CN101845454A - 在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在毕赤酵母细胞中以组成型方式表达和生产假黑盘菌素成熟多肽重组蛋白的方法，其包括：1)优化假黑盘菌素成熟多肽基因；2)采用分子克隆等方法得到毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子DNA序列，将假黑盘菌素成熟多肽基因置于甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控之下，与质粒连接得到新的、组成型和分泌型的毕赤酵母高效表达载体；3)利用该载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母菌株产生具有生物活性的假黑盘菌素成熟多肽；4)对该工程菌株高密度发酵条件以及重组蛋白的表达和纯化进行优化。采用本发明方法制备得到的假黑盘菌素成熟多肽可应用于医疗、食品、饲料及科研等领域，适于规模化生产假黑盘菌素蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽的方法。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是指一类由12～100个氨基酸组成，带有净正电荷，表现两亲性的且具有抗菌活性的小分子多肽的总称。有关抗菌肽的研究已经有50多年的历史，迄今为止，已鉴定各种不同生物来源的抗菌肽约有880种(Brogden K A，2005)。抗菌肽由于其广谱的抗菌活性(包括针对革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌、真菌、甚至某些病毒等)而日益受到人们的关注。特别是过去数十年中，由于抗生素的滥用而导致带有抗生素抗性的致病菌株不断出现，急需开发新型的抗菌药物。抗菌肽因其存在着巨大的药用潜力因而有望成为抗生素的替代品之一。因此，近年来有关抗菌肽的研究进展迅速，包括抗菌肽的纯化、表征、基因克隆和重组表达、蛋白晶体结构的解析、结构与功能关系等研究领域，人们对抗菌肽的了解越来越广泛和深入。
2003年，Mygind等人(Mygind P H.等，2005)首次报道从一种丝状腐生真菌-假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)中鉴定和纯化出一种defensin家族的抗菌肽-假黑盘菌素(plectasin)，并解析了该多肽的三维结构(PDB ID：1ZFU)。假黑盘菌素的氨基酸序列和结构分析表明，它具有哺乳动物抗菌肽defensins家族的特征，但它的二硫键排列方式又不同于任何一种亚家族，而与昆虫来源的一些defensins相同。通过体外抑菌实验，发现假黑盘菌素对多种常见的人类革兰氏阳性病原细菌-包括对抗生素敏感型及其耐药菌株都具有较强的抗菌能力(如表1所示)，而且其抑菌浓度与杀菌浓度并无多大差异。
表1假黑盘菌素可作用于多种革兰氏阳性病原细菌
| 链球菌属(Streptococcus) | 葡萄球菌属(Staphylococcus) | 肠道球菌属(Enterococcus) | 棒状杆菌属(Corynebacterium) | 芽孢杆菌属(Bacillus) |
| S.pneumoniae | S.aureus | E.faecalis | C.diphtheriae | B.cereus |
| S.pneumoniae PRSP(青霉素抗性) | S.aureus MRSA(二甲氧基苯青霉素抗性) | E.faecium | C.jeikeium | B.thuringiensis |
| S.pyogenes | S.epidermiadis | Misc.Bacillus | ||
| S.pyogenes ERSP(红霉素抗性) | S.epidermidis MRSE(二甲氧基苯青霉素抗性) | E.faecium VREF(万古霉素抗性) | ||
| Misc.(Group B，C，G) | Misc.(Staphylococci) |
利用生物工程的方法构建转基因工程菌来生产抗菌肽正逐渐成为研究热点，Mygind等人曾将假黑盘菌素全基因导入米曲霉或黑曲霉中得到重组表达，其中米曲霉的表达量较高，达到了10～50mg/L。
毕赤酵母(Pichia pastoris)是应用最为广泛的外源蛋白表达宿主菌，它是甲醇营养型酵母中的一种，能够在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长，这类酵母还包括汉逊酵母、假丝酵母和球拟酵母等(熊向华，2006)。
毕赤酵母是迄今最为成熟的外源蛋白表达系统之一，目前已有上百种外源蛋白基因在毕赤酵母中获得表达。外源基因在毕赤酵母中的表达需要有几个基本条件：一是需要有高效的启动子和终止子；二是要有同源序列以便外源基因能够有效地整合到毕赤酵母基因组中；三是要有高通量的筛选方法。另外，影响外源基因在毕赤酵母中表达的还有培养条件、密码子的偏好性以及蛋白质的三级结构等。
目前，已经研究发现有一些启动子和终止子可应用于毕赤酵母表达系统，其中应用最为广泛的诱导型启动子是毕赤酵母乙醇氧化酶(Alcohol Oxidase，AOX)启动子，在毕赤酵母中，有两个不同的基因可编码乙醇氧化酶：分别是AOX1和AOX2，二者之间有97％的氨基酸序列同源性。在毕赤酵母细胞中，基因AOX1的表达对乙醇氧化酶活性起主要作用。甲醇代谢的第一步是甲醇氧化，生成甲醛和氢过氧化物。为避免细胞氢过氧化物中毒，甲醇代谢在过氧化物酶体中进行。AOX1基因的表达受到严格的调控，而且受到甲醇诱导可以达到很高的水平，典型的是当毕赤酵母细胞在含甲醇的培养基中生长时，AOX1表达产物可细胞占总可溶性蛋白的30％以上。
由于乙醇氧化酶启动子调控外源基因表达需添加甲醇进行诱导，而一些工业领域，如食品和医药等要求最终产品中不得有甲醇等有毒和有害物质残留，为此，一些组成型启动子的应用越来越受到研究者的关注。
目前外源蛋白在毕赤酵母中的表达一般是通过外源基因整合到毕赤酵母基因组中的方式，虽然也有一些携带外源基因的表达质粒(如2μ)在毕赤酵母中能够独立复制并表达外源蛋白的报道，但这种非整合型的表达方式存在着质粒不稳定和易丢失等缺点，目前已很少有人应用。外源基因整合到毕赤酵母基因组中需要有同源序列参与，即外源基因若要整合到酵母基因组中，载体中需要包含一段核苷酸序列，它们与酵母基因组中的某段DNA序列完全相同或基本一致，常用的同源序列有毕赤酵母来源的某个启动子或终止子等。有了同源序列还不够，外源质粒的状态也会极大地影响外源基因整合的效率，一般线性化质粒的整合效率远远高于闭合的环形质粒，而线性化的位点在不破坏外源基因的条件下，整合既可以发生在同源序列的内部，也可以在外部，都不影响整合的效率。
高通量的筛选方法对获得高效表达外源基因的重组菌株来说也是十分重要的。通常用于表达外源蛋白的毕赤酵母菌株都是基因缺陷型菌株，例如本发明中所使用的GS115菌株就是组氨酸基因缺陷型的，当携带有组氨酸合成酶基因的外源质粒整合到酵母基因组中时，恢复了GS115合成组氨酸合成酶的能力，使只有整合了外源质粒的重组菌才能够在组氨酸缺陷的培养基中生长。除了使用缺陷型酵母菌株作为筛选标记外，外源质粒上还应携带有某种抗性基因以便使重组菌株产生相应的抗生素抗性，例如G418抗性或Zeocin抗性等，根据重组菌株对抗生素的抵抗能力的不同，可对外源基因整合的拷贝数进行粗略的筛选。拷贝数的多少对外源蛋白表达量的影响还需实验确定。质粒载体转化酵母后，可以先利用缺陷型培养基进行初筛，能够生长的重组菌株再转接到含有不同浓度抗生素的培养基进行拷贝数的筛选，也可以将转化后的菌液直接涂布在抗生素筛选平板上，由于抗生素抗性物质的积累需要一定时间，会使重组菌株的生长略为缓慢。
毕赤酵母作为外源蛋白表达系统有诸多优点，它属于低等真核生物，兼具真核生物和原核生物的特点。毕赤酵母是单细胞生物，遗传背景的研究相对透彻，其生理生化特性已较为清楚，对于它的基因工程操作相对于植物或动物细胞来说，更加简便和快捷，同时，它作为真核生物又具备了原核生物所没有的特性，如蛋白的翻译后加工和修饰，包括二硫键的形成、糖基化和脂酰化等。对于有细胞毒性的外源重组蛋白，可以将它定位于毕赤酵母的过氧化物酶体中，既可以保证宿主细胞不被毒性蛋白所伤害，又可以防止蛋白酶对外源重组蛋白的降解。而对于胞外表达的蛋白来说，由于毕赤酵母本身的分泌蛋白很少，因此，利于外源重组蛋白的分离和纯化。毕赤酵母菌株及其代谢产物对于任何哺乳动物均没有毒性，而且它能够进行高密度发酵，培养成本低廉，操作简单，极适合于工业化的大规模发酵生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种含有编码假黑盘菌素成熟多肽的DNA序列的表达载体，其包括酵母组成型启动子，位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码假黑盘菌素成熟多肽DNA序列，所述编码假黑盘菌素成熟多肽的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列GAGAAAAGA。
前述的表达载体，其中所述酵母的组成型启动子为毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。
前述的表达载体，其中所述编码假黑盘菌素成熟多肽的基因是按照毕赤酵母所偏爱的密码子进行优化的基因，具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
前述的表达载体，其出发载体为pPIC9K。
本发明还提供含有上述表达载体的宿主，优选为毕赤酵母，更优选为毕赤酵母GS115基因工程菌。
本发明进一步提供含有上述表达载体的毕赤酵母GS115基因工程菌的培养方法，其包括步骤：
1)菌体培养：在基础发酵培养基中发酵培养，接种前用氨水调节培养基的pH值为5.7～6.0，然后在每升基础发酵培养基中加入4.37mL PTM1溶液；按10v/v％的比例接入种子液，28～30℃，370～380转/分通气搅拌培养22～24小时；
2)饲喂碳源：通过蠕动泵向步骤1)的发酵液中流加含有12mLPTM1/L发酵液的50％甘油，流加量为18mL/hr/L发酵液，28～30℃通气搅拌培养4～6小时，在培养过程中加入氨水以维持pH值为5.7～6.0，同时调整通气量，使溶氧量维持在20％以上；然后，在培养的第3～4天，继续流加含有12mL PTM1/L发酵液的50％甘油，使甘油浓度始终维持在1.5～2％，溶氧量始终维持在20％以上，温度维持在28～30℃，pH维持在5.7～6.0；
其中，所述基础发酵培养基为10×Basal Salts+4％甘油；所述PTM1含有0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素和0.5％硫酸。
本发明还提供上述毕赤酵母GS115基因工程菌分泌的重组蛋白的纯化方法，其包括离心除菌、过滤和分子筛柱层析的步骤。
本发明另外提供一种在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽的方法，其是利用上述的表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生假黑盘菌素成熟多肽。
本发明利用毕赤酵母表达系统以组成型方式表达和生产重组假黑盘菌素成熟多肽，该重组多肽具有天然多肽相类似的生物活性，即能够抑制或杀灭多种革兰氏阳性细菌，甚至对某些具有抗生素抗性的致病菌株也能产生抑制作用。按照一个优选的实施方案，本发明提供了假黑盘菌素成熟多肽在毕赤酵母中以组成型方式高效表达和生产的方法。该重组假黑盘菌素成熟多肽具有与天然假黑盘菌素相类似的抗菌活性。同时，本发明提供了假黑盘菌素成熟多肽在毕赤酵母中可高密度发酵生产以及重组蛋白快速分离和纯化的方法。
本发明所述的重组假黑盘菌素成熟多肽是在毕赤酵母中以组成型方式表达和生产的，首先是编码重组假黑盘菌素成熟多肽的基因被按照毕赤酵母所偏爱的密码子进行优化并完全人工合成出来，然后，该人工合成的基因被插入到一个带有α-因子分泌信号肽核苷酸编码序列的酵母表达载体上以形成一个新的融合基因。α-因子分泌信号肽的作用是操纵外源的重组假黑盘菌素成熟多肽向毕赤酵母胞外的分泌。在该质粒载体上，还含有一个组成型启动子，该启动子位于α-因子信号肽与假黑盘菌素成熟多肽所形成的融合基因的上游，它操纵融合基因在毕赤酵母细胞中的高效表达。该质粒载体经线性化后，可通过电融合法或氯化锂等方法导入到毕赤酵母细胞中，进而通过同源重组稳定整合到酵母基因组上，该重组酵母在发酵培养过程中可稳定和高效地表达假黑盘菌素成熟多肽，并在α-因子分泌信号肽的引导下分泌到胞外的培养基中。
本发明所述的重组蛋白可以是假黑盘菌素成熟多肽的全部，然而，在某些具体实施方案中，所表达的外源基因也可能只是该多肽的一部分。在某些具体实施方案中，假黑盘菌素成熟多肽重组蛋白可与另外一个具有不同生物学功能的蛋白基因以独立或融合方式同时在一个酵母细胞内表达，以达到方便提纯或提高其生物活性的目的。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工，共价结合的方式，或通过DNA重组技术使基因在翻译表达前即拼接在一起。
发酵产品中假黑盘菌素的纯度直接关系到该重组蛋白的应用范围及所生产相关产品成本的高低，按照一个优选的实施方案，为了快速纯化假黑盘菌素重组蛋白，可以首先将酵母发酵上清液使用不同截流分子量的过滤装置进行预处理，然后再使用分子筛进行柱层析，在纯化过程中的每一个环节，都可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，通过上述方法可获得纯度达到99％的假黑盘菌素重组蛋白。
本发明提供的用于转化酵母细胞的质粒载体包含编码假黑盘菌素成熟多肽或其衍生物的DNA序列以及操纵该DNA序列在所述酵母细胞中表达的组成型启动子组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择性或标记基因，用于重组毕赤酵母细胞的筛选和检测。在某些具体实施方案中，本发明采用的组成型启动子是酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAPDH)，其是从毕赤酵母中克隆得到甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子序列，并将其插入到到毕赤酵母表达载体pPIC9K中以取代载体原位置上的诱导型启动子-乙醇氧化酶启动子，使该表达载体能够以组成型方式高效地表达外源重组蛋白。
本发明提供的用于转化毕赤酵母的质粒表达载体，其含有的编码外源蛋白的基因是编码假黑盘菌素成熟多肽的基因，其表达的外源重组蛋白具有抑菌或杀菌作用。更确切地，本发明所述的假黑盘菌素成熟多肽与假黑盘菌的天然蛋白或由其它常规表达系统生产的该重组多肽相类似，作为抑菌或杀菌剂可以广泛地应用到医疗、食品、饲料和科研等领域。
本发明还提供了毕赤酵母细胞遗传转化以及酵母重组子筛选的方法，包括如下步骤：1)按照毕赤酵母所偏爱的密码子，对假黑盘菌素成熟多肽基因进行优化，并人工合成该多肽基因；2)毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的克隆；3)构建一个质粒表达载体，其含有编码假黑盘菌素成熟多肽或其衍生物的DNA序列，该DNA序列首先与α-因子分泌信号肽核苷酸编码序列拼接形成融合基因，然后它们被置于毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子控制之下；4)通过电融合法或其它方法，用上述线性化后的质粒表达载体转化酵母细胞，并将转化后的毕赤酵母细胞涂布于RDB固体平板选择培养基上，能够在该培养基上生长的酵母单菌落就是含有外源基因的酵母重组子；5)挑取重组酵母细胞单菌落，分别接种到含有不同浓度G418(浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL)的YPD固体平板培养基上，能够在高浓度G418平板上生长的酵母单菌落具有较高的外源基因拷贝数，可能具有较高的外源蛋白表达水平。
按照一个优选的实施方案，本发明提供了经过优化的重组毕赤酵母培养条件以及重组蛋白的快速分离及纯化方法，包括如下三个步骤：1)菌体培养阶段，以10v/v％的接种量接种酵母工程菌后，经过22～24小时的培养，酵母菌体湿重将达到95～100g/L左右；2)碳源饲喂和蛋白表达阶段，在该培养阶段，酵母菌体的湿重将达到180～190g/L左右，此时继续补加碳源，并维持一定的pH值和溶氧量，使菌体高密度发酵，在酵母菌体生长的同时，重组蛋白得到稳定和高效地表达；3)蛋白纯化，发酵液经过离心和三次不同规格的滤膜过滤处理，然后再经过一次分子筛柱层析，重组假黑盘菌素成熟多肽的纯度可达99％以上。
本发明的优选实施方案为毕赤酵母表达系统，其它的酵母表达系统也可按照本发明提供的方法进行转化、表达和生产。因此，所有这些酵母表达系统都应包括在本发明的范围之内。
酵母转化使用的质粒载体是一个整合型的质粒表达系统，按照一个优选的实施方案，本发明所使用的质粒表达载体是经过改造的pPIC9K，其所含有的AOX1诱导型启动子被毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成型启动子所取代。
具体地，本发明包括如下步骤：1)按照毕赤酵母所偏爱的密码子，对假黑盘菌素成熟多肽基因进行密码子优化，然后人工合成该基因并将其插入到pEASY-T1质粒的T位点内，用得到的中间质粒载体DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使中间载体得到复制，然后进行DNA测序，分析所插入外源基因的正确性和完整性；2)通过常规的分子生物学技术，将该外源基因定向插入到pPIC9K质粒中的Xho I和Not I位点之间；3)根据已公布的DNA序列(GenBank：U62648.1)，合成引物，以毕赤酵母基因组DNA为模板，经PCR扩增后，可获得毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，将该DNA序列插入到pEASY-T1质粒的T位点内，用得到的中间质粒载体DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使中间载体得到复制，然后进行DNA测序，分析所插入外源DNA片段的正确性和完整性；4)利用常规的分子生物学技术，通过内切酶和连接酶处理，将毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子插入到上述的pPIC9K中并取代载体原位置上的诱导型启动子-乙醇氧化酶启动子，以便使该表达载体能够以组成型方式稳定和高效地表达外源蛋白；5)高表达酵母重组子的筛选，经过电融合或其它转化方法，将上述重组后的酵母表达载体导入酵母受体细胞，在RDB固体平板选择培养基上培养，待酵母单菌落出现后，再将其逐一转接到含不同浓度G418的YPD固体平板培养基上，能够抵抗高浓度G418的酵母重组子由于具有较高的假黑盘菌素基因拷贝数，因而有可能具有较高的外源蛋白表达量，因此，挑选能够在最高浓度G418的YPD固体平板培养基上生长的酵母重组子进行后续操作；6)提供重组毕赤酵母最适生长培养和表达的条件，重组毕赤酵母的高密度发酵包括菌体培养和蛋白表达两个阶段，在每个阶段选择最适的培养时间和环境条件，发酵液分别经离心除菌、过滤、分子筛柱层析等步骤后，可得到纯度达99％以上的假黑盘菌素成熟多肽重组蛋白。
选择假黑盘菌素成熟多肽在毕赤酵母中以组成型方式表达和生产，是因为该多肽具有广谱和高效的抑菌或杀菌活性，该重组多肽作为抑菌或杀菌剂可被广泛地用于医疗、食品、饲料和科研等领域。尽管假黑盘菌素具有诱人的应用前景，但是它的规模化和工业化生产问题一直没有得到很好地解决，而选择毕赤酵母表达系统是因为它是目前最常用的一个外源基因表达系统。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(1)本发明首次利用毕赤酵母表达系统成功地以组成型方式表达和生产假黑盘菌素成熟多肽(抗菌肽)重组蛋白；
(2)本发明采用密码子优化后的假黑盘菌素成熟多肽基因以提高其在毕赤酵母细胞中的转录和表达效率；
(3)本发明采用毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控假黑盘菌成熟多肽基因在毕赤酵母中以组成型方式高效和稳定地表达；
(4)本发明特别优化了毕赤酵母工程菌发酵生长条件以提高假黑盘菌成熟多肽重组蛋白的生物产量以及从发酵上清液中快速提纯该重组外源蛋白的方法，纯化工艺简单易行，适用于规模化生产假黑盘菌素蛋白，最终制备的假黑盘菌成熟多肽重组蛋白纯品具生物活性，可广泛应用于医疗、食品、饲料以及科研等领域。
附图说明
图1为本发明假黑盘菌素成熟多肽基因密码子优化前后对比，N代表密码子优化前的基因序列，M代表密码子优化后的基因序列；
图2为本发明密码子经过优化的假黑盘菌素成熟多肽基因的克隆及其组成型酵母表达载体mpGPIC9K的构建流程图；
图3为本发明利用抑菌圈法，检测假黑盘菌素重组蛋白对金黄色葡萄球菌的杀菌效果示意图，1-3为加入鸡溶菌酶，浓度分别为4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL，4-6为加入重组假黑盘菌素蛋白，浓度分别为50ug/mL、100ug/mL和200ug/mL，CK-为阴性对照；
图4为本发明利用抑菌圈法，检测毕赤酵母菌株MP-P不同培养时间的发酵上清液抑菌圈形成情况示意图，CK-为阴性对照；
图5为本发明电泳检测纯化后的假黑盘菌素成熟多肽，1为工程菌发酵液上清，2为工程菌发酵液上清经过50KDa中空纤维过滤后的滤液，3为经10KDa纳滤膜过滤后的透过液，4为经2.5KDa纳滤膜过滤后的回流液，5为经过脱盐、分子筛柱层析和冻干后所获得的重组蛋白纯品，6为蛋白Marker。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1假黑盘菌素成熟多肽基因的人工合成
根据已知的假黑盘菌素全长基因序列(GenBank：AJ964941)，按照毕赤酵母所偏爱的密码子，在不改变氨基酸序列的前提下，人工合成编码假黑盘菌素成熟多肽的基因，合成的成熟多肽基因全长为123bp(包括终止密码子)，共编码40个氨基酸残基(见SEQ ID NO：1)，分子量约为4.4KDa。在人工合成该多肽核苷酸编码序列过程中，在该基因的5’端第一个密码子GGT前合成和添加了限制性酶切位点XhoI以及酵母Kex2基因表达产物切割识别序列CTCGAGAAAAGA(见SEQ ID NO：2)；在该基因的3’端终止密码子TAA后增加了限制性酶切位点Not I。密码子优化后的假黑盘菌素成熟多肽基因与改造前相比，改变了其中的19个核苷酸碱基，总共涉及到19个密码子，而G+C含量由原来的45％变为46％，基因改造前后序列对比如图1所示。人工合成的假黑盘菌素成熟多肽基因及其两端的附属序列如SEQ ID NO：2所示(基因拼接和合成工作由上海博亚生物技术公司完成)。
实施例2假黑盘菌素成熟多肽基因的克隆
将上述人工合成的假黑盘菌素成熟多肽基因片段直接插入到pEASY-T1(购自北京TransGenic公司)质粒中的T位点内，得到含有质粒载体mp-T的细菌克隆，然后，通过DNA测序，确定其所含的假黑盘菌素成熟多肽基因的正确性和完整性(DNA测序由北京标凯科技有限公司完成)。
实施例3毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的克隆
根据已知的毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子序列(GenBank：U62648.1)，分别合成位于启动子两端的引物F和R，其中F为5′-ATGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCC-3′(划线处为BamH I切割位点)，R为5′-ATGAGCTCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAATTGATTG-3′(划线处为Sac I切割位点)，以毕赤酵母基因组DNA为模板(基因组提取方法参见《分子克隆实验指南第三版》)，以F和R为引物，通过PCR扩增得到甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子序列(GAPDH，其序列如SEQID NO：3所示)，将扩增片段直接插入到pEASY-T1质粒中的T位点内，得到含有中间质粒载体GAPDH-T的细菌克隆，然后，通过核苷酸测序分析，确定GAPDH的正确性和完整性。
实施例4酵母表达载体mpGPIC9K的构建
用限制性内切酶BamH I和Sac I进行双酶切，将连接在中间质粒载体GAPDH-T中的GAPDH DNA片段切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收该DNA片段。用同样的限制性内切酶处理质粒pPIC9K(美国Invitrogen公司产品)，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的pPIC9K质粒DNA。将上述两个DNA片段混合后并用连接酶连接在一起得到中间质粒载体GPIC9K。
用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，将插入在中间质粒载体mp-T中的假黑盘菌素成熟多肽基因切下，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收假黑盘菌素成熟多肽基因DNA片段。再用相同的限制性内切处理质粒GPIC9K DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的GPIC9K质粒DNA。将上述两个DNA片段混合后并用连接酶连接在一起得到假黑盘菌素成熟多肽毕赤酵母组成型高效表达载体mpGPIC9K，该表达载体的构建流程图如图2所示。然后用该质粒表达载体转化大肠杆菌细胞DH5α(购自美国GIBCO公司)，进行质粒的复制和保存。
质粒载体pPIC9K购自美国Invitrogen公司，它是一个酵母诱导型表达质粒载体，它含有一个高效的诱导型启动子-醇氧化酶启动子(AOX1)，在甲醇的诱导下，可调控下游插入外源基因的高效表达。在该表达载体多克隆位点前含有α-因子分泌信号肽核苷酸编码序列，在与外源基因融合表达以后，可引导外源重组蛋白向酵母细胞外分泌。在分泌到胞外的过程中，该信号肽序列可以被酵母自身的Kex2或Ste13基因表达产物切割下来，从而不改变外源重组蛋白的N端序列。
实施例5mpGPIC9K质粒DNA的制备
采用碱裂解法(参见分子克隆试验指南)，从上述的大肠杆菌DH5α细胞中小制备提取mpGPIC9K质粒DNA，然后用1～2倍过量的限制性内切酶Sal I进行酶切，使之完全线性化，可利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。然后用酚和氯仿分别抽提上述酶切产物，乙醇沉淀，弃上清，收集沉淀，经冷冻干燥后，将沉淀重新溶解在无菌的去离子水中，-20℃保存备用。
实施例6酵母细胞的转化
将-72℃保存的毕赤酵母菌株GS115(购自美国Invitrogen公司)接种到5mL YPD液体培养基中(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)，28℃震荡培养1天左右，将培养好的菌液以1％接种量重新接种于100mL YPD液体培养基中，28℃震荡培养过夜(8h)至OD600nm＝1.3～1.5，4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在200mL冰预冷的灭菌去离子水中，缓慢重悬菌体，4℃4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在200mL冰预冷的1M山梨醇中溶液中，4℃4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在40mL冰预冷的1M山梨醇中溶液中，4℃4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在1mL冰预冷的1M山梨醇中溶液中，吸取80uL于1.5mL离心管中，与上述线性化表达载体mpGPIC9K质粒DNA(4～5ug)充分混匀，然后转移到冰浴后的0.2cm无菌电击杯中，利用电击仪PrecisionPulseTM(美国BTX公司产品)将线性化的表达载体mpGPIC9K质粒DNA导入酵母感受态细胞中，使用的电击参数为电压1.5kV，电容50uF，电阻200Ω。电击完成后，立即向电击杯中加入1mL室温的YPD培养基，充分混匀后，28℃静置1小时，然后均匀涂布于RDB选择培养基平板(1.34％YNB，1M山梨醇，1％葡萄糖，0.00004％Biotin，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，2％琼脂粉)上，倒置于28℃恒温培养箱中2～3天，至菌落出现。
实施例7高表达重组酵母菌株的筛选
将在RDB培养基上生长的酵母单菌落(转化子)用无菌牙签逐一挑取到含有梯度G418的YPD培养基平板(分别含有0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL G418)上，倒置于28℃恒温培养箱中1～2天。随着携带有G418抗性基因的外源质粒整合到酵母基因组中的拷贝数的增加，转化子对G418的抗性也增强。挑取能够在含有2mg/mL G418的YPD平板上生长的酵母转化子，接种于100mLBMGY培养基(1％酵母提取物，2％酪蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1v/v％甘油)中28℃震荡培养4天，发酵液10000转/分离心5分钟，收集含有重组假黑盘菌素成熟多肽的上清液，该上清液可直接用于抑菌活性的测定。
重组蛋白抑菌活性的测定采用抑菌圈法，所用的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodeikticus)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，菌种编号分别为CGMCC1.0634和CGMCC 1.2465。将溶壁微球菌或金黄色葡萄球菌接种于5mL LB液体培养基中(每L含有蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，pH7.0)，37℃震荡培养至OD600nm约为1.0，吸取1uL培养物于45℃的尚未凝固的固体LB培养基中，迅速混匀，倒制平板。待平板凝固后，用打孔器在其上打出直径约5mm的圆孔，将发酵液上清20uL加入孔中，37℃静置过夜，具有抑菌活性的发酵液将会使圆孔周围出现透明圈，并且根据抑菌圈半径的大小可以判断发酵液抑菌活性的强弱(如图3所示)。
随机挑取10个能够在2mg/mL G418的YPD平板上生长的转化子，发酵培养，取发酵液上清进行抑菌活性测定。测定结果发现所有能够在2mg/mL G418的YPD平板上生长的转化子都具有抑菌活性，并且抑菌活性强弱差别不明显。
将能够在溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌平板上都能产生抑菌圈的重组子挑选出一株作为工程菌加以保存，并将其命名为MP-P。
实施例8重组酵母菌的高密度发酵
1.种子液的制备
将重组酵母菌株MP-P接种于10mL BMGY培养基中，28℃震荡培养过夜，以10％的接种量转接于100mL BMGY培养基中，28℃震荡培养过夜，再以10％的接种量转接于1L BMGY培养基中，28℃震荡培养过夜，将其转接到4L BMGY培养基中，28℃震荡培养2天，作为高密度发酵的种子液。
2.重组酵母在50L发酵罐中的高密度发酵
发酵过程可以分为以下两个阶段：1)菌体培养阶段：在50L发酵罐(镇江东方生物工程设备技术有限责任公司)中盛有30L基础发酵培养基(10×Basal Salts：2.67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾+4％甘油)，在接种前先加入氨水使该培养基的pH值维持在6.0左右(氨水同时也可作为酵母菌体生长的氮源)，再按下述比例，在每升基础发酵培养基中加入4.37ml微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜，0.008％碘化钠，0.3％硫酸锰，0.02％钼酸钠，0.002％硼酸，0.05％氯化钴，2％氯化锌，6.5％硫酸亚铁，0.025％生物素，0.5％硫酸)。按10％的比例接种此前制备好的种子液，28℃通气搅拌(转速自始至终维持在380转/分)培养24小时左右。培养过程中，随着酵母菌体的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当培养基中的碳源消耗完后，溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体的湿重将达90-95g/L；2)饲喂碳源和蛋白表达阶段(24～96h)：在接种第二天，通过蠕动泵流加补料液，补料液为50％甘油(其中含有12mL PTM1/L)，流加量为18mL/hr/L发酵液。28℃通气搅拌培养4～6小时，此时的菌体湿重将达180～190g/L。随着菌体的生长，pH值逐渐降低，用氨水维持pH值在6.0左右，同时调整通气量使此阶段的溶氧量始终维持在20％以上。在培终维持2％左右(每天大概加入720mL)，溶氧量始终大于20％，温度维持养的第3～4天，继续流加50％的甘油(其中含有12mLPTM1/L)，使甘油浓度始在28℃，pH维持在6.0左右。每隔24小时取数毫升发酵液经5000rpm 4℃下离心10分钟，取30uL发酵液上清液进行SDS-PAGE检测，发现有肉眼可观察到的一条蛋白带，分子量约为5KDa，与推测中的假黑盘菌素成熟多肽分子量基本吻合。从抑菌圈活性检测中发现，自接种开始算起，在培养96小时后，重组蛋白的表达量就已经达到最高峰(如图4所示)。
实施例9重组蛋白的纯化
待一个发酵周期全部结束之后，留取500mL发酵液作为种子液(接种量为5％)直接进行下一轮的发酵过程。类似的操作累计进行3轮，在每轮发酵过程中，均对菌体的生长量和重组蛋白的表达量进行了测定。另外，在每轮发酵过程完全结束后，还取少许菌液涂布于YPD固体平板上，并从中任意挑取10个酵母单菌落，快速提取其基因组(蔡传奇等，2001)DNA，进行PCR检测，结果发现，菌体的生物量、生长速度以及重组蛋白的表达量在各轮发酵过程中基本保持稳定，另外，PCR的检测结果也证实重组毕赤酵母菌株具有很好的遗传稳定性(见表2)。
表2MP-P菌株的遗传稳定性和外源蛋白表达稳定性的测定
| PCR阳性 | 生长24小时的菌体湿重(g/L) | 培养96小时后假黑盘菌素成熟多肽表达量(mg/L) |
| 100％ | 90 | 159 |
| 100％ | 89 | 145 |
| 100％ | 91 | 165 |
在一个发酵周期结束之后，除留下500mL发酵液作为种子液外，其余的发酵液用于重组蛋白的纯化。发酵液经5000rpm 4℃离心10分钟，留取上清。发酵液上清首先用截流分子量为50KDa的中空纤维滤柱(天津膜天膜工程技术有限公司，产品型号：MOF-503，使用方法见该公司说明)过滤，收集透过液，澄清的透过液再用截流分子量为10KDa的纳滤膜(上海朗极化工科技有限公司，产品编号：2426538)处理，保留分子量小于10KDa的透过液，将透过液再用截流分子量为2.5KDa的纳滤膜(上海朗极化工科技有限公司，产品编号：2405515)处理，保留分子量大于2.5KDa的回流液，回流液终体积约为700mL。将此回流液进行脱盐处理，向700mL回流液中加入6.3L蒸馏水，即将回流液稀释10倍，然后将稀释液再次通过上述2.5KDa的纳滤膜处理，此时得到的回流液中盐离子浓度也相应稀释10倍，如此重复操作5次，即回流液中盐离子浓度稀释105倍，最终得到700mL回流液，将此回流液冷冻干燥后，可得到初步提纯的重组蛋白冻干粉。该样品经分子筛柱层析进一步分离提纯，分子筛柱层析条件为：柱填充料为Sephadex G75(美国GE公司产品)，柱高35cm，直径16mm，流速1mL/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸钾缓冲液pH6.2，样品上样量为500uL(含冻干粉50mg)，每1mL流出液收集一管，从每管收集液中取少量进行抑菌圈实验和4～12％Bis-Tris Mini Gels(美国Invitrogen产品)电泳。抑菌圈较大且在Bis-Tris Mini Gels上显示单一目的条带的收集液被汇集在一起，作为最终制得的重组蛋白纯品。
在上述纯化流程中，每个操作步骤之后都留取少量样品以便进行总蛋白量、纯度和回收率的测定(如表3所示)。
最终制得的重组蛋白纯品进行Bis-Tris Mini Gels电泳，经考马斯亮蓝染色和脱色后，电泳图经LabWork软件(美国UVP公司产品)分析，结果显示重组蛋白浓度达到99％以上(如图5所示)，重组蛋白的表达量约为0.16g/L。
表3重组假黑盘菌素成熟多肽的纯化
| 步骤 | 总体积(L) | 浓缩倍数 | 总蛋白量(g) | 纯度(％) | 回收率(％) |
| 发酵液上清 | 40 | 1 | 17.5 | 36％ | 100.00％ |
| 50kDa中空纤维滤膜 | 39 | 1.026 | 15.2 | 39％ | 94.09％ |
| 10kDa纳滤膜 | 38.3 | 1.044 | 11.2 | 42％ | 74.60％ |
| 2.5kDa纳滤膜 | 0.7 | 57.143 | 9.8 | 44％ | 68.44％ |
| 分子筛柱层析 | 0.625 | 64 | 4.0 | 99％ | 63.49％ |
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
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蔡传奇等，生物工程学报，2001，17(2)：155-160
序列表
<110>刘德虎
<120>在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽的方法
<130>KHP10112304.2
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>40
<212>PRT
<213>假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)
<400>1
Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His
1 5 10 15
Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr
35 40
<210>2
<211>143
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(132)
<400>2
CTC GAG AAA AGA GGT TTC GGT TGT AAC GGT CCA TGG GAC GAG GAC GAC ATG CAA TGT 57
Leu Glu Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys
1 5 10 15
CAC TGT AAC CAC AAG TCT ATT AAG GGT TAC AAG GGT GGT TAC TGT GCT AAG GGT GGT 114
His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly
20 25 30 35
TTC GTT TGT AAG TGT TAC TAA GCG GCC GC 143
Phe Val Cys Lys Cys Tyr *
40
<210>3
<211>487
<212>DNA
<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400>3
ttttttgtag aaatgtcttg gtgtcctcgt ccaatcaggt agccatctct gaaatatctg 60
gctccgttgc aactccgaac gacctgctgg caacgtaaaa ttctccgggg taaaacttaa 120
atgtggagta atggaaccag aaacgtctct tcccttctct ctccttccac cgcccgttac 180
cgtccctagg aaattttact ctgctggaga gcttcttcta cggccccctt gcagcaatgc 240
tcttcccagc attacgttgc gggtaaaacg gaagtcgtgt acccgaccta gcagcccagg 300
gatggaaaag tcccggccgt cgctggcaat aatagcgggc ggacgcatgt catgagatta 360
ttggaaacca ccagaatcga atataaaagg cgaacacctt tcccaatttt ggtttctcct 420
gacccaaaga ctttaaattt aatttatttg tccctatttc aatcaattga acaactatca 480
aaacaca
487
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atggatcctt ttttgtagaa atgtcttggt gtcc 34
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
atgagctctg tgttttgata gttgttcaat tgattg 36
Claims (10)
1.一种含有编码假黑盘菌素成熟多肽的DNA序列的表达载体，其包括酵母组成型启动子，位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码假黑盘菌素成熟多肽的DNA序列，所述编码假黑盘菌素成熟多肽的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列GAGAAAAGA。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述酵母组成型启动子为毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，所述编码假黑盘菌素成熟多肽的DNA序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为pPIC9K。
5.含有权利要求1-4任意一项所述表达载体的宿主。
6.根据权利要求5所述的宿主，其为毕赤酵母。
7.根据权利要求6所述的宿主，其为毕赤酵母GS115基因工程菌。
8.权利要求7所述基因工程菌的培养方法，其包括步骤：
1)菌体培养：在基础发酵培养基中发酵培养，接种前用氨水调节培养基的pH值为5.7～6.0，然后在每升基础发酵培养基中加入4.37mL PTM1溶液；按10v/v％的比例接入种子液，28～30℃，370～380转/分通气搅拌培养22～24小时；
2)饲喂碳源：通过蠕动泵向步骤1)的发酵液中流加含有12mLPTM1/L发酵液的50％甘油，流加量为16～18mL/hr/L发酵液，28～30℃通气搅拌培养4～6小时，在培养过程中加入氨水以维持pH值为5.7～6.0，同时调整通气量，使溶氧量维持在20％以上；然后，在培养的第3～4天，继续流加含有12mL PTM1/L发酵液的50％甘油，使甘油浓度始终维持在1.5～2％，溶氧量始终维持在20％以上，温度维持在28～30℃，pH维持在5.7～6.0；
其中，所述基础发酵培养基为10×Basal Salts+4％甘油；所述PTM1含有0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素和0.5％硫酸。
9.权利要求7所述基因工程菌分泌的重组蛋白的纯化方法，其包括离心除菌、过滤和分子筛柱层析的步骤。
10.一种在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽的方法，其是利用权利要求1-4任一项所述的表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生假黑盘菌素成熟多肽。
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