CN107058432B

CN107058432B - 一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法

Info

Publication number: CN107058432B
Application number: CN201710196043.5A
Authority: CN
Inventors: 胡章立; 贾彬; 雷宇; 邓利
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen micro - woo Biological Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: CN107058432A

Abstract

一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，本发明涉及生物工程和生物制药技术领域，为解决抗菌肽在毕赤酵母中的表达效果差，更重要的是利用甲醇诱导表达的抗菌肽产品中存留甲醇，甲醇毒性使这种抗菌肽产品无法在食品、饲料和医药领域中应用，本发明提供的技术方案为向接种后的培养基内添加诱导物氯化胆碱，使培养基内的氯化胆碱的终浓度为1％‑5％w/v。本发明的优势在于：PisL9K22WK表达水平高、生产成本低及产品安全无毒害残留，该工程酵母菌及其生产的pisL9K22WK产品可应用于抗菌药物或动物及水产养殖饲料添加剂。

Description

一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法

技术领域

本发明涉及生物工程和生物制药技术领域，更具体地，涉及一种使用无毒诱导物来诱导改良石斑鱼抗菌肽pisL9K22WK在粉红毕赤酵母(pichia pink)高效表达的方法。

背景技术

抗菌肽(AMP)是生物体内带正电荷、富含阳离子和具有两亲性结构的小分子多肽，主要特点如下：抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，对细菌不易产生耐药性，进入机体后代谢速度快，不易在机体产生有害残留，而且对真菌、病毒、原生动物甚至肿瘤都具有杀伤作用或抑制作用。由于其突出的生物学特性，最有潜力作为型新安全无害抗生素替代品，从而备受科学界关注，但是抗菌肽的天然提取或者化学合成的成本过高，造成抗菌肽产品的价格昂贵，无法在实际生产中大规模应用。

PisL9K22WK是以马拉巴石斑鱼多肽piscidin为基础的改良抗菌肽(如申请201410545484.8中公开)，相比于改造前，PisL9K22WK的溶血活性降低，细胞毒性减少，而抗菌活性基本保持不变，具有更优良的临床应用价值，是一种最具潜力的临床的抗生素替代药物。

利用毕赤酵母生产抗菌肽是降低抗菌肽产品成本的重要途径，毕赤酵母表达系统具有其它表达系统不可比拟的优势，如毕赤酵母基因操作简单；外源蛋白表达量高，既可以胞内表达，也可以分泌表达；外源蛋白基因遗传稳定，另外，作为真核表达系统，毕赤酵母具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

粉红毕赤酵母(pichia pink)表达系统是基于巴斯德毕赤酵母的真核生物蛋白表达系统，可用于外源蛋白的高产量及大规模生产。该系统除了具有巴斯德毕赤酵母的优点外，还有以下特点：ADE2基因缺失型标记利于表达克隆的筛选，只有整合ADE2基因标记的多克隆拷贝的转化子才能在缺乏腺嘌呤的培养基中生长，转化子的颜色与目的基因的表达量直接相关；

但是目前的毕赤酵母表达系统在发酵放大过程中面临诸多的问题：诱导外源重组蛋白表达时需使用甲醇作为碳源，甲醇有毒，不适于用于食品或者添加剂的生产，并且易燃易爆易挥发，在工业化生产中车间需进行防暴设计，导致成本增大；甲醇发酵强耗氧，一般靠增大空气的通气量和提高转速很难满足氧气的需求，因此需要通很多纯氧，给工业化生产带来不便，另外消耗的甲醇越多所产的热量也越大，所需设备的冷却能力要求越高；毕赤酵母AOX1启动子的高效转录离不开甲醇，在其它碳源中遭受碳源阻遏作用。

这些问题导致抗菌肽在毕赤酵母中的表达效果差，更重要的是利用甲醇诱导表达的抗菌肽产品中存留甲醇，甲醇毒性使这种抗菌肽产品无法在食品、饲料和医药领域中应用。因此，通过基因工程手段，开发一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种能利用氯化胆碱诱导的改良石斑鱼抗菌肽PisL9K22WK的酵母表达载体及工程菌构建方法，抗菌肽发酵制备PisL9K22WK方法及应用，本发明的酵母菌及表达产物可以用于表达医药与食品级抗菌肽，安全环保，操作简单，适于大规模推广应用。

本发明采用的技术方案如下：

首先，构建改良石斑鱼抗菌肽PisL9K22WK的毕赤酵母胞内表达载体，包括如下步骤：

1)克隆毕赤酵母FLD1启动子基因；

提取毕赤酵母全基因组，以全基因组为模板，以Seq ID NO.4和Seq ID NO.5为引物对FLD1启动子基因进行PCR扩增，获得SEQ ID No.1；

2)克隆石斑鱼抗菌肽基因PisL9K22WK；

将SEQ ID No.1连接T载体，得到FLD-T，以FLD-T为模板，以Seq ID NO.4和Seq IDNO.6为引物进行PCR扩增，将得到的PCR产物作为模板，以Seq ID NO.4和Seq ID NO.7为引物再次进行PCR扩增，获得FLDPIS如SEQ ID No.9所示。编码抗菌肽PisL9K22WK的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。编码抗菌肽PisL9K22WK的DNA序列是按照酵母所偏爱的密码子进行优化的序列，具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

3)将毕赤酵母表达载体pPINKLC采用BglII和KpnI双酶切去除醇氧化酶启动子，与SEQID No.9采用BglII和KpnI双酶切后的片段连接，获得表达载体FPLC。

改良石斑鱼抗菌肽PisL9K22WK的毕赤酵母胞内表达载体的应用，构建所述抗菌肽PisL9K22WK工程菌包括以下步骤：

1)采用SpeI酶酶切表达载体FPLC，获得线性化载体；

2)通过电转化的方法将线性化载体转入粉红毕赤酵母(pichia pink)中，电转化的参数为1000-2000V，3-6ms；进一步电转化的参数优选为1500V，5ms；

3)通过缺腺嘌呤的PAD培养基筛选粉红毕赤酵母(pichia pink)转化子，经过3-7天培养后从白色的转化子中进一步筛选出表达PisL9K22WK基因的工程菌。

本发明还提供含有上述表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞优选为毕赤酵母，更优选为PichiaPink酵母。

本发明还提供培养上述抗菌肽PisL9K22WK工程菌的方法，包括以下步骤：

1)种子液的制备：从YPD平板挑取抗菌肽PisL9K22WK工程菌单菌落，接种于5-10mlYPD液体培养基中，28-30℃，200-250rmp，摇床培养18-24h，获得发酵种子液；

2)发酵培养：以1％-5％(v/v)接种量接种于100ml发酵培养基中，24-28℃，200-250rmp，进一步优选为25℃，250rpm(转/分)，摇床培养24h-48h，待发酵液OD600的吸光度在2.0左右；

3)山梨醇/氯化胆碱补加：每24h，补加诱导物氯化胆碱1％-5％(w/v)和碳源山梨醇0.5％-5％(w/v)。

本发明进一步提供一种在毕赤酵母中表达抗菌肽PisL9K22WK的方法，其是利用上述表达载体FPLC转化PichiaPink酵母，获得抗菌肽PisL9K22WK工程菌，发酵培养后胞内产生抗菌肽PisL9K22WK。

本发明通过优化抗菌肽PisL9K22WK基因序列，构建特异表达载体，首次实现了抗菌肽PisL9K22WK在PichiaPink酵母中的高效表达，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题。本发明得到的表达系统，能通过在诱导过程中添加氯化胆碱和山梨醇，有效诱导外源基因的表达，且目标蛋白表达量与表达活性方面比采用甲醇诱导更好。

本发明有效避免通常采用甲醇带来的一系列问题，如甲醇易燃易爆易挥发的特性，使得诱导过程中难于控制其浓度，且存在巨大的安全隐患，特别是以甲醇诱导生产的药品与食品据美国FDA标准被认为是不安全的。本发明表达的抗菌肽可实现规模化生产，可应用于抗菌药物开发，饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

附图说明

图1为实例1中PCR法扩增FLD1启动子的琼脂糖凝胶电泳检测果；

图2所示为PCR产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳的检测结果；

图3为实例2中大肠杆菌DH5α阳性转化子鉴定结果；

图4为实例3中表达载体FPLC经SpeI酶切线性化的电泳结果；

图5为实例3中重组酵母转化子的PCR鉴定结果；

图6为实例4中重组酵母阳性转化子摇瓶水平发酵96h后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清的琼脂糖孔穴扩散法抑菌结果；

图7为实例5中不同浓度氯化胆碱诱导抗菌肽PisL9K22WK工程菌摇瓶水平发酵96h后，收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清的OD抑菌法第24h抑菌结果；

图8为实例5中空载体毕赤酵母菌株和重组酵母转化子摇瓶水平发酵96h后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清经过70℃分别处理5min、25min和45min后离心得到的上清OD法抑菌第8h结果；

图9为实例5中为空载体毕赤酵母菌株和重组酵母转化子摇瓶水平发酵96h后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清经过100℃分别处理5min、25min和45min后离心得到的上清OD法抑菌第8h结果；

图10为实例6中抗菌肽PisL9K22WK工程菌摇瓶水平发酵96h后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清OD法抑菌实验结果；

图11为实例6中重组酵母菌株96h诱导摇瓶水平发酵后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。

以下实施例中使用的酶和试剂：限制性内切酶SpeI、限制性内切酶Stu I、Bgl II、Kpn I、T4DNA连接酶等分别购自TAKARA、Invitrogen和北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司。

小分子量蛋白预染Marker：SpectraTM Multicolor Low Range Protein Ladder(#SM1861)，购自Fermentas生物技术有限公司。

10×Tris-Tticine缓冲液、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29:1)、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(19:1)、TEMED、购自上海生工生物有限公司；其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

以下实施例中涉及的培养基配方：

LB培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母浸提取物5g/l，NaCl 10g/l；固体LB培养基则加入1.5％(w/v)的琼脂粉。

PAD培养基(/L)：8g粉状PAD培养基，950ml去离子水，用NaOH调PH至6.0-6.5左右，加入20g琼脂粉，高压灭菌后再加入50ml 40％无菌葡萄糖。YPD培养基：蛋白胨20g/l，酵母浸提取物10g/l，葡萄糖20g/l；固体YPD培养基则加入2％(w/v)琼脂粉。

发酵培养基：1％-5％(w/v)酵母提取物，1％-10％(w/v)蛋白胨，100-500mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，0.5％-5％(w/v)YNB，4×10^-5生物素，0.5％-5％山梨醇。

优选的发酵培养基：1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％(w/v)YNB，4×10^-5生物素，1％(w/v)山梨醇。

有关LB培养基、PAD、YPD等培养基的使用参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。

以下实施例中涉及的基因扩增及转化子鉴定方法为PCR法及DNA测序法。

以下实施例中涉及的蛋白检测方法为Tricine-SDS-PAGE。

以下实施例中涉及的菌种和质粒概述于表1：

表1供试菌种和质粒：

实例1FLD1启动子的扩增和PisL9K22WK基因表达框的构建

根据抗菌肽PisL9K22WK的AA序列，设计抗菌肽PisL9K22WK编码基因，通过密码子优化后DNA序列如下：

ATG TTC TTC TTC CAC ATC ATC AAG GGT AAG TTC CAC GCT GGT AGA ATG ATCCAC GGT TTG GTC TGG AAG TAA(SEQ ID NO.3)

PCR扩增FLD1启动子和PisL9K22WK基因表达框

FLD5BZ(Seq ID NO.4)：5′-GCGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGG-3′；

FLD3HZ(Seq ID NO.5)：5′-GCGGAATTCTGTGAATATCAAGAATTGTATGAACAAGC-3′；

pis3R(SeqIDNO.6)：

5′-CCAGCGTGGAATTTGCCTTTGATTATATGAAAGAAGAACATAGGCCTTGTGAATATCAA-3′；

pis3R-pis(SeqIDNO.7)：5′-aatagtGGTACCtcattaTTTCCAGACCAAACCATGAATCATCCTACCAGCGTGGAATTTGCCT-3′；

以酵母基因组为模板，反应体系如下：

PCR反应体系如下：

反应条件如下：

将得到的PCR产物连接T载体，得到FLD-T，以FLD-T为模板，以Seq ID NO.4和SeqID NO.6为引物进行PCR扩增：

反应条件如下：

将得到的PCR产物，以Seq ID NO.4和Seq ID NO.7为引物再次进行PCR扩增。

反应条件如下：

PCR产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收试剂盒进行回收，得到FLD1启动子和PisL9K22WK基因表达框，连接T-Vector，得到FLDPis-T，转化E.coli DH5α。

图1为实例1中PCR法扩增FLD1启动子的琼脂糖凝胶电泳检测果；其中，M：5000bpDNA marker，上样量为5μl；1：以FLD5BZ(Seq ID NO.4)、FLD3HZ(Seq ID NO.5)为引物，毕赤酵母全基因组为模板的PCR扩增产物，上样量为50μl；

图2为实例1中PCR法扩增得到Seq ID NO.9的琼脂糖凝胶电泳检测果；其中，M：5000bp DNA marker，上样量为5μl；1：以FLD5BZ(Seq ID NO.4)、pis3R-pis(SeqIDNO.7)为引物，进行PCR扩增，上样量为50μl。

实施例2抗菌肽PisL9K22WK的毕赤酵母胞内表达载体的构建

2.1将实施例1获得FLDPis-T，经BglII和KpnI核酸内切酶双酶切。同时，用BglII和KpnI双酶切pPinkLC载体(购自Invitrogen)。

双酶切体系如下：

酶切条件：37℃水浴1h。

酶切产物用切胶回收试剂盒回收(购自TAKARA)，-20℃保存备用，FLDPis-T和pPinkLC载体均经过Bgl II和Kpn I双酶切0后，用T4DNA连接酶进行连接。

连接体系如下：

连接条件：22℃，1h；16℃，1h；4℃过夜。

2.2将获得的表达载体转化到大肠杆菌DH5α中：取出-80℃冷冻保存大肠杆菌DH5α感受态细胞100μl，立即置于冰上，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，迅速置于42℃水浴锅热激90s，快速置于冰上冰浴2min。向每个离心管中加入500μlLB培养基(不含抗生素)，混匀，37℃，200rpm培养1h。4000rpm离心1min，去掉部分上清，留下约100μlLB培养基，重悬菌体，将重悬后的菌液涂布在含有AMP的LB固体平板上，37℃，倒置培养，16h。

2.3大肠杆菌DH5α阳性转化子鉴定

挑取在LB平板上长出的单菌落，通过菌落PCR鉴定大肠杆菌DH5α阳性转化子。挑取经引物FLD5BZ(Seq ID NO.4)和引物pis3R-pis(SeqIDNO.7)验证的大肠杆菌DH5α阳性转化子接种于5mlLB液体培养基中(含5μlAMP)，37℃，200rpm过夜培养，送广州艾基生物技术有限公司测序，与设计基因序列进行比对，从DNA水平上验证外源基因插入是否完全正确。

2.3.1引物检测

FLD5BZ(Seq ID NO.4)：5′-GCGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGG-3′

pis3R-pis(SeqIDNO.7)：5′-aatagtGGTACCtcattaTTTCCAGACCAAACCATGAATCATCCTACCAGCGTGGAATTTGCCT-3′

菌落PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带(图3)，图3为实例2中大肠杆菌DH5α阳性转化子鉴定结果：其中转化子PCR产物点样量为10μl；M：5000bp DNA Marker；测序结果表明，PisL9K22WK基因片段插入位点、方向及序列完全正确，与设计相符。成功得到抗菌肽PisL9K22WK的毕赤酵母胞内表达载体FPLC。

2.3.2表达载体FPLC的提取:挑取鉴定正确的大肠杆菌DH5α阳性转化子，接种于10ml含10μlAMP抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。采用质粒提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α阳性转化子中的表达载体FPLC。

实施例3PisL9K22WK工程菌的构建

3.1表达载体FPLC的线性化

将实施例2中获得的表达载体FPLC用SpeI核酸内切酶线性化后用于PichiaPink酵母转化。

线性化体系如下：

反应条件：37℃，14h。

图4为实例3中表达载体FPLC经SpeI酶切线性化的电泳结果：其中，M：1kb DNAmarker，点样量为5μl；1：没有被线性化的表达载体FPLC，点样量为10μl；2：线性化的表达载体FPLC，上样量为10μl；电泳结果(图4)显示：抗菌肽PisL9K22WK的表达载体FPLC完全线性化。

3.2PichiaPink酵母感受态细胞的制备

挑取PichiaPink酵母(购自Invitrogen)单菌落接种至10mlYPD培养基中，28-30℃，200-250rmp，摇床培养过夜，1％-5％(v/v)的接种量接种PichiaPink酵母过夜培养物至50mlYPD培养基中，28-30℃，200-250rmp，摇床培养至OD600nm＝1.2-1.5，4℃，5000xg，离心5min，去上清液，50ml冰预冷的无菌水洗2次，10ml冰预冷的1M山梨醇洗一次，4℃，5000xg，离心5min，去上清液，加200-400μl冰预冷的1M山梨醇重悬菌体，分装80μl/管用于电转化。

3.3电转化

向80μlPichiaPink酵母感受态细胞中加入5-10μg线性化的质粒溶于10μlddH₂O，轻轻混匀，转至冰预冷的电转杯中，冰上放置5min，电转化，参数为1000-2000V，3-6ms。电转后立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液，混匀后转入1.5ml离心管中，30℃，温育2-4h，4000xg，离心1min，去掉部分上清，留下约100μl上清重悬菌体，将重悬后的菌液涂布在PAD平板上，30℃倒置培养，直至长出单菌落。

3.4含有PisL9K22WK基因的重组酵母转化子鉴定

PCR方法鉴定重组酵母阳性转化子：挑取白色的重组酵母转化子进行鉴定，以白色的重组酵母转化子基因组作为模板，以引物：FLD5BZ(Seq ID NO.4)：5′-GCGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGG-3′；引物CYC13RRR(Seq ID NO.8)：GCATAGGCTAGTGAAGAGTCAAGTCGC进行PCR鉴定；

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

图5为实例3中重组酵母转化子的PCR鉴定结果；其中，M：2000bp DNA marker；1：阳性对照，2-14：重组酵母转化子；PCR鉴定结果(图5)表明：在1000bp处出现条带，与设计产物长度相符，故得到多个重组酵母阳性转化子，可用于后续的诱导表达。

实施例4摇瓶发酵筛选高效表达抗菌肽PisL9K22WK的工程菌

挑取实施例3中鉴定得到的重组酵母阳性转化子，接种于10mlYPD液体培养基中，28-30℃，200-250rpm培养18-24h，筛选出在摇瓶中呈现白色的重组酵母阳性转化子，以1％-5％(v/v)接种量接种于100ml发酵培养基中，24-28℃，200-250rpm，进一步优选为25℃，250rpm，摇床培养至OD600nm约2.0，此时计为初始诱导0h，随后，每24h加甲醇至终浓度1％，诱导96h，12000rpm离心10min，弃上清液，收集沉淀，1XPBS洗2次，50mlPBS重悬沉淀，经高压均质机破碎，12000rpm离心10min收集破碎液上清，沉淀存于﹣80℃。

使用抑菌圈法来检测重组酵母阳性转化子的总蛋白抑菌活性。S.aureus ATCC25923作为受试菌。挑取S.aureusATCC 25923单菌落接种于10mlLB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，取200μL过夜培养物接至20mL无菌LB培养基中，37℃200rpm，培养至OD600nm＝0.6,取培养液按1:1000的比例加入到未凝固的含1％琼脂的培养基中(大约5×10⁵cfu/mL)，摇匀，倾倒至空平板上。待平板凝固后，用无菌枪头在平板中央打孔。向平板中央上样孔内加入总量约为100μg重组酵母总蛋白，对照组则加入2.5μg氨苄青霉素。上样后，平板于4℃水平放置30min，随后置于37℃培养箱中培养9-12h。

图6为实例4中重组酵母阳性转化子摇瓶水平发酵96h后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清的琼脂糖孔穴扩散法抑菌结果；其中，S.aureus ATCC 25923作为受试菌。1：空载体破碎液上清100μl上样量；2-7：重组酵母阳性转化子破碎液上清100μl上样量(约100μg)；8：20μl的氨苄青霉素(约2.5μg)；

抑菌圈实验结果(图6)表明：重组酵母阳性转化子均有抑菌活性，而对照空载体没有抑菌活性，阳性对照(8)Amp有抗菌活性。将PisL9K22WK表达量高的重组酵母阳性转化子作为抗菌肽PisL9K22WK工程菌。

实施例5氯化胆碱诱导抗菌肽PisL9K22WK工程菌的诱导条件优化。

5.1抗菌肽PisL9K22WK的诱导表达条件优化

5.1.1 1％(w/v)氯化胆碱诱导抗菌肽PisL9K22WK工程菌发酵

挑取抗菌肽PisL9K22WK工程菌接种于10mlYPD液体培养基中，28-30℃，200-250rpm培养18-24h，以1％-5％(v/v)接种量接种于100ml发酵培养基中，24-28℃，200-250rpm，进一步优选为25℃，250rpm，摇床培养至OD600的吸光度在2.0左右，此时计为初始诱导0h，随后从第24h开始每24h补加氯化胆碱和山梨醇，山梨醇补加量为1.89％(w/v)，氯化胆碱补加量为1％(w/v)，诱导96h。

使用OD抑菌法检测抗菌肽PisL9K22WK工程菌总蛋白抑菌活性。E.coli TOP10作为受试菌。挑取E.coli TOP10单菌落接种于20mlLB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，取200μL过夜培养物接至20mL无菌LB培养基中，37℃200rpm，培养至OD600nm＝0.3，此时菌体细胞浓度达到5×10⁷cfu/mL，取菌液30μl加入1.5ml无菌LB培养基中，此时菌体细胞浓度达到1×10⁶cfu/mL，取菌液(1×10⁶cfu/mL)150μl加入1.5ml无菌LB培养基中，此时菌体细胞浓度达到1×105cfu/mL，取菌液(1×10⁵cfu/mL)100μl加入96孔板，将100μl抗菌肽PisL9K22WK工程菌总蛋白加入含有100μl菌液的96孔板。每隔2h、4h、8h、12h、20h、24h测量OD600。

图7为实例5中不同浓度氯化胆碱诱导抗菌肽PisL9K22WK工程菌摇瓶水平发酵96h后，收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清的OD抑菌法第24h抑菌结果；如图7所示，结果表明氯化胆碱补加量为1％(w/v)时，有良好的抑菌效果。

图8为实例5中空载体毕赤酵母菌株和重组酵母转化子摇瓶水平发酵96h后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清经过70℃分别处理5min、25min和45min后离心得到的上清OD法抑菌第8h结果，其中S.aureus ATCC 25923作为受试菌。

图9为实例5中为空载体毕赤酵母菌株和重组酵母转化子摇瓶水平发酵96h后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清经过100℃分别处理5min、25min和45min后离心得到的上清OD法抑菌第8h结果，其中S.aureus ATCC 25923作为受试菌；

5.1.2 2％(w/v)氯化胆碱诱导抗菌肽PisL9K22WK工程菌发酵

挑取抗菌肽PisL9K22WK工程菌接种于10mlYPD液体培养基中，28-30℃，200-250rpm培养18-24h，以1％-5％(v/v)接种量接种于100ml发酵培养基中，24-28℃，200-250rpm，进一步优选为25℃，250rpm，摇床培养至OD600的吸光度在2.0左右，此时计为初始诱导0h，随后从第24h开始每24h补加氯化胆碱和山梨醇，山梨醇补加量为1.89％(w/v)，氯化胆碱补加量为2％(w/v)，诱导96h。

使用OD抑菌法检测抗菌肽PisL9K22WK工程菌总蛋白抑菌活性。E.coliTOP10作为受试菌。挑取E.coli TOP10单菌落接种于20mlLB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，取200μL过夜培养物接至20mL无菌LB培养基中，37℃200rpm，培养至OD600nm＝0.3，此时菌体细胞浓度达到5×10⁷cfu/mL，取菌液30μl加入1.5ml无菌LB培养基中，此时菌体细胞浓度达到1×10⁶cfu/mL，取菌液(1×10⁶cfu/mL)150μl加入1.5ml无菌LB培养基中，此时菌体细胞浓度达到1×10⁵cfu/mL，取菌液(1×10⁵cfu/mL)100μl加入96孔板，将100μl抗菌肽PisL9K22WK工程菌总蛋白加入含有100μl菌液的96孔板。每隔2h、4h、8h、12h、20h、24h测量OD600。

第24hOD抑菌法结果如图7所示，结果表明氯化胆碱补加量为2％(w/v)时，有良好的抑菌效果。

5.1.3 5％(w/v)氯化胆碱诱导抗菌肽PisL9K22WK工程菌发酵

挑取抗菌肽PisL9K22WK工程菌接种于10mlYPD液体培养基中，28-30℃，200-250rpm培养18-24h，以1％-5％(v/v)接种量接种于100ml发酵培养基中，24-28℃，200-250rpm，进一步优选为25℃，250rpm，摇床培养至OD600的吸光度在2.0左右，此时计为初始诱导0h，随后从第24h开始每24h补加氯化胆碱和山梨醇，山梨醇补加量为1.89％(w/v)，氯化胆碱补加量为5％(w/v)，诱导96h。

使用OD抑菌法检测抗菌肽PisL9K22WK工程菌总蛋白抑菌活性。E.coli TOP10作为受试菌。挑取E.coli TOP10单菌落接种于20mlLB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，取200μL过夜培养物接至20mL无菌LB培养基中，37℃200rpm，培养至OD600nm＝0.3，此时菌体细胞浓度达到5×10⁷cfu/mL，取菌液30μl加入1.5ml无菌LB培养基中，此时菌体细胞浓度达到1×10⁶cfu/mL，取菌液(1×10⁶cfu/mL)150μl加入1.5ml无菌LB培养基中，此时菌体细胞浓度达到1×10⁵cfu/mL，取菌液(1×10⁵cfu/mL)100μl加入96孔板，将100μl抗菌肽PisL9K22WK工程菌总蛋白加入含有100μl菌液的96孔板。每隔2h、4h、8h、12h、20h、24h测量OD600。

第24hOD抑菌法结果如图7所示，结果表明氯化胆碱补加量为5％(w/v)时，有微弱抑菌效果。

不同浓度氯化胆碱诱导抗菌肽PisL9K22WK工程菌发酵96h后，OD抑菌法第24h抑菌结果显示，氯化胆碱补加量为1％(w/v)和2％(w/v)时均有良好的抑菌效果，且氯化胆碱补加量为2％(w/v)时抑菌效果最好，故氯化胆碱的最佳诱导浓度为2％(w/v)。

5.2抗菌肽PisL9K22WK初步提纯

分别采用70℃和100℃处理氯化胆碱诱导抗菌肽PisL9K22WK工程菌发酵96h后的总蛋白5min、25min和45min，在冰上放置10min。12000rpm，4℃，离心20min，收集上清，采用OD抑菌法检测上清抑制金黄色葡萄球菌的活性。

OD抑菌法第8h抑菌结果显示，70℃处理25min和45min后的蛋白液上清抑菌效果明显优于70℃处理5min，且70℃处理25min抑菌效果优于70℃处理45min。图9显示100℃处理5min后的蛋白液上清依旧有抑菌活性，且抑菌效果优于100℃处理25min和45min，随着100℃处理时间的增加，抑菌活性减弱。70℃处理25min抑菌效果优于100℃处理5min，故70℃处理25min为最佳处理条件。

实例6抗菌肽PisL9K22WK工程菌的抑菌活性检测及蛋白水平检测

6.1抗菌肽PisL9K22WK工程菌的抑菌活性检测

取抗菌肽PisL9K22WK工程菌单克隆接种于10mlYPD液体培养基中，28-30℃，200-250rpm培养18-24h，以1％-5％(v/v)的接种量将菌液接种于100ml发酵培养基中，24-28℃，200-250rpm，进一步优选为25℃，250rpm，摇床培养至OD600的吸光度在2.0左右，此时计为初始诱导0h，随后从24h开始每24h补加氯化胆碱，氯化胆碱补加量为2％(w/v)，诱导96h。

使用OD抑菌法检测抗菌肽PisL9K22WK工程菌总蛋白抑菌活性。E.coli TOP10作为受试菌。挑取E.coli TOP10单菌落接种于20mlLB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，取200μL过夜培养物接至20mL无菌LB培养基中，37℃200rpm，培养至OD600nm＝0.3，此时菌体细胞浓度达到5×10⁷cfu/mL，取菌液30μl加入1.5ml无菌LB培养基中，此时菌体细胞浓度达到1×10⁶cfu/mL，取菌液(1×10⁶cfu/mL)150μl加入1.5ml无菌LB培养基中，此时菌体细胞浓度达到1×10⁵cfu/mL，取菌液(1×10⁵cfu/mL)100μl加入96孔板，将抗菌肽PisL9K22WK工程菌总蛋白用70℃处理25min后离心取上清100μl(20μg)加入含有100μl菌液的96孔板。每隔2h、4h、8h、12h、20h、24h测量OD600。

图10为实例6中抗菌肽PisL9K22WK工程菌摇瓶水平发酵96h后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清OD法抑菌实验结果；其中，受试菌为大肠杆菌TOP10。抗菌肽PisL9K22WK工程菌破碎液上清100μl；空载体：空载体毕赤酵母菌株破碎液上清100μl上样量；结果显示(图10)抗菌肽PisL9K22WK工程菌具有明显抑菌效果，其OD600值远低于空载体对照，显著的抑制了菌的生长，在24h后抑菌率仍然达到45.5％。

6.2抗菌肽PisL9K22WK工程菌的蛋白水平检测

对6.1中获得的高活性的抗菌肽PisL9K22WK工程菌进一步采用Tricine-SDS-PAGE分析重组PisL9K22WK表达水平。

图11为实例6中重组酵母菌株96h诱导摇瓶水平发酵后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果；其中，6和7分别为抗菌肽PisL9K22WK工程菌和空载体毕赤酵母菌株96h摇瓶水平诱导发酵后收集细胞经高压均质机破碎，破碎液上清30μl上样量；M为超低分子量蛋白Marker。结果图11可见，从蛋白电泳图谱来看，抗菌肽PisL9K22WK工程菌总蛋白在1.7kd与4.2kd之间有目的条带,而空载体对照在此大小区间无条带。

本发明成功优化了编码抗菌肽PisL9K22WK基因，并构建了表达载体FPLC，经SpeI酶酶切线性化后成功转化到PichiaPink酵母中获得表达水平较高的抗菌肽PisL9K22WK工程菌，抗菌肽PisL9K22WK在PichiaPink酵母中实现了高水平的胞内表达。将抗菌肽PisL9K22WK工程菌进行氯化胆碱诱导发酵后，对诱导表达的抗菌肽PisL9K22WK进行了抗菌活性检测，结果表明有明显抑菌效果。通过热稳定性试验表明，抗菌肽PisL9K22WK热稳定性好，70℃加热45min活性没有损失，100℃加热处理5min活性也没有损失。另外，通过时间–抑菌曲线结果反应抗菌肽PisL9K22WK在低浓度下24h后抑菌率仍然达到45.5％。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> 一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法

<130> 20170323

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agatctgcat gcaggaatct ctggcacggt gctaatggta gttatccaac ggagctgagg 60

tagtcgatat atctggatat gccgcctata ggataaaaac aggagagggt gaaccttgct 120

tatggctact agattgttct tgtactctga attctcatta tgggaaacta aactaatctc 180

atctgtgtgt tgcagtacta ttgaatcgtt gtagtatcta cctggagggc attccatgaa 240

ttagtgagat aacagagttg ggtaactaga gagaataata gacgtatgca tgattactac 300

acaacggatg tcgcactctt tccttagtta aaactatcat ccaatcacaa gatgcgggct 360

ggaaagactt gctcccgaag gataatcttc tgcttctatc tcccttcctc atatggtttc 420

gcagggctca tgccccttct tccttcgaac tgcccgatga ggaagtcctt agcctatcaa 480

agaattcggg accatcatcg atttttagag ccttacctga tcgcaatcag gatttcacta 540

ctcatataaa tacatcgctc aaagctccaa ctttgcttgt tcatacaatt cttgatattc 600

acaaggcct 609

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Phe Phe Phe His Ile Ile Lys Gly Lys Phe His Ala Gly Arg Met

1 5 10 15

Ile His Gly Leu Val Trp Lys

20

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgttcttct tccacatcat caagggtaag ttccacgctg gtagaatgat ccacggtttg 60

gtctggaagt aa 72

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgagatctg catgcaggaa tctctgg 27

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcggaattct gtgaatatca agaattgtat gaacaagc 38

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccagcgtgga atttgccttt gattatatga aagaagaaca taggccttgt gaatatcaa 59

<210> 7

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aatagtggta cctcattatt tccagaccaa accatgaatc atcctaccag cgtggaattt 60

gcct 64

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcataggcta gtgaagagtc aagtcgc 27

<210> 9

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agatctgcat gcaggaatct ctggcacggt gctaatggta gttatccaac ggagctgagg 60

tagtcgatat atctggatat gccgcctata ggataaaaac aggagagggt gaaccttgct 120

tatggctact agattgttct tgtactctga attctcatta tgggaaacta aactaatctc 180

atctgtgtgt tgcagtacta ttgaatcgtt gtagtatcta cctggagggc attccatgaa 240

ttagtgagat aacagagttg ggtaactaga gagaataata gacgtatgca tgattactac 300

acaacggatg tcgcactctt tccttagtta aaactatcat ccaatcacaa gatgcgggct 360

ggaaagactt gctcccgaag gataatcttc tgcttctatc tcccttcctc atatggtttc 420

gcagggctca tgccccttct tccttcgaac tgcccgatga ggaagtcctt agcctatcaa 480

agaattcggg accatcatcg atttttagag ccttacctga tcgcaatcag gatttcacta 540

ctcatataaa tacatcgctc aaagctccaa ctttgcttgt tcatacaatt cttgatattc 600

acaaggccta tgttcttctt tcatataatc aaaggcaaat tccacgctgg taggatgatt 660

catggtttgg tctggaaata atgaggtacc 690

Claims

1.一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，所述的方法是将抗菌肽PisL9K22WK工程菌单菌落接种于培养基中发酵培养，其特征在于，所述的方法还包括如下步骤：向接种后的培养基内添加诱导物氯化胆碱及碳源山梨醇，使培养基内的氯化胆碱的终浓度为1%-5% w/v, 使培养基内碳源山梨醇的终浓度为0.5%-5% w/v;

所述的诱导物氯化胆碱及碳源山梨醇于发酵液OD600的吸光度在2.0后的第24小时开始添加;

抗菌肽PisL9K22WK工程菌的构建步骤如下：（1）采用SpeI酶酶切表达载体FPLC，获得线性化载体；（2）通过电转化的方法将线性化载体转入粉红毕赤酵母中，电转化的参数为1000-2000V，3-6ms；（3）通过缺腺嘌呤的PAD培养基筛选粉红毕赤酵母转化子，经过3-7天培养后从转化子中进一步筛选出表达PisL9K22WK基因的工程菌;

所述的载体FPLC采用如下步骤构建而成：1）克隆毕赤酵母FLD1启动子基因：提取毕赤酵母全基因组，以全基因组为模板，以Seq ID NO .4和Seq ID NO .5为引物对FLD1启动子基因进行PCR扩增，获得SEQ ID No.1；2）克隆石斑鱼抗菌肽基因PisL9K22WK：将SEQ IDNo.1连接T载体，得到FLD-T，以FLD-T为模板，以Seq ID NO .4和Seq ID NO .6为引物进行PCR扩增，将得到的PCR产物作为模板，以Seq ID NO .4和Seq ID NO .7为引物再次进行PCR扩增，获得FLDPIS如SEQ ID No.9所示；抗菌肽PisL9K22WK的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；3）将毕赤酵母表达载体pPINKLC 采用BglII和KpnI双酶切去除醇氧化酶启动子，与SEQID No.9采用BglII和KpnI双酶切后的片段连接，获得表达载体FPLC。

2.如权利要求1所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：1）种子液的制备：挑取抗菌肽PisL9K22WK工程菌单菌落，接种于YPD 液体培养基中，28-30℃，200-250rmp，摇床培养 18-24h，获得发酵种子液；2）发酵培养：以 1%-5% v/v 接种量接种于发酵培养基中，24-28℃，200-250rmp，摇床培养24h-48h，待发酵种子液OD600的吸光度在2.0后的第24小时添加诱导物氯化胆碱和碳源山梨醇，添加氯化胆碱至终浓度为1%-5% w/v，添加碳源山梨醇至终浓度为0.5%-5% w/v。

3.如权利要求2所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，发酵培养基的组成为：1%-5% w/v酵母提取物，1%-10% w/v 蛋白胨，100-500 mM磷酸钾缓冲液，0.5%-5%w/v YNB，4×10^-5单位生物素，0.5%-5% w/v的山梨醇。

4.如权利要求3所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，发酵培养基的组成为： 1% w/v酵母提取物，2% w/v蛋白胨，100 mM磷酸钾缓冲液，所述的缓冲液pH为6.0，1.34% w/v YNB，4×10^-5单位生物素，1% w/v山梨醇。

5.如权利要求2所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，步骤2）发酵培养中温度为25℃，转速为250rpm。

6.如权利要求2所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，每隔24h添加一次碳源山梨醇和氯化胆碱，共添加4-6次。

7.如权利要求1所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，抗菌肽PisL9K22WK工程菌的构建步骤（2）中，电转化的参数为1500V，5ms。

8.如权利要求1所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，所述的粉红毕赤酵母为pichaPINK 1。