 2532
ACU 22.4 1820
AAU 25.1 2038
AGU 12.5 1020
AUC 19.4 1580
ACC 14.5 1175
AAC 26.7 2168
AGC 7.6 621
AUA 11.1 906
ACA 13.8 1118
AAA 29.9 2433
AGA 20.1 1634
AUG 18.7 1517
ACG 6.0 491
AAG 33.8 2748
AGG 6.6 539
GUU 26.9 2188
GCU 28.9 2351
GAU 35.7 2899
GGU 25.5 2075
GUC 14.9 1210
GCC 16.6 1348
GAC 25.9 2103
GGC 8.1 655
GUA 9.9 804
GCA 15.1 1228
GAA 37.4 3043
GGA 19.1 1550
GUG 12.3 998
GCG 3.9 314
GAG 29.0 2360
GGG 5.8 468
设计菌丝霉素NZ2114基因序列（SEQ ID No.1）：
1 GGTTTCGGTT GTAACGGACC TTGGAACGAA GATGATCTGA GGTGCCATAA
TCACTGTAAG
61 TCAATCAAGG GATATAAGGG AGGTTACTGT GCCAAAGGTG GATTTGTTTG
CAAATGCTAC
121 TAA
基因序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，其对应的氨基酸序列（SEQ IDNo.2）为：
GFGCNGPWNE DDLRCHNHCK SIKGYKGGYC AKGGFVCKCY
1.2 第一个表达载体pTRP-NZ2114的构建
以pPICzαA载体为骨架，引入毕赤酵母基因组TRP2基因片段作为整合为点，构建新的表达载体pTRP。
根据pPink-LC载体的TRP2序列，在TRP2基因片段5’端添加BamHI酶切位点（GGATCC），在TRP2基因片段3’端添加BglII酶切位点（AGATCT），所得基因片段由上海生工生物工程股份有限公司合成，得到克隆载体pUC-TRP。
BamHI和BglII限制性内切酶双酶切处理pUC-TRP克隆载体得到酶切片段TRP2基因片段。同时BamHI单酶切处理pPICzαA载体，得到酶切载体片段。利用T4 DNA连接酶连接载体片段和TRP2片段，得到pTRP载体。
连接产物42℃热激转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于LB平板（含100ug/mL博来霉素），37℃过夜培养至长出单菌落。
请参阅图4，利用验证引物：
TRP-F：5’-ATCATCACCCTTGAGCCCAACTCTC-3’ （SEQ ID No.3），
TRP-R：5’-CTTCTTCTCTTGTCTTATAATATTT-3’ （SEQ ID No.4），挑单菌落菌落PCR验证阳性转化子，目的条带约1kb。挑取阳性转化子测序，正确菌株保存于甘油管中。
在菌丝霉素NZ2114基因5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点（CTCGAGAAAAGA），保证分泌的菌丝霉素能被正确切割信号肽。在NZ2114基因3’端添加EcoRI和SacII酶切位点（GAATTCCCGCGG）。所得基因序列提交上海生工生物工程股份有限公司合成，得到克隆载体pUC-NZ2114。
请参阅图1，用XhoI和SacII限制性内切酶双酶切处理pUC-NZ2114克隆载体得到菌丝霉素NZ2114片段，连接至同样被XhoI和SacII限制性内切酶双酶切处理的pTRP载体，构建第一个菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114。该表达载体整合至TRP2位点，利用AOX1启动子在甲醇诱导下表达α-信号肽和菌丝霉素融合蛋白，融合蛋白在N端α-信号肽的引导下转运至内质网，进而在高尔基体内被Kex2蛋白酶切割Kex2位点，从而释放出天然的菌丝霉素NZ2114蛋白多肽，并在高尔基体内完成蛋白的翻译后修饰，最终分泌至细胞外。
连接产物42℃热激转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于LB抗性平板，37℃过夜培养至长出单菌落。利用验证引物：
5AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，
3AOX-R：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，挑单菌落菌落PCR验证阳性转化子，目的条带约0.7kb（如图5所示）。挑取阳性转化子测序，正确菌株保存于甘油管中。
1.3 第二个表达载体pPIC9K-NZ2114的构建
请参阅图2，PmeI和EcoRI双酶切处理pTRP-NZ2114表达载体得到菌丝霉素片段，连接至同样经过PmeI和EcoRI双酶切处理的pPIC9K载体片段，得到第二个菌丝霉素表达载体pPIC9K-NZ2114。该表达载体整合至His4位点，菌丝霉素表达方式与第一个表达载体一样。
连接产物42℃热激转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于LB抗性平板，37℃过夜培养至长出单菌落。利用验证引物：
5AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ （SEQ ID No.5），
3AOX-R：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ （SEQ ID No.6），挑单菌落菌落PCR验证阳性转化子，目的条带约0.7kb（如图5所示）。挑取阳性转化子测序，正确菌株保存于甘油管中。
1.4 第三个表达载体pPIC6αA-NZ2114的构建
请参阅图3，PmeI和EcoRI双酶切处理pTRP-NZ2114表达载体得到菌丝霉素片段，连接至同样经过PmeI和EcoRI双酶切处理的pPIC6αA载体片段，得到第三个菌丝霉素表达载体pPIC6αA-NZ2114。该表达载体整合至AOX1位点，菌丝霉素表达方式与第一个表达载体和第二个达载体一样。
连接产物42℃热激转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于LB抗性平板，37℃过夜培养至长出单菌落。利用验证引物：
5AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，
3AOX-R：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，挑单菌落菌落PCR验证阳性转化子，目的条带约0.7kb（如图5所示）。挑取阳性转化子测序，正确菌株保存于甘油管中。
实施例2 菌丝霉素工程菌的构建
请参阅图6，SpeI限制性内切酶单酶切处理pTRP-NZ2114表达载体，切胶回收线性化表达载体，电转（1.5-2.5kv）至X33毕赤酵母感受态细胞或其他毕赤酵母如GS115、SMD1168等，菌液涂布于YPD平板（含0.25-4mg/mL博来霉素），30℃培养2-3天，直至长出单菌落。挑取单菌落，培养评价菌丝霉素的表达，发酵上清液稀释一定倍数后检测抑菌圈大小，选择最优菌株PLE-1进行下一步实验。
如图7所示，SalI限制性内切酶单酶切处理pPIC9K-NZ2114表达载体，切胶回收线性化表达载体，电转（1.5-2.5kv）至PLE-1感受态细胞，菌液涂布于YPD平板（含0.25-4mg/mLG418），30℃培养2-3天，直至长出单菌落。挑取单菌落，培养评价菌丝霉素的表达，发酵上清液稀释一定倍数后检测抑菌圈大小，选择最优菌株PLE-2进行下一步实验。
如图8所示，PmeI限制性内切酶单酶切处理p PIC6αA-NZ2114表达载体，切胶回收线性化表达载体，电转（1.5-2.5kv）至PLE-2感受态细胞，菌液涂布于YPD平板（含0.1-1mg/ml Blasticidin），30℃培养2-3天，直至长出单菌落。挑取单菌落，培养评价菌丝霉素的表达，发酵上清液稀释一定倍数后检测抑菌圈大小，选择最优菌株PLE-3。
实施例3 重组菌丝霉素的诱导表达
挑取实施例2中制备的表达菌丝霉素的毕赤酵母细胞，接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备一级种子液。
取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中制备二级种子液，30℃，220rpm培养24小时。
二级种子液全部接种于5L发酵罐（2L BSM培养基），控制温度30℃±0.5℃，溶氧20%±5%，pH=5.0±0.5。
基础甘油耗尽后，流加10%甘油，甘油耗尽后直至溶氧上升至90%，饥饿半小时，流加甲醇诱导菌丝霉素表达，共诱导72小时，离心（6000Ｘg，5min）取发酵上清液进行检测。
实施例4 重组菌丝霉素蛋白浓度检测和蛋白电泳
Bradford法（又称为考马斯蓝染色法）测定上清液总蛋白浓度，结果显示，PLE-1、PLE-2、PLE-3菌株诱导72小时发酵上清液的总蛋白浓度分别为：2.5g/L、5.4g/L、6.8g/L。
Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳分析发酵上清液菌丝霉素含量，蛋白电泳结果如图9所示，在3～6KD之间有目标大小的蛋白条带，蛋白条带的分子量大小与菌丝霉素分子量相近，约为4.4KD。通过软件分析，菌丝霉素蛋白含量90%以上。随着三种菌丝霉素表达载体的导入，菌丝霉素工程菌株的表达量依次增大，发酵上清液中总蛋白浓度最高为6.8g/L，其中菌丝霉素含量达到6.1g/L。
实施例5 重组菌丝霉素质谱检测
请参阅图10，将实施例4中蛋白电泳胶的目标条带切下来进行质谱分析，质谱图在4412.70处有最高峰，菌丝霉素NZ2114理论分子量为4413.92，检测结果与预测结果一致，可初步判断毕赤酵母工程菌表达的物质是菌丝霉素NZ2114。
实施例6 重组菌丝霉素抑菌圈检测
将指示菌（金黄色葡萄球菌CMCC26003、金黄色葡萄球菌ATCC25923、耐药金黄色葡萄球菌N14、鸡源产气荚膜梭菌CVCC2027、猪源产气荚膜梭菌CVCC2038以及从罗非鱼分离得到的致病菌诺卡氏菌）接种于相应的培养基中培养制备指示菌液。用生理盐水稀释至OD625=2.3（OD625，指某种溶液在625nm波长处的吸光值），取100μL 稀释指示菌液至100mL相应的固体培养基（温度50-55℃），混匀，取10.5mL固体培养基至标准培养皿，冷却凝固，利用打孔器打孔，每孔添加5μL发酵上清液，阳性对照样品为5μg氨苄青霉素（Amp），盖上陶瓦盖，置于37℃培养箱培养16小时，结果如图11所示，制备的菌丝霉素发酵液对金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌和诺卡氏菌具有很好的抑菌效果，尤其是对耐药金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌作用。
实施例7 菌株稳定性评价
通过连续传代培养评价菌株稳定性。
挑取实施例2中所制备的表达菌丝霉素的毕赤酵母细胞菌落接种于3mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备种子液。取0.5mL种子液接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时。菌液转移到50 mL离心管中，离心（6000 ×g，5 min）后弃上清，用25mL甲醇浓度为1%的BMMY培养基重悬菌体，菌液转移到250mL三角瓶中，30℃，220 rpm培养72小时，每24小时添加甲醇至1%浓度。离心（6000 ×g，5 min）后取发酵上清液进行菌丝霉素的最低抑菌浓度检测（MIC）。
挑取筛选菌株，连续传代培养10代，检测发酵上清液最低抑菌浓度MIC，结果显示每一代菌株的摇瓶发酵上清液的MIC=1/500，说明菌株稳定性良好。
综上所述，本发明提供了一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，所述毕赤酵母通过3种菌丝霉素表达载体转化，每一次转化利用不同的抗生素进行高拷贝菌株筛选，得到菌丝霉素高表达量的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母中菌丝霉素的最高表达量达6.0g/L，大大高出目前已公开的技术；同时三种表达载体选用三种不同的整合位点，提高了多拷贝菌株中基因组的菌丝霉素表达盒的分散性，在一定程度上减少了菌丝霉素表达盒拷贝数的丢失，从而提高菌株的稳定性。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 广东海纳川生物科技股份有限公司
<120> 一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母
<160> 6
<210> 1
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtttcggtt gtaacggacc ttggaacgaa gatgatctga ggtgccataa tcactgtaag 60
tcaatcaagg gatataaggg aggttactgt gccaaaggtg gatttgtttg caaatgctac 120
taa 123
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> 菌丝霉素NZ2114
<400> 2
Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asn Glu Asp Asp Leu Arg Cys His
1 5 10 15
Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr
35 40
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcatcaccc ttgagcccaa ctctc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttcttctct tgtcttataa tattt 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (10)

1.一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母,其特征在于，该毕赤酵母分别经过三种不同菌丝霉素表达载体转化，并且每次转化得到的菌株选用不同的抗生素高拷贝筛选；
其中，所述菌丝霉素表达载体依次为：pTRP-NZ2114、pPIC9K-NZ2114、pPIC6αA-NZ2114。
2.根据权利要求1所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X-33基因工程菌，所述菌丝霉素包括如SEQ ID No.1所示的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.25～4mg/mL的博来霉素。
4.根据权利要求3所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，所述菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114转化的感受态细胞包括毕赤酵母X-33、毕赤酵母GS115、毕赤酵母SMD1168。
5.根据权利要求1所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pPIC9K-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.25～4mg/mLG418。
6.根据权利要求1所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pPIC6αA-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.1-1mg/mLBlasticidin。
7.根据权利要求1所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，所述的菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114的载体骨架为pPICzαA,整合位点为毕赤酵母基因组TRP2基因片段，所述的表达载体pPIC9K-NZ2114的整合位点为His4，所述的表达载体pPIC6αA-NZ2114的整合位点为AOX1。
8.根据权利要求7所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，所述的TRP2基因片段的5’端连接有BamHI酶切位点GGATCC，TRP2基因片段3’端添加BglII酶切位点AGATCT。
9.根据权利要求1所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，所述重组菌丝霉素的诱导表达方法包括以下步骤：
S001.制备种子液：挑选经上述三种表达载体转化后制备的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母细胞，接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备得到一级种子液；取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备得到二级种子液；
S002.发酵培养：将步骤S001中制备的二级种子液全部接种于5L发酵罐中，加入2L BSM培养基，控制温度30℃±0.5℃，溶氧20%±5%，PH为5.0±0.5；
S003.饲喂碳源：步骤S002的培养基中的甘油耗尽后，流加10%甘油；
S004.甲醇诱导：步骤S003的培养基中的甘油耗尽后，直至溶氧上升至90%，饥饿半小时，流加甲醇诱导菌丝霉素表达，共诱导72h。
10.根据权利要求1-9任一项所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其特征在于，其保藏编号为GDMCC No.60234。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109825523A (zh) * 2019-01-07 2019-05-31 广东海纳川生物科技股份有限公司 多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法
CN112626104A (zh) * 2020-12-24 2021-04-09 长沙中科晶博生物科技有限公司 一种用毕赤酵母生产菌丝霉素的方法
CN114317303A (zh) * 2021-12-17 2022-04-12 广东海纳川生物科技股份有限公司 一种分泌表达重组蝽防御素tha的重组毕赤酵母及其构建和表达方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1850861A1 (en) * 2005-02-08 2007-11-07 Novozymes A/S Systemic treatment of infections with defensins
CN101955958A (zh) * 2010-08-17 2011-01-26 华南理工大学 木聚糖酶的基因、质粒、菌株及应用
CN102191255A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 中国农业科学院饲料研究所 重组菌丝霉素的制备及其应用
WO2012037774A1 (zh) * 2010-09-26 2012-03-29 中国农业科学院饲料研究所 多拷贝高效表达重组菌丝霉素的酵母菌
CN103045636A (zh) * 2012-12-17 2013-04-17 中国农业科学院饲料研究所 在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽nz2114的方法
CN103319586A (zh) * 2013-06-24 2013-09-25 中国农业科学院饲料研究所 抗耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌肽mp1102、其制备方法及应用
CN103333912A (zh) * 2013-06-19 2013-10-02 中国农业科学院饲料研究所 在Pichia pastoris中组成型表达菌丝霉素衍生物MP1102的方法
CN106434735A (zh) * 2016-10-12 2017-02-22 江南大学 一种提高木质纤维素基质水解酶产量的方法
CN106554396A (zh) * 2016-11-25 2017-04-05 东北农业大学 一种利用枯草芽孢杆菌表达的菌丝霉素及表达方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1850861A1 (en) * 2005-02-08 2007-11-07 Novozymes A/S Systemic treatment of infections with defensins
CN102191255A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 中国农业科学院饲料研究所 重组菌丝霉素的制备及其应用
CN101955958A (zh) * 2010-08-17 2011-01-26 华南理工大学 木聚糖酶的基因、质粒、菌株及应用
WO2012037774A1 (zh) * 2010-09-26 2012-03-29 中国农业科学院饲料研究所 多拷贝高效表达重组菌丝霉素的酵母菌
CN102409003A (zh) * 2010-09-26 2012-04-11 中国农业科学院饲料研究所 多拷贝高效表达重组菌丝霉素的毕赤酵母
CN103045636A (zh) * 2012-12-17 2013-04-17 中国农业科学院饲料研究所 在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽nz2114的方法
CN103333912A (zh) * 2013-06-19 2013-10-02 中国农业科学院饲料研究所 在Pichia pastoris中组成型表达菌丝霉素衍生物MP1102的方法
CN103319586A (zh) * 2013-06-24 2013-09-25 中国农业科学院饲料研究所 抗耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌肽mp1102、其制备方法及应用
CN106434735A (zh) * 2016-10-12 2017-02-22 江南大学 一种提高木质纤维素基质水解酶产量的方法
CN106554396A (zh) * 2016-11-25 2017-04-05 东北农业大学 一种利用枯草芽孢杆菌表达的菌丝霉素及表达方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YONG ZHANG ET AL.: "High Expression of a Plectasin-Derived Peptide NZ2114 in Pichia Pastoris and Its Pharmacodynamics, Postantibiotic and Synergy Against Staphylococcus Aureus", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
李洪金等: "菌丝霉素NZ2114毕赤酵母工程菌高效发酵工艺的研究", 《广东饲料》 *
盛祖嘉 等: "《微生物遗传学综述文集》", 30 November 1993, 复旦大学出版社 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109825523A (zh) * 2019-01-07 2019-05-31 广东海纳川生物科技股份有限公司 多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法
CN112626104A (zh) * 2020-12-24 2021-04-09 长沙中科晶博生物科技有限公司 一种用毕赤酵母生产菌丝霉素的方法
CN114317303A (zh) * 2021-12-17 2022-04-12 广东海纳川生物科技股份有限公司 一种分泌表达重组蝽防御素tha的重组毕赤酵母及其构建和表达方法

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