CN107586790A - 一种鸡Fowlicidins‑1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种鸡Fowlicidins‑1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法。本发明利用pPIC9K载体与Fowlicidin‑1优化序列构建出甲醇诱导性毕赤酵母表达菌株SMDFW，通过优化甲醇诱导、表达条件，成功高效表达了具有生物活性的鸡Fowlicidins‑1抗菌肽。

Description

一种鸡Fowlicidins-1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种鸡Fowlicidins-1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法。

背景技术

鸡Fowlicidins是一种线性阳离子小分子多肽，具有很强的盐不依赖性的广谱抗菌活性，能作用于G+、G-细菌甚至是抗性菌株，并且具有LPS结合活性和中和活性，成为潜在的理想抗菌药物。其衍生产物Fowlicidin-1是由26个氨基酸残基组成的阳离子型抗菌肽，本身不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种极具应用潜力的健康安全的抗生素替代物。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种鸡Fowlicidins-1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种鸡Fowlicidins-1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法，包括以下步骤：

（1）、构建重组菌株SMDFW

1.1、依据Fowlicidin-1氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子的使用偏好性，设计如SEQID No.1所示的Fowlicidin-1核苷酸序列；

1.2、将pPIC9K载体和Fowlicidin-1核苷酸序列分别进行EcoR I和Not I双酶切；

1.3、将双酶切产物连接后，获得重组载体pPIC9K-Fowlicidin-1；

1.4、将重组载体pPIC9K-Fowlicidin-1转化至毕赤酵母菌SMD1168感受态细胞；取转化菌液均匀凃于MD平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，获得重组菌株SMDFW，冻干备用；

（2）、种子发酵培养：

将冻干菌株SMDFW接入种子发酵培养基中，28~30 ℃、200~250 rpm振摇培养，待菌体浓度增长至OD₆₀₀=2.0~4.0时，按照上一级培养液∶下一级种子发酵培养基≤1∶10的体积比逐级扩大培养，扩大培养的条件为：搅拌速率450~550 rpm、通气量1.5~2 .5vvm、时间22~24h；

（3）、诱导发酵培养

将步骤（2）所得种子发酵培养液按≤1∶4的体积比接入诱导发酵培养基中，在搅拌速率450~550 rpm、通气量1.5~2 .5vvm条件下发酵；在该过程中，利用氨水稳定发酵液的pH为6.0~6.2，同时监测溶氧量；

（4）、流加补料

4.1、在步骤（3）诱导发酵培养液的溶氧量开始上升时，开始流加温度≥30 ℃的葡萄糖溶液；每500 L步骤（2）所得种子发酵培养液流加葡萄糖溶液330~350 L，流加时间为13~15h；在该过程中，控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量>20%；

4.2、流加葡萄糖溶液完毕后，待溶氧量上升至80~85%后，计时2.5~3h；

4.3、利用氨水将发酵液的pH调至6.6~7.0，加入蛋白胨与酵母粉的混合液后，计时30 ~35min；每500 L步骤（2）所得种子发酵培养液加蛋白胨与酵母粉的混合液330~350 L；

4.4、控制发酵液温度在29±0.2℃，开始多点均匀同时流加甲醇和维生素溶液，其中甲醇中含有12~13 mL/L的微量元素溶液，甲醇的流加总速度为7400~7500 mL/h，维生素溶液的总流加速度为90~95 mL/h，在该过程中，也控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量>20%，待流加58~60 h后，结束反应，收集发酵液上清；

上述步骤中：

以1L计，所述种子发酵培养基的组成为：磷酸二氢钾11.0~12.0g、磷酸氢二钾2.0~2.5g、七水硫酸镁9.0~11.0g、硫酸铵9.0~11.0g、氯化钙0.30~0.35g、氯化钠0.8~1.2g、氯化钾0.8~1.2g、葡萄糖 25~35g、维生素溶液0.8~1.2mL、微量元素溶液4.0~4.5mL，余量为水；pH为6.0~6.2；

以1L计，所述诱导发酵培养基的组成为：浓磷酸26.5~ 27.0mL、硫酸钙0.90~0.95g、硫酸钾18.0~18.5g、七水硫酸镁14.5~15.0g、氢氧化钾4.0~4.2g、葡萄糖 25~35g、维生素溶液0.8~1.2mL、微量元素溶液4.0~4.5mL，余量为水；pH为6.0~6.2；

以1L计，所述葡萄糖溶液的组成为：葡萄糖450~550g、维生素溶液3.6~4.4mL、微量元素溶液11~13mL，余量为水；

以350 L计，所述蛋白胨与酵母粉的混合液的组成为：45~55 kg蛋白胨、20~30 kg酵母粉，余量为水；

以1L计，所述维生素溶液的组成为：生物素0.7~0.9g、泛酸钙18~22g、维生素B1 14~16g、肌醇15~17g、烟酸9~11g、维生素B6 3~5g，余量为水；pH为7.0~7.2；

以1L计，所述微量元素溶液的组成为：五水硫酸铜 5.5~6.0g、碘化钠 0.08~0.09g、硫酸锰3.0~3.2g、钼酸钠0.2~0.3g、硼酸0.02~0.03g、氯化钴0.5~0.6g、氯化锌20~22g、七水硫酸亚铁65~70g、浓硫酸4~5mL。

有益效果：本发明利用pPIC9K载体与Fowlicidin-1优化序列构建出甲醇诱导性毕赤酵母表达菌株SMDFW，通过优化甲醇诱导、表达条件，成功高效表达了具有生物活性的鸡Fowlicidins-1抗菌肽。

附图说明

图1：pPIC9K载体的结构示意图；

图2：实施例1发酵上清液的HPLC图谱；

图3：实施例1发酵上清液的质谱图谱；

图4：实施例1发酵上清液不同添加量的抑菌效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

一种鸡Fowlicidins-1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法，包括以下步骤：

（1）、构建重组菌株SMDFW

1.1、依据Fowlicidin-1氨基酸序列：RVKRVWPLVIRTVIAGYNLYRAIKKK，按照毕赤酵母密码子的使用偏好性，设计如SEQ ID No.1所示的Fowlicidin-1核苷酸序列（由北京赛百盛基因技术有限公司合成）；

1.2、将pPIC9K载体（购自Invitrogen公司）和Fowlicidin-1核苷酸序列分别进行EcoRI（购自Sigma）和Not I（购自Sigma）双酶切；其中，双酶切体系为：Fowlicidin-1 或 pPIC9K载体DNA 4μg、EcoR I 0.5μL、Not I 0.5μL、H buffer 1μL、灭菌水补足 20μL；置于37 ℃反应5 h；

1.3、将双酶切产物电泳验证后进行T4连接，获得重组载体pPIC9K-Fowlicidin-1；其中，连接体系为：Fowlicidin-1双酶切产物 12μL、pPIC9K载体双酶切产物 4 μL、T4连接酶2μL、10×T4连接酶缓冲液 2μL；于16°C连接12h；

1.4、用电转法将重组载体pPIC9K-Fowlicidin-1转化至毕赤酵母菌SMD1168感受态细胞；取转化菌液均匀凃于MD平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，获得重组菌株SMDFW，冻干备用；

（2）、种子发酵培养：

将冻干菌株1g直接接入装有1L种子发酵培养基的三角瓶中，30 ℃、200~250 rpm振摇培养，待菌体浓度增长至OD₆₀₀=3.0时，通过显微镜镜检不存在任何细菌污染时，方可转接至装有10L种子发酵培养基的种子发酵罐中，10L发酵罐的参数为：搅拌速率500 rpm、通气量2vvm，发酵24h后待菌体浓度较高后，按照1：10比例继续转接至装有100L种子发酵培养基的种子发酵罐中，100L发酵罐的参数为：搅拌速率500 rpm、通气量2 vvm，发酵24h后，按照上述方案逐渐扩大种子培养，但是转接比例应该等于1：10；直至扩大到够下一步使用；

（3）、诱导发酵培养

在5000L发酵罐中投入2000L诱导发酵培养基，然后将500L步骤（2）所得种子发酵培养液接入5000L发酵罐中，将通气量调至2vvm（每分钟通气量与发酵罐实际料液体积的比值），搅拌转速调至500rpm下发酵；发酵过程中，利用浓氨水稳定发酵液的pH为6.0，同时利用溶氧电极监测溶氧量，大约14 h后发酵液内溶氧量开始上升；

（4）、流加补料

4.1、在步骤（3）诱导发酵培养液的溶氧量开始上升时，开始流加350 L 、30 ℃的葡萄糖溶液，流加时间为14 h；在该过程中控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量>20%；

4.2、流加葡萄糖溶液完毕后，待溶氧量上升至80%后，计时3 h；

4.3、利用浓氨水将发酵液的pH调至6.8，向发酵罐中打入350L蛋白胨与酵母粉的混合液后，计时30 min；此时关闭发酵罐对pH的自动控制功能；

4.4、将发酵罐罐温调节至29 ℃，并且发酵全程控温开度为0.2 ℃，开始多点（三点以上）均匀同时流加甲醇和维生素溶液，其中甲醇中含有12 mL/L的微量元素溶液，甲醇的流加总速度为7500 mL/h，维生素溶液的总流加速度为90 mL/h，在该过程中也控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量>20%，待流加24 h后罐体pH会上升至7.2左右，继续培养至48 h后罐体pH会开始下降至6.8，继续流加至60 h后可以下罐，结束反应，收集发酵液上清；

上述步骤中：

以1L计，所述MD平板培养基的组成为：13.4g蛋白胨、0.4mg生物素、20g葡萄糖、15g琼脂粉，余量为水；

以1L计，所述种子发酵培养基的组成为：磷酸二氢钾11.83g、磷酸氢二钾2.29g、七水硫酸镁10g、硫酸铵10g、氯化钙0.33g、氯化钠1g、氯化钾1g、葡萄糖 30g、维生素溶液1mL、微量元素溶液4.35mL，余量为水；pH为6.0；

以1L计，所述诱导发酵培养基的组成为：浓磷酸（85%）26.7mL、硫酸钙0.93g、硫酸钾18.2g、七水硫酸镁14.9g、氢氧化钾4.13g、葡萄糖 30g、维生素溶液1mL、微量元素溶液4.35mL，余量为水；pH为6.0；

以1L计，所述葡萄糖溶液的组成为：葡萄糖500g、维生素溶液4mL、微量元素溶液12mL，余量为水；

以350 L计，所述蛋白胨与酵母粉的混合液的组成为：50 kg蛋白胨、25 kg酵母粉，余量为水；

以1L计，所述维生素溶液的组成为：生物素0.8g、泛酸钙20g、维生素B1 15g、肌醇16g、烟酸10g、维生素B6 4g，余量为水；用1M KOH调pH为7.0~7.2；0.22μm过滤除菌后低温保存；

以1L计，所述微量元素溶液的组成为：五水硫酸铜 6g、碘化钠 0.08g、硫酸锰3g、钼酸钠0.2g、硼酸0.02g、氯化钴0.5g、氯化锌20g、七水硫酸亚铁65g、浓硫酸（98%）5mL；0.22μm过滤除菌后避光保存。

操作注意事项如下：

1、所述维生素溶液配制：将所有维生素溶液中的所有物质混合后，不断搅拌并用氢氧化钾将pH调节至7.0-7.2，此时溶液中所有的沉淀物将会全部溶解（不全部溶解的话其中的生物素会被过滤掉，这样会对酵母生长产生极大的影响）；先用0.22μM滤膜进行预过滤，此时可以去掉其中90%左右的细菌，过滤完毕后的维生素溶液可以在常温使用2天；在使用之前需要再进行二次过滤可以避免污染；

2、所述微量元素溶液配制：微量元素的所有物质混合后，需要不断加水搅拌至完全溶解（约需要40分钟），先用0.22μM滤膜进行预过滤，此时可以去掉其中90%左右的细菌，在使用之前需要再进行二次过滤可以避免污染，过滤完毕后的微量元素溶液为常温保存，保存期间必需为避光；

3、所述葡萄糖溶液流加注意事项：当流加葡萄糖溶液时，应该保证发酵液中的溶氧值>20%，如果溶氧值过低会导致发酵液中大量富集乳酸（可以抑制酵母生长）、发酵液中产生乙醇（非常低浓度的乙醇就可以极大程度上抑制甲醇诱导启动子的活性）；另外溶氧值过低会导致发酵过程中葡萄糖的浪费，最终导致菌体浓度上不去影响肽的产量；而流加过慢会导致菌体饥饿、生长缓慢、浪费能耗；因此流加过程中应该控制溶氧值为25%-65%之间；

4、所述葡萄糖溶液流加完毕后的注意事项：当流加完毕葡萄糖后，发酵液的溶氧会逐渐上升，待上升至80%以上后，开始计时3h以后方可流加甲醇，此时发酵液中应该不存在任何的葡萄糖；

5、所述甲醇流加注意事项：当流加甲醇时，应该尽量做到甲醇多点（3点以上）流加，因为流加甲醇如果不能及时混匀会导致甲醇局部含量过高；甲醇局部浓度过高会抑制蛋白表达，当积累的再高一点时会导致杀灭酵母菌株；甲醇流加过程中会导致罐体温度上升，如果罐温整体超过32℃时，局部温度已经超过了34℃，此时毕赤酵母将不会表达抗菌肽，因此甲醇流加之前应将罐温控制从30℃调节至29℃，并且发酵全程控温开度为0.2℃；甲醇流加过程中应该保证溶氧大于20%。

6、避免蛋白胨、酵母粉来源差异对甲醇代谢的影响：由于有些蛋白胨与酵母粉中还是含有少量的糖类物质，而这些物质可以对甲醇诱导产生极大的影响，因此在流加完毕葡萄糖溶液完毕计时3小时后可以先将蛋白胨、酵母粉溶液打入罐中后，让菌株利用其中的糖类30分钟后再对甲醇进行流加；

7、本发明操作必需保证足够的转速以及液体在三角瓶中的体积比例相对较低，从而保证菌株在生长过程中的氧气需求量足够；由于氧气需求量在后期生长过程中较高，如果氧气不足会导致发酵液中富集大量的乳酸、乙酸以及乙醇，这三种成分会在很大程度上抑制酵母菌的生长，并且溶液中乙醇含量如果超过0.5%，则会对后期甲醇诱导产生较大的抑制效应。

表达产物的鉴定：

1、将收集发酵液所得的上清通过0.22μm滤膜过滤，取1-5L过滤液进行冻干；将冻干后的冻干粉重溶于1/10过滤液体积的去离子水中；

2、在1KD截留透析袋中透析：透析所用的buffer为20mM磷酸钾盐缓冲液，pH=6.8；在室温中透析4次，每次2小时；待透析袋内的离子强度与20mM磷酸钾盐缓冲液相同时，将透析袋内的溶液取出；

3、用10KD超滤离心管对透析完毕的溶液进行超滤离心，取超滤出来的蛋白液体（分子量<10KD）备用；

4、将阳离子交换柱（sepharose-SP）用20mM磷酸钾盐缓冲液，pH=6.8进行平衡，平衡3-5个柱体积，流速为0.1柱体积/分钟；

5、将上述超滤出来的蛋白液体上柱，流速为0.1柱体积/分钟；

6、上柱完毕后用20mM磷酸钾盐缓冲液，pH=6.8对柱上未结合蛋白进行清洗，清洗3-5个柱体积；

7、用含有0.6M NaCl的20mM磷酸钾盐缓冲液，pH=6.8对蛋白进行洗脱，用紫外检测器检测蛋白洗脱情况；

8、将上述洗脱下来的组分用1KD截留透析袋以及20mM磷酸钾盐缓冲液，pH=6.8进行透析，在室温中透析4次，每次2小时；冻干，将冻干粉重新溶解于50v%乙腈溶液中，用HPLC进行分离，分离条件如下：分离柱：C18 液相色谱柱；流动相：0.1%三氟乙酸水溶液∶0.1%三氟乙酸乙腈溶液=1∶1（体积比）；流速：1mL/min；检测波长：214nm；柱温：30℃。

在上述HPLC条件下，检测结果见图2。由图2可知：可以检测到三个峰，峰位置分别为19.928 min、20.866 min、21.520 min。将上述获得的三个峰分别做质谱检测，Fowlicidin-1可以在20.866 min的峰处检测到，结果见图3。Fowlicidin-1的序列是：RVKRVWPLVIRTVIAGYNLYRAIKKK，因此理论分子量为3141.86。图3质谱图表明[M+6H]6+=524.55，该值换算实际分子量的方法是：（524.55*6）-6=3141.3。该分子量与理论分子量相似，因此Fowlicidin-1被检测到。

抑菌活性：

抑菌活性检测过程中由于抗菌肽会被细菌分泌的蛋白酶逐渐降解，因此检测活性过程中应首先将发酵上清液进行离心、过滤，再将过滤液的pH调至5.0~5.2。利用NB琼脂培养基以及新鲜的大肠杆菌进行抑菌测试：将NB琼脂培养基灭菌后混入大肠杆菌，倒平板，先在NB琼脂培养基上打孔，然后每孔加入不同添加量的发酵上清液，加入3h后需要将测试平板对光观察抑菌圈大小（如果此时菌体尚未长起来，请每隔20min再对平板进行观察，切忌将平板在37℃放置过夜）。同时以200μL SMD1168感受态细胞培养上清为阴性对照， SMD1168感受态细胞培养上清是将SMD1168感受态细胞在NB培养基中30℃培养12h后所得上清液。其中，所述NB琼脂培养基配方（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉粉3.0、氯化钠5.0、琼脂粉 15.0，调pH值7.2 ± 0.2 ，115℃高压30min；所述NB培养基配方（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉粉3.0、氯化钠5.0，调pH值7.2 ± 0.2 ，115℃高压30min。

图4为本发明生产Fowlicidin-1发酵上清液抑菌的效果，下表为本发明生产Fowlicidin-1发酵上清液不同添加量抑菌效果。可知：本发明分泌表达的产物具有较高的抑菌活性。

序列表

<110> 河南牧翔动物药业有限公司

信阳农林学院

河南牧翔科技有限公司

<120> 一种鸡Fowlicidins-1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法

<141> 2017-11-11

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cttaagaaaa gacgtgtcaa aagggtttgg cctcttgtga taaggaccgt tatagccggt 60

tacaacttat atcgtgcaat aaaaaacgcc ggcg 94

Claims (1)

1.一种鸡Fowlicidins-1抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、构建重组菌株SMDFW

1.1、依据Fowlicidin-1氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子的使用偏好性，设计如SEQID No.1所示的Fowlicidin-1核苷酸序列；

1.2、将pPIC9K载体和Fowlicidin-1核苷酸序列分别进行EcoR I和Not I双酶切；

1.3、将双酶切产物连接后，获得重组载体pPIC9K-Fowlicidin-1；

1.4、将重组载体pPIC9K-Fowlicidin-1转化至毕赤酵母菌SMD1168感受态细胞；取转化菌液均匀凃于MD平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，获得重组菌株SMDFW，冻干备用；

（2）、种子发酵培养：

将冻干菌株SMDFW接入种子发酵培养基中，28~30 ℃、200~250 rpm振摇培养，待菌体浓度增长至OD₆₀₀ =2.0~4.0时，按照上一级培养液∶下一级种子发酵培养基≤1∶10的体积比逐级扩大培养，扩大培养的条件为：搅拌速率450~550 rpm、通气量1.5~2 .5vvm、时间22~24h；

（3）、诱导发酵培养

将步骤（2）所得种子发酵培养液按≤1∶4的体积比接入诱导发酵培养基中，在搅拌速率450~550 rpm、通气量1.5~2 .5vvm条件下发酵；在该过程中，利用氨水稳定发酵液的pH为6.0~6.2，同时监测溶氧量；

（4）、流加补料

4.1、在步骤（3）诱导发酵培养液的溶氧量开始上升时，开始流加温度≥30 ℃的葡萄糖溶液；每500 L步骤（2）所得种子发酵培养液流加葡萄糖溶液330~350 L，流加时间为13~15h；在该过程中，控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量>20%；

4.2、流加葡萄糖溶液完毕后，待溶氧量上升至80~85%后，计时2.5~3h；

4.3、利用氨水将发酵液的pH调至6.6~7.0，加入蛋白胨与酵母粉的混合液后，计时30 ~35min；每500 L步骤（2）所得种子发酵培养液加蛋白胨与酵母粉的混合液330~350 L；

4.4、控制发酵液温度在29±0.2℃，开始多点均匀同时流加甲醇和维生素溶液，其中甲醇中含有12~13 mL/L的微量元素溶液，甲醇的流加总速度为7400~7500 mL/h，维生素溶液的总流加速度为90~95 mL/h，在该过程中，也控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量>20%，待流加58~60 h后，结束反应，收集发酵液上清；

上述步骤中：

以1L计，所述种子发酵培养基的组成为：磷酸二氢钾11.0~12.0g、磷酸氢二钾2.0~2.5g、七水硫酸镁9.0~11.0g、硫酸铵9.0~11.0g、氯化钙0.30~0.35g、氯化钠0.8~1.2g、氯化钾0.8~1.2g、葡萄糖 25~35g、维生素溶液0.8~1.2mL、微量元素溶液4.0~4.5mL，余量为水；pH为6.0~6.2；

以1L计，所述诱导发酵培养基的组成为：浓磷酸26.5~ 27.0mL、硫酸钙0.90~0.95g、硫酸钾18.0~18.5g、七水硫酸镁14.5~15.0g、氢氧化钾4.0~4.2g、葡萄糖 25~35g、维生素溶液0.8~1.2mL、微量元素溶液4.0~4.5mL，余量为水；pH为6.0~6.2；

以1L计，所述葡萄糖溶液的组成为：葡萄糖450~550g、维生素溶液3.6~4.4mL、微量元素溶液11~13mL，余量为水；

以350 L计，所述蛋白胨与酵母粉的混合液的组成为：45~55 kg蛋白胨、20~30 kg酵母粉，余量为水；

以1L计，所述维生素溶液的组成为：生物素0.7~0.9g、泛酸钙18~22g、维生素B1 14~16g、肌醇15~17g、烟酸9~11g、维生素B6 3~5g，余量为水；pH为7.0~7.2；

以1L计，所述微量元素溶液的组成为：五水硫酸铜 5.5~6.0g、碘化钠 0.08~0.09g、硫酸锰3.0~3.2g、钼酸钠0.2~0.3g、硼酸0.02~0.03g、氯化钴0.5~0.6g、氯化锌20~22g、七水硫酸亚铁65~70g、浓硫酸4~5mL。