CN101104859A - 非甲醇诱导型毕赤酵母蛋白表达系统及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及对已有的甲醇酵母(Pichia pastoris)表达系统的改进技术及其应用。本发明依据毕赤酵母碳源与氮源代谢途径及其遗传特性，对可采用胆碱等无毒氮源营养物质诱导表达的甲醛脱氢酶1(FLD1)启动子P_FLD1基因进行克隆与分析的基础上，提供了启动子为甲醛脱氢酶启动子的毕赤酵母表达载体、其制备方法及应用，以及相应的表达系统及其应用。采用本发明提供的表达载体或表达系统表达外源蛋白质可采用无毒的胆碱等氮源作为诱导剂，也可获得与采用有毒诱导物甲醇接近同样的外源蛋白表达效率。这种不用有毒诱导物的绿色安全表达体系可以应用于生产医药级与食品级的基因工程产品。

Description

非甲醇诱导型毕赤酵母蛋白表达系统及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可采用无毒氮源成分来诱导生产外源蛋白的毕赤酵母表达系统及其在医药与食品级蛋白生产中的应用。

背景技术

基因表达体系是分子生物学及生命科学研究领域的重要内容，也是基因工程药物和疫苗研制等应用领域所必需的重要生物反应器。大肠杆菌(E.coli)一直被用作表达外源基因的宿主菌，并成功地表达了多种外源蛋白，但是，它不能表达结构复杂的蛋白质，且分泌型表达产量较低，而包涵体表达产物的完全复性尚存在诸多问题，在表达产物中还常伴有内毒素成分。哺乳动物细胞、昆虫细胞表达体系虽然能够表达结构复杂的蛋白质，但其操作复杂，培养成本较高，而其表达水平通常较低，特别是在培养过程中多采用加血清培养，不但增加了成本，而且还可能带来动物源性病源微生物污染的风险(如疯牛病朊粒等)，目前我国在基因工程药物产业化生产中，由于昂贵的造价和技术方面的原因，无血清、大规模悬浮培养动物细胞，尚难于普遍使用。由于历史的原因及酿造工业的发展，人们对酵母的遗传背景和生物学特性研究得较透彻，其表达的产物安全性易被接受。因此，最近二十年来，酵母被认为是一个很有前途的真核表达体系，受到广泛的研究和应用。

酿酒酵母(S.cerevisiae)是首先被用来作为外源基因的表达宿主菌，然而，人们在应用中发现S.cerevisiae表达重组蛋白具有其局限性：(1)产量通常较低；(2)表达质粒易于丢失，外源基因整合不稳定；(3)缺乏强有力的受严格调控的启动子；(4)外源蛋白过度糖基化作用而使其抗原性明显增强，不适于治疗用途；(5)分泌效率差，特别是分子量大于30kDa的外源蛋白几乎不分泌，使下游纯化复杂化；(6)不适于高密度发酵，难于产业化生产。因此S.cerevisiae并不总是理想的表达宿主。基于上述问题，人们用其它酵母菌株构建了一个能够高效稳定的外源基因表达体系——甲醇营养型酵母(Methylotrophic Yeast)表达体系，作为第二代酵母表达体系，它克服了传统酿酒酵母表达体系的诸多缺点和不足，成为国内外广泛而大量生产外源真核或者结构较为复杂的原核蛋白的一个较为理想的、最具有发展前途的表达体系，是实现基因工程疫苗、抗体、酶、激素和毒素等蛋白药物产业化生产的一个重要技术平台。

P.pastoris不仅生长快、表达量大，而且能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰(包括糖基化)，同时又不产生自身毒素的优点。因此同以往的基因表达体系相比，它具有无可匹敌的优势，已被认为是最具有发展前景的蛋白质生产工具之一。近10多年来，已有200多种外源蛋白的基因在该体系中成功表达，包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等。尽管各种外源蛋白质在甲醇酵母中的表达水平不一，但表达量均为在细菌、昆虫或哺乳动物表达体系中产生量的10-100倍。据报道，P.pastoris中外源蛋白质的产生量最高可达12g/L。由于采用P.pastoris表达体系，通常可实现大量、廉价的高活性、高纯度、低毒的重组目的蛋白，特别对于真核生物中的糖蛋白而言是最为理想的表达体系，因此，P.pastoris被誉称为“生产外源蛋白的工厂”。

毕赤酵母(P.pastoris)是一种典型的甲醇营养型酵母，广泛应用于外源基因的表达。到目前为止，虽然大多数蛋白已经用P_AOX1启动子获得成功表达，但是在实际应用中，该启动子在很多情况下却带来许多问题或者不方便，例如，在摇瓶培养中，甲醇极易快速挥发，既不利于控制甲醇浓度，并需要多次向培养基中添加甲醇，量少时不足以诱导表达，据报道，高浓度甲醇将使Mut+酵母株的AOX1(乙醇氧化酶1，alcohol oxidase 1)失活99％，并引起细胞中毒而死亡。同时，还可能导致实验室及周围环境中有大量有毒的甲醇气体弥漫；再如，当采用重组毕赤酵母(P.pastoris)进行外源蛋白的大规模的发酵生产时，存放和使用大量易燃、易爆的甲醇，无疑是一个较大的安全隐患；还有，在重组毕赤酵母(P.pastoris)表达的外源蛋白中往往都伴随有一定量的甲醇成分，由于甲醇对人及动物具有较高毒性，因此在目的蛋白质纯化过程中，还不得不考虑甲醇残留与脱甲醇毒的问题，特别是以甲醇诱导表达生产的药品和食品，依据美国FDA(U.S.Foodand Drugs Administration)标准，通常被认为是不安全的即NO GRAS(generally regardedas safe)。

随着现代分子生物学理论研究的深入和基因工程药物中、下游工作的普遍开展，集多种优势于一身的P.pastoris表达体系已经成为广大研究者和制药界的重要选择，同时从根本上避免以有毒的甲醇为诱导物，实现基因工程药物的产业化、无毒害化显得尤为重要。美国学者Shigang Shen(1998)首先发现甲醛脱氢酶I(FLD1，formaldehydedehydrogenase 1)基因在P.pastoris也是一个可调控的高表达基因，发现FLD除了作用于甲醇外，还参与作为唯一氮源的烷基化胺如甲胺和胆碱等的代谢。毕赤酵母(P.pastoris)细胞中的甲醇代谢途径示意图参见图1。

本发明依据毕赤酵母碳源与氮源代谢途径及其遗传特性，对可采用胆碱等无毒氮源成分诱导表达的甲醛脱氢酶启动子P_FLD1，进行基因克隆与分析，在功能预测与定向诱变的基础上进行DNA重组，以荧光蛋白为模式蛋白，以P_AOX1为参照，创建了P.pastoris/pFLDZαA和P.pastoris/pFLDZA“绿色”安全医药与食品蛋白生产体系。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能够利用胆碱等无毒氮源诱导表达的毕赤酵母表达载体，其制备方法及应用，将本发明的表达载体用于表达医药与食品用途的重组蛋白质，以克服现有利用甲醇诱导表达技术的不足。

本发明的第二个目的是提供一种毕赤酵母表达系统及其应用，将本发明的表达系统用于表达医药与食品用途的重组蛋白质，能够利用胆碱等无毒氮源诱导表达目的蛋白。

本发明的构思是这样的：依据毕赤酵母(P.pastoris)遗传特性，以常用的突变型P.pastoris GS115和野生型P.pastoris X-33菌株为宿主菌，利用基因操作技术分别对其中在甲醇代谢途径中可经胆碱、甲胺等为氮源诱导的甲醛脱氢酶P_FLD1强启动子克隆、进行结构与功能分析，并以生物信息学为指导，采用已克隆的启动子序列分别替代表达载体pPICZA和pPICZαA中各自以甲醇诱导的P_AOX1启动子，适当调整酶切位点，并以绿色荧光蛋白为模式蛋白，在对改造前后该蛋白的表达结果进行综合分析和评价的基础上，对无毒氮源诱导物进行优选，通过优化和筛选，获得一套便于基因工程药物产业化生产的毕赤酵母“绿色”基因表达体系，为生产安全的基因工程药物或食品服务。发明研究内容在毕赤酵母(P.pastoris)细胞中所体现的代谢途径改变示意图参见图2。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母表达载体，其启动子序列为酵母的甲醛脱氢酶启动子FLD1序列。

优选的，上述启动子序列为SEQ ID NO：1：

1   gcatgcagga atctctggca cggtgctaat ggtagttatc caacggagct gaggtagtcg

61  atatatctgg atatgccgcc tataggataa aaacaggaga gggtgaacct tgcttatggc

121 tactagattg ttcttgtact ctgaattctc attatgggaa actaaactaa tctcatctgt

181 gtgttgcagt actattgaat cgttgtagta tctacctgga gggcattcca tgaattagtg

241 agataacaga gttgggtaac tagagagaat aatagacgta tgcatgatta ctacacaacg

301 gatgtcgcac tctttcctta gttaaaacta tcatccaatc acaagatgcg ggctggaaag

361 acttgctccc gaaggataat cttctgcttc tatctccctt cctcatatgg tttcgcaggg

421 ctcatgcccc ttcttccttc gaactgcccg atgaggaagt ccttagccta tcaaagaatt

481 cgggaccatc atcgattttt agagccttac ctgatcgcaa tcaggatttc actactcata

541 taaatacatc gctcaaagct ccaactttgc ttgttcatac aattcttgat attcaca

上述毕赤酵母表达载体，为将已知的毕赤酵母表达载体(含P_AOX1启动子，如pPICZA或pPICZαA)的启动子替换为酵母的甲醛脱氢酶启动子FLD1后获得。除启动子区域外，表达载体其余的酵母分泌信号肽a-factor、多克隆位点区、检测纯化标记区、抗性筛选标记区与转录终止区都来源于已知的毕赤酵母表达载体。上述表达载体为分泌型表达载体或胞内表达载体。其中，分泌型表达载体为优选pFLDZαA，胞内表达载体优选pFLDZA。

根据本发明的教导，所属技术领域的研究员还可将甲醛脱氢酶启动子FLD1替换入除pPICZA或pPICZαA外的其它含P_AOX1启动子的毕赤酵母表达载体(pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、、pPICZαB、pPICZC、pPICZαC)中，获得可经非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体。

本发明第二方面，提供了上述毕赤酵母表达载体的制备方法，包括下列步骤：

1)克隆毕赤酵母FLD1蛋白结构基因与调控序列；

2)将克隆产物采用合适的限制性酶切位点切割后，与去除乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母表达载体pPICZA或pPICZαA连接。

克隆毕赤酵母FLD1蛋白结构基因与调控序列的方法可采用生物学常规的克隆方法进行，优选的，克隆毕赤酵母FLD1蛋白结构基因与调控序列时，采用PCR方法进行克隆。

本发明采用了下述方案构建pFLDZαA和pFLDZA：根据《分子克隆》(科学出版社，第二版，2002年)，分别采用不同的引物将FLD1蛋白结构基因与调控序列从酵母基因组中克隆出来，并经过序列测定与结构分析正确后，采用限制性酶切位点切割下来分别与去除乙醇氧化酶启动子的pPICZαA与pPICZA骨架以及部分表达元件连接而成。本发明所利用PCR克隆FLD1蛋白结构基因及其启动子的引物序列分别为：

PFLD1(SEQ ID NO：4)：5’-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3    Bgl II

PFLD2(SEQ ID NO：5)：5’-CTGGGATCCGAATTCTGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3’

BamH I-EcoR I

PFLD1(SEQ ID NO：6)：5’-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3   Bgl II

PFLD2a(SEQ ID NO：7)：GCA CAT ATGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3’  Nde I

FLD11(SEQ ID NO：8)：5’-ACT GGATCC CAT ATG

TCTACCGAAGGTCAAATCATCAAATGTAAGGCA GCT-3’

BamH I  Nde I

FLD22(SEQ ID NO：9)：5’-TCA GGGCCC TTA GTG CAT AGT AAT CAC AGC-3’Apa I

进一步优选的，克隆获得的FLD1蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2：

1   atgtctaccg aaggtcaaat catcaaatgt aaggcagctg ttgcctggga ggcaggaaag

61  gatctctcta ttgaggagat tgaggttctt cctccaagag cccatgaagt tagagtgaaa

121 gtggaattca ctggtgtatg ccacactgat gcttacacgc tttctggtgc agatgcagag

181 ggaagtttcc ctgttgtgtt cggccatgaa ggtgctggtg ttgtcgagtc agttggagaa

241 ggtgttgagt ccgtgaaggt tggggattct gtagtgcttc tgtacactcc tgagtgcaga

301 gagtgcaagt tctgtctgtc tggtaagacg aacctctgtg gtaaaatcag agccacccag

361 ggtaaaggtt tgttaccaga cgggacttct cgtttccgtt gtaagggcaa ggatttgttt

421 cactatatgg gatgttcttc cttttctcaa tacactgtgg tggctgacat ctcagtggtt

481 aaagtccaag acgaagctcc taaggacaag acatgtctgt tgggttgtgg tgttaccaca

541 gggtacggtg ctgctatcaa cactgctaag atctctaagg gtgacaagat cggtgtgttt

601 ggtgctggat gtattggatt atctgtcatc caaggtgcag tttccaaagg tgcaagcgag

661 attattgtaa ttgacatcaa tgattcaaag aaggcatggg cggaccaatt tggtgcaact

721 aagtttgtca atcctacaac cttaccagaa ggtaccaata ttgttgacta cttgattgat

781 atcactgacg gaggctttga ctataccttc gactgtaccg gtaatgttca agtaatgaga

841 aatgcacttg aatcttgcca caagggttgg ggtgagtcga tcatcatcgg tgtcgctgct

901 gctggtaaag aaatctctac ccgtcctttc cagttggtta ctggcagagt ctggagagga

961 tgcgcctttg gaggtatcaa gggacgtact caaatgccat ctttggttca ggactatctt

1021gatggtaaga ttaaagttga cgagtttatc acacacagac atgacctgga caacatcaac

1081aaagcatttc atgacatgca tgctggaaac tgtattcgtg ctgtgattac tatgcactaa

其对应编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3：

MSTEGQIIKCKAAVAWEAGKDLSIEEIEVLPPRAHEVRVKVEFTGVCHTDAYTLSGADAEGSFPVVFGHEGAG

VVESVGEGVESVKVGDSVVLLYTPECRECKFCLSGKTNLCGKIRATQGKGLLPDGTSRFRCKGKDLFHYMGCSS

FSQYTVVADISVVKVQDEAPKDKTCLLGCGVTTGYGAAINTAKISKGDKIGVFGAGCIGLSVIQGAVSKGASEI

IVIDINDSKKAWADQFGATKFVNPTTLPEGTNIVDYLIDITDGGFDYTFDCTGNVQVMRNALESCHKGWGESII

IGVAAAGKEISTRPFQLVTGRVWRGCAFGGIKGRTQMPSLVQDYLDGKIKVDEFITHRHDLDNINKAFHDMHAG

NCIRAVITMH#

本发明第三方面，公开了将上述毕赤酵母表达载体用于表达生产外源蛋白。

本发明第四方面，公开了一种毕赤酵母表达系统，其表达载体为上述毕赤酵母表达载体，宿主为毕赤酵母P.pastoris，表达诱导物为无毒氮源成分，包括烷基化胺、氨盐等其他可以为生物体利用的氮源。

较佳的，上述无毒氮源成分为烷基化胺，烷基化胺优选甲胺或胆碱。

本发明第五方面，公开了将上述毕赤酵母表达系统用于表达或生产医药或者食品用途的重组蛋白质。通过该表达系统可制备无毒安全的药用和食用重组蛋白。

本发明所提及的无毒安全的药用和食用重组蛋白，可以是任何类型的采用本表达系统表达产生的可食性或可医用的蛋白质，进一步优选的为经纯化的或含表达蛋白的菌体的利用。例如增强性绿色荧光蛋白(EGFP)、脂肪酶、甲醛脱氢酶蛋白等。

在本发明一个表达试验的方案中，表达载体为pFLDZαA和pFLDZA，宿主细胞为毕赤酵母P.pastoris。表达的测试蛋白为增强性绿色荧光蛋白(EGFP)、脂肪酶、甲醛脱氢酶蛋白等。所采用的对照表达体系有pPICZαA和pPICZA与P.pastoris X-33和P.pastorisGS115。

本发明的启动子基因克隆自酵母的甲醛脱氢酶启动子P_FLD1基因全序列，具有SEQID NO：1的序列。

在载体构建方案中，本发明克隆的甲醛脱氢酶蛋白基因编码序列为SEQ ID NO：3的蛋白，优选的具有SEQ ID NO：2的序列。

本发明所提及的非甲醇诱导物即为无毒氮源，包括胆碱、甲胺、  氨盐等其他可以为生物体利用的氮源。

本发明的特点与优点在于：

本发明得到的P.pastoris/pFLDZαA、P.pastoris/pFLDZA表达系统，能够通过在诱导表达过程中添加非甲醇的无毒氮物质，有效地诱导外源基因的表达，而且在目标蛋白的表达量与表达活性方面与采用甲醇诱导没有差异。本发明有效地避免了通常采用甲醇带来的一系列问题，如甲醇的易挥发性，致使难于控制其浓度，导致不足以诱导表达或甲醇中毒；另外挥发于实验室会危害生命；特别是大规模发酵中存放和使用大量易燃、爆的甲醇，无疑是一个大的安全隐患；尤其是在下游纯化中，还须进行脱甲醇毒与残留检测；特别是以甲醇诱导生产的药品与食品据美国FDA标准被认为是不安全的。因此，利用该基因工程蛋白表达系统，尤其适合于利用毕赤酵母高效生产具有安全性要求高的药品与食品，这预示着本发明良好的应用前景。

附图说明

图1.毕赤酵母(P.pastoris)细胞中的甲醇代谢途径示意图

AOX：alcohol oxidase，乙醇氧化酶

DAS：dihydroxyacetone synthase，二羟基丙酮合酶

CAT：catalase，过氧化氢酶

FLD：formaldehyde dehydrogenase，甲醛脱氢酶

FDH：formate dehydrogenase，甲酸脱氢酶

图2发明研究内容在毕赤酵母(P.pastoris)细胞中所体现的代谢途径改变示意图

AOX：乙醇氧化酶

FLD：甲醛脱氢酶

FDH：甲酸脱氢酶

图3所构建的毕赤酵母非甲醇诱导表达载体结构示意图

具体实施方式

本发明的技术方案如下：

首先，克隆酵母甲醛脱氢酶蛋白(FLD1)及其启动子。

而后，将酵母甲醛脱氢酶启动子克隆入pPICZaA及pPICZA，获得pFLDZαA及pFLDZA表达载体。所构建的毕赤酵母非甲醇诱导表达载体结构示意图参见图3。

接着，分别将甲醛脱氢酶、增强性绿色荧光蛋白及脂肪酶基因，以合适的位点亚克隆到本发明中已经构建成功的pFLDZαA和pFLDZA表达载体上，同时也亚克隆到载体pPICZαA和pPICZA上，作为表达对照，经提取载体酶切、PCR和序列测定分别获得了相应的重组载体，将重组载体经适合的限制性内切酶线性化后，回收大片段，电转化毕赤酵母P.pastoris，采用Zeocin抗性筛选后，经过高保真PCR鉴定，获得经同源重组正确的阳性毕赤酵母表达株，分别进行表达实验，对于P.pastoris/pPICZαA，P.pastoris/pPICZA重组表达系统采用0.5％甲醇诱导；P.pastoris/pFLDZαA，P.pastoris/pFLDZA重组表达系统采用烷基化胺如甲胺和胆碱进行诱导表达。经过SDS-PAGE检测2组试验所产生的目的蛋白在产量与分泌方式方面有否显著差别。试验结果证明本发明所构建的P.pastoris/pFLDZαA和P.pastoris/pFLDZA表达体系，除了不采用甲醇作为诱导剂外，对目标蛋白的表达水平没有显著的影响。

下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料

以下实验所用主要菌株与试剂来源：酵母细胞系P.pastoris X-33和P.pastorisGS115、pPIC9、载体pPICZαA和pPICZA购自Invitrogen公司；pEGM-T载体、大肠杆菌DH5α菌株、酿酒酵母(S.cerevisiae)来自上海生工生物技术公司。工具酶来自TaKaRa公司，引物合成以及基因测序来自上海英骏生物技术公司。

实施例1.酵母甲醛脱氢酶蛋白(FLD1)及其启动子的克隆

利用酵母基因组提取试剂盒，从酵母细胞系P.pastoris X-33和P.pastoris GS115、酿酒酵母(S.cerevisiae)提取基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，根据已经报道的同源序列设计和利用如下一对引物：PFLD1：5’-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3(Bgl II)；FLD22：5’-TCAGGGCCC TTA GTG CAT AGT AAT CAC AGC-3’(Apa I)以所提酵母基因组为模板，采用常规高保真PCR，扩增出约1.7Kb的DNA条带，经回收与pEGM-T载体连接，获得pEGM-T-FLD，在上海英骏生物技术公司测序后，经过序列分析与比对，发现所克隆序列为SEQ ID NO：1所示。是我们所需要的包含调控区(包括FLD1启动子)的酵母甲醛脱氢酶蛋白(FLD1)的核酸全序列，并包含有一个内含子。

实施例2.P.pastoris/pFLDZαA表达系统的构建

为了构建以FLD1为启动子的P.pastoris/pFLDZαA分泌型表达体系，我们以pEGM-T-FLD为模板，利用引物PFLD1：5’-ACG AGA TCT GCA TGC AGG AAT CTC TGGCAC G-3’(Bgl II)和PFLD2a：GCA CAT ATGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3’(Nde I)高保真扩增出约600bp的FLD1启动子序列，同时分别以pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、、pPICZαB、pPICZC、pPICZαC为模板，以Paf1：5’-CGA CAT ATG AGA TTTCCT TCA ATT TTT ACT GCT-3’(Nde I)；Paf2：5’-TCA GGA TCC ACG AGA AGA AACAAA ATG AC-3’(BamH I)扩增出约4000bp的包含：酵母分泌信号肽a-factor、多克隆位点区、检测纯化标记区与转录终止区，扩增条件采用常规条件，最后将之前获得的约600bp的片段分别与之前获得的约4000bp的片段中的一个，以及经Bgl II-BamH I切割pPICZaA，回收的大约为2200bp的片段相连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，经提取载体酶切、PCR和序列测定鉴定，均符合预期，最终确认获得了用于P.pastoris表达的pFLDZαA表达载体。

实施例3.P.pastoris/pFLDZA表达系统的构建

为了构建以FLD1为启动子的P.pastoris/pFLDZA胞内表达体系，我们以pEGM-T-FLD为模板，利用引物PFLD1：5’-ACG AGA TCT GCA TGC AGG AAT CTC TGGCAC G-3’(Bgl II)和PFLD2：5’-CTG GGA TCC GAA TTC TGT GAA TAT CAA GAATTG TAT GAA C-3’(BamH I-EcoR I)高保真扩增出约600bpd的FLD1启动子序列，然后将这1片段与经Bgl II-EcoR I切割pPICZA回收的大约为2500bp的包含：酵母分泌信号肽a-factor、多克隆位点区、抗性筛选标记、检测纯化标记区与转录终止区的片段相连接，转化大肠杆菌DH5a菌株，经提取载体酶切、PCR和序列测定鉴定，均符合预期，最终获得了用于P.pastoris表达的pFLDZA表达载体。

实施例4.甲醛脱氢酶在P.pastoris/pFLDZαA、P.pastoris/pFLDZA中的诱导表达

为验证所构建的毕赤酵母表达体系中甲醛脱氢酶启动子的作用效果，首先选择该启动子的天然作用对象甲醛脱氢酶作为试验对象，以证实其作用功效。将pEGM-T-FLD1中的甲醛脱氢酶分别以Eco RI与Not I位点亚克隆到本发明中已经构建成功的pFLDZαA和pFLDZA表达载体，同时也以Eco R I与Not I位点亚克隆以采用乙醇氧化酶启动子购自Invitrogen公司的载体pPICZαA和pPICZA，作为表达对照，经提取载体酶切、PCR和序列测定，结果符合预期，分别获得了pFLDZαA-FLD1和pFLDZA-FLD1、pPICZαA-FLD1和pPICZA-FLD1，经SacI酶线性化后，回收大片段，电转化毕赤酵母P.pastoris，采用Zeocin抗性筛选后，经过高保真PCR鉴定符合预期，获得经同源重组正确的阳性毕赤酵母表达株，分别进行表达实验，对于P.pastoris/pPICZαA-FLD1，P.pastoris/pPICZαA-FLD1采用0.5％甲醇诱导；P.pastoris/pFLDZαA-FLD1，P.pastoris/pFLDZA-FLD1采用胆碱进行诱导表达。经过SDS-PAGE检测，发现2组试验所产生的目的蛋白FLD1在产量与分泌方式方面没有显著差别，蛋白序列分析结果也表明表达的蛋白与文献报道的FLD1蛋白序列一致。证明本发明所构建的P.pastoris/pFLDZαA和P.pastoris/pFLDZA表达体系，除了不采用甲醇作为诱导剂外，对目标蛋白FLD1的表达水平没有显著的影响。

实施例5.报告基因在P.pastoris/pFLDZαA、P.pastoris/pFLDZA中的诱导表达

为验证所构建的毕赤酵母表达体系中甲醛脱氢酶启动子对外源蛋白表达启动的作用效果，选择具有显色效果的蛋白质，即增强性绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescence protein，EGFP)为试验对象，以证实其表达功效。利用pEGM-T载体，采用常规方法，构建pEGM-T-EGFP，或将现有的pEGM-T-EGFP中的EGFP蛋白分别以合适的位点亚克隆到本发明中已经构建成功的pFLDZαA和pFLDZA表达载体中，同时也亚克隆到载体pPICZαA和pPICZA(均采用乙醇氧化酶启动子)中，作为表达对照，经提取载体酶切、PCR和序列测定鉴定符合预期，分别获得了pFLDZαA-EGFP和pFLDZA-EGFP、pPICZαA-EGFP和pPICZA-EGFP，经适合的限制性内切酶线性化后，回收大片段，经电转化后毕赤酵母P.pastoris后，采用Zeocin抗性筛选后，经过高保真PCR鉴定符合预期，获得经同源重组正确的阳性毕赤酵母表达株，分别进行表达实验，对于P.pastoris/pPICZαA-EGFP，P.pastoris/pPICZαA-EGFP采用0.5％甲醇诱导；P.pastoris/pFLDZαA-EGFP，P.pastoris/pFLDZA-EGFP采用胆碱进行诱导表达。经过SDS-PAGE等检测，发现2组试验所产生的目的蛋白EGFP在产量与分泌方式方面没有显著差别，蛋白序列分析结果也表明表达的蛋白与文献报道的EGFP蛋白序列一致。证明本发明所构建的P.pastoris/pFLDZαA和P.pastoris/pFLDZA表达体系，除了不采用甲醇作为诱导剂外，对外源目标蛋白EGFP的表达水平没有显著的影响。

实施例6.脂肪酶在P.pastoris/pFLDZαA、P.pastoris/pFLDZA中的诱导表达

脂肪酶是一种广泛应用于医药与食品领域的一种重要酶，该酶的分子结构较为复杂，许多采用大肠杆菌表达体系生产的脂肪酶为没有活性的包涵体，复性较为困难。一些采用酿酒酵母系统来表达，但是其表达效率较低。而选择毕赤酵母表达体系，其不可避免地要用到易燃、易爆、易挥发的有毒甲醇，这无疑会带来诸多便，特别是在最终的产物中易存在有毒甲醇残留，从而极大地影响工程化的脂肪酶在医药与食品领域的应用。为了避免这类事件的发生，本发明采用克隆自Yarrowia lipolytic菌株的脂肪酶lip2在本发明所构建的P.pastoris/pFLDZαA和P.pastoris/pFLDZA体系中表达。

利用pEGM-T载体，采用常规方法，构建pEGM-T-lip2，或将现有的pEGM-T-lip2中的脂肪酶分别以合适的位点亚克隆到本发明中已经构建成功的pFLDZαA和pFLDZA表达载体，同时也亚克隆到以采用乙醇氧化酶启动子购自Invitrogen公司的载体pPICZαA和pPICZA，作为表达对照，经提取载体酶切、PCR和序列测定鉴定分别获得了pFLDZαA-lip2和pFLDZA-lip2、pPICZαA-lip2和pPICZA-lip2，经适合的限制性内切酶线性化后，回收大片段，经电转化后毕赤酵母P.pastoris后，采用Zeocin抗性筛选后，经过高保真PCR鉴定符合预期，获得经同源重组正确的阳性毕赤酵母表达株，分别进行表达实验，对于P.pastoris/pPICZαA-lip2，P.pastoris/pPICZαA-lip2采用0.5％甲醇诱导；P.pastoris/pFLDZαA-lip2，P.pastoris/pFLDZA-lip2采用胆碱进行诱导表达。经过SDS-PAGE等检测，发现2组试验所产生的目的蛋白EGFP在产量与分泌方式方面没有显著差别，蛋白序列分析结果也表明表达的蛋白与文献报道的EGFP蛋白序列一致。证明本发明所构建的P.pastoris/pFLDZαA和P.pastoris/pFLDZA表达体系，除了不采用甲作为诱导剂外，对外源脂肪酶lip2的表达水平没有显著的影响。因此本发明所构建的毕赤酵母表达系统，适合于生产应用于医药与食品领域的重组蛋白质与酶的生产。

序列表

<110>华东理工大学

<120>非甲醇诱导型毕赤酵母蛋白表达系统及其用途

<130>20070427

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>597

<212>DNA

<213>Pichia pastoris

<400>1

gcatgcagga atctctggca cggtgctaat ggtagttatc caacggagct gaggtagtcg    60

atatatctgg atatgccgcc tataggataa aaacaggaga gggtgaacct tgcttatggc    120

tactagattg ttcttgtact ctgaattctc attatgggaa actaaactaa tctcatctgt    180

gtgttgcagt actattgaat cgttgtagta tctacctgga gggcattcca tgaattagtg    240

agataacaga gttgggtaac tagagagaat aatagacgta tgcatgatta ctacacaacg    300

gatgtcgcac tctttcctta gttaaaacta tcatccaatc acaagatgcg ggctggaaag    360

acttgctccc gaaggataat cttctgcttc tatctccctt cctcatatgg tttcgcaggg    420

ctcatgcccc ttcttccttc gaactgcccg atgaggaagt ccttagccta tcaaagaatt    480

cgggaccatc atcgattttt agagccttac ctgatcgcaa tcaggatttc actactcata    540

taaatacatc gctcaaagct ccaactttgc ttgttcatac aattcttgat attcaca       597

<210>2

<211>1140

<212>DNA

<213>Pichia pastoris

<400>2

atgtctaccg aaggtcaaat catcaaatgt aaggcagctg ttgcctggga ggcaggaaag    60

gatctctcta ttgaggagat tgaggttctt cctccaagag cccatgaagt tagagtgaaa    120

gtggaattca ctggtgtatg ccacactgat gcttacacgc tttctggtgc agatgcagag    180

ggaagtttcc ctgttgtgtt cggccatgaa ggtgctggtg ttgtcgagtc agttggagaa    240

ggtgttgagt ccgtgaaggt tggggattct gtagtgcttc tgtacactcc tgagtgcaga    300

gagtgcaagt tctgtctgtc tggtaagacg aacctctgtg gtaaaatcag agccacccag    360

ggtaaaggtt tgttaccaga cgggacttct cgtttccgtt gtaagggcaa ggatttgttt    420

cactatatgg gatgttcttc cttttctcaa tacactgtgg tggctgacat ctcagtggtt    480

aaagtccaag acgaagctcc taaggacaag acatgtctgt tgggttgtgg tgttaccaca    540

gggtacggtg ctgctatcaa cactgctaag atctctaagg gtgacaagat cggtgtgttt    600

ggtgctggat gtattggatt atctgtcatc caaggtgcag tttccaaagg tgcaagcgag    660

attattgtaa ttgacatcaa tgattcaaag aaggcatggg cggaccaatt tggtgcaact    720

aagtttgtca atcctacaac cttaccagaa ggtaccaata ttgttgacta cttgattgat    780

atcactgacg gaggctttga ctataccttc gactgtaccg gtaatgttca agtaatgaga    840

aatgcacttg aatcttgcca caagggttgg ggtgagtcga tcatcatcgg tgtcgctgct    900

gctggtaaag aaatctctac ccgtcctttc cagttggtta ctggcagagt ctggagagga    960

tgcgcctttg gaggtatcaa gggacgtact caaatgccat ctttggttca ggactatctt    1020

gatggtaaga ttaaagttga cgagtttatc acacacagac atgacctgga caacatcaac    1080

aaageatttc atgacatgca tgctggaaac tgtattcgtg ctgtgattac tatgcactaa    1140

<210>3

<211>379

<212>PRT

<213>Pichia pastoris

<400>3

Met Ser Thr Glu Gly Gln Ile Ile Lys Cys Lys Ala Ala Val Ala Trp

1               5                   10                  15

Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ser Ile Glu Glu Ile Glu Val Leu Pro Pro

            20                  25                  30

Arg Ala His Glu Val Arg Val Lys Val Glu Phe Thr Gly Val Cys His

        35                  40                  45

Thr Asp Ala Tyr Thr Leu Ser Gly Ala Asp Ala Glu Gly Ser Phe Pro

    50                  55                  60

Val Val Phe Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Glu Ser Val Gly Glu

65                  70                  75                  80

Gly Val Glu Ser Val Lys Val Gly Asp Ser Val Val Leu Leu Tyr Thr

                85                  90                  95

Pro Glu Cys Arg Glu Cys Lys Phe Cys Leu Ser Gly Lys Thr Asn Leu

            100                 105                 110

Cys Gly Lys Ile Arg Ala Thr Gln Gly Lys Gly Leu Leu Pro Asp Gly

        115                 120                 125

Thr Ser Arg Phe Arg Cys Lys Gly Lys Asp Leu Phe His Tyr Met Gly

    130                 135                 140

Cys Ser Ser Phe Ser Gln Tyr Thr Val Val Ala Asp Ile Ser Val Val

145                 150                 155                 160

Lys Val Gln Asp Glu Ala Pro Lys Asp Lys Thr Cys Leu Leu Gly Cys

                165                 170                 175

Gly Val Thr Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Ile Asn Thr Ala Lys Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Gly Asp Lys Ile Gly Val Phe Gly Ala Gly Cys Ile Gly Leu Ser

        195                 200                 205

Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Lys Gly Ala Ser Glu Ile Ile Val Ile

    210                 215                 220

Asp Ile Asn Asp Ser Lys Lys Ala Trp Ala Asp Gln Phe Gly Ala Thr

225                 230                 235                 240

Lys Phe Val Asn Pro Thr Thr Leu Pro Glu Gly Thr Asn Ile Val Asp

                245                 250                 255

Tyr Leu Ile Asp Ile Thr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Thr Phe Asp Cys

            260                 265                 270

Thr Gly Asn Val Gln Val Met Arg Asn Ala Leu Glu Ser Cys His Lys

        275                 280                 285

Gly Trp Gly Glu Ser Ile Ile Ile Gly Val Ala Ala Ala Gly Lys Glu

    290                 295                 300

Ile Ser Thr Arg Pro Phe Gln Leu Val Thr Gly Arg Val Trp Arg Gly

305                 310                 315                 320

Cys Ala Phe Gly Gly Ile Lys Gly Arg Thr Gln Met Pro Ser Leu Val

                325                 330                 335

Gln Asp Tyr Leu Asp Gly Lys Ile Lys Val Asp Glu Phe Ile Thr His

            340                 345                 350

Arg His Asp Leu Asp Asn Ile Asn Lys Ala Phe His Asp Met His Ala

        355                 360                 365

Gly Asn Cys Ile Arg Ala Val Ile Thr Met His

    370                 375

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>4

acgagatctg catgcaggaa tctctggcac g                              31

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>5

ctgggatccg aattctgtga atatcaagaa ttgtatgaac                     40

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>6

acgagatctg catgcaggaa tctctggcac g                              31

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>7

gcacatatgt gaatatcaag aattgtatga ac                             32

<210>8

<211>51

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>8

actggatccc atatgtctac cgaaggtcaa atcatcaaat gtaaggcagc t        51

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>9

tcagggccct tagtgcatag taatcacagc                                30

Claims (12)

1.一种毕赤酵母表达载体，其特征在于，其启动子序列为酵母的甲醛脱氢酶启动子FLD1序列。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述启动子序列为SEQ ID NO：1。

3.如权利要求1或2所述的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述表达载体为分泌型表达载体或胞内表达载体。

4.如权利要求3所述的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述分泌型表达载体为pFLDZαA，所述胞内表达载体为pFLDZA。

5.权利要求1-4中任一权利要求所述毕赤酵母表达载体的制备方法，包括下列步骤：

(a)克隆毕赤酵母FLD1蛋白结构基因与调控序列；

(b)将克隆产物采用合适的限制性酶切位点切割后，与去除乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母表达载体pPICZA或pPICZαA连接。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其中克隆毕赤酵母FLD1蛋白结构基因与调控序列时，采用PCR方法进行克隆，PCR所用引物选自下组：

1)PFLD1：5’-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3；

2)PFLD2：5’-CTGGGATCC GAATTCTGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3’；

3)PFLD1：5’-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3；

4)PFLD2a：GCA CATATGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3’；

5)FLD11：5’-ACT GGATCC CATATGTCTACCGAAGGTCAAATCATCAAATGTA

AGGCA GCT-3’；

6)FLD22：5’-TCA GGGCCC TTA GTG CAT AGT AAT CAC AGC-3’。

7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，其中克隆获得的FLD1蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

8.权利要求1-4中任一权利要求所述毕赤酵母表达载体用于表达生产外源蛋白。

9.一种毕赤酵母表达系统，其特征在于，其表达载体为权利要求1-4中任一权利要求所述毕赤酵母表达载体，宿主为毕赤酵母P.pastoris，表达诱导物为无毒氮源成分。

10.如权利要求9所述的毕赤酵母表达系统，其特征在于，所述无毒氮源成分为烷基化胺。

11.如权利要求10所述的毕赤酵母表达系统，其特征在于，所述烷基化胺选自甲胺或胆碱。

12.权利要求9-11中任一权利要求所述的毕赤酵母表达系统用于表达或生产医药或者食品用途的重组蛋白质。

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