CN101748077B

CN101748077B - 表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN101748077B
Application number: CN 200810239474
Authority: CN
Inventors: 杨贞耐; 张莉; 王景会; 姜媛媛; 李玉秋
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-12-11
Filing date: 2008-12-11
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2028-12-11
Also published as: CN101748077A

Abstract

本发明公开了一种表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用。本发明的重组毕赤酵母，是将凝乳酶基因导入毕赤酵母中获得表达凝乳酶的重组菌。所述凝乳酶基因的核苷酸序列是序列表中的序列1。本发明还公开了构建所述重组毕赤酵母的方法。本发明的重组毕赤酵母可用来生产牛凝乳酶。

Description

表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用。

背景技术

凝乳酶是从未断奶的小牛皱胃中提取的一种天冬氨酸蛋白酶，它可以切断κ-酪蛋白导致乳的凝固。凝乳酶主要的生物学功能是水解牛乳中κ-酪蛋白的Phe₁₀₅-Met₁₀₆键，导致牛乳凝结，因此被广泛用于干酪制造业，这个过程应用在干酪生产的第一阶段。传统的凝乳酶通过宰杀未断奶小牛从皱胃中提取。目前世界年均约5000万头小牛被宰杀供提取凝乳酶，由于全球性的小牛短缺使其来源变得不稳定，这种传统而昂贵的制法已不能满足世界干酪需求量不断增长的需要。利用微生物生物工程技术生产凝乳酶可以获得高纯度的凝乳酶，生产成本低，来源稳定。目前美国有70％、英国有90％的干酪是用生物工程凝乳酶生产的。

我国自80年代就开展了凝乳酶的研究，1988年，谭思元等人研究了凝乳酶原mRNA的分离及其cDNA的克隆，成功分离了poly(A)RNA中含有全链长的凝乳酶原mRNA，并通过拼接pCT5及pCT15获得完整的凝乳酶原基因。中科院微生物所研究了凝乳酶原分子折叠和酶复性(唐兵，杨开宇1997；黎红晔等1998；陈红杰等2001)，并通过进一步对大肠杆菌中表达调控的研究，在大肠杆菌中表达了牛凝乳酶(王革等1994)。王志林等(2003)克隆了木瓜凝乳酶基因。

我国仅有一项关于牛凝乳酶基因工程的技术专利—大肠杆菌中表达外源基因的质粒和牛凝乳酶原的生产方法(ZL95105337X)。在凝乳酶的提取方面，有一项关于从犊牛皱胃中提取凝乳酶的技术专利，一项关于从木瓜中提取蛋白酶的技术专利(CN200410046107.6)。

毕赤酵母表达系统具有表达量高、能进行蛋白质翻译后修饰、容易大规模生产、生产成本低、外源蛋白基因遗传稳定性较好等特点，目前国内外已有数百种外源蛋白基因在毕赤酵母中表达。Pichia.pastoris基因表达系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点：(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；(2)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(3)菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高； (4)毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。目前，在我国尚未见到利用毕赤氏酵母表达牛凝乳酶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用。

本发明所提供的表达凝乳酶的毕赤酵母，是将凝乳酶基因导入毕赤酵母中获得表达凝乳酶的重组菌。

其中，所述凝乳酶基因来源于从小牛皱胃。

所述凝乳酶基因的核苷酸序列具体是序列表中的序列1。毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。它能够对外源蛋白进行翻译后加工，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，是一种广泛应用的真核表达系统。所述毕赤酵母具体可为毕赤酵母GS115。

本发明的另一个目的是提供一种构建所述重组毕赤酵母的方法，包括如下步骤：

1)在酵母表达载体的多克隆位点插入凝乳酶基因构建重组酵母表达载体；

2)将所述重组酵母表达载体导入毕赤酵母中获得表达凝乳酶的重组菌。

其中，所述酵母表达载体可为pPICZaA载体。所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

本发明构建的表达凝乳酶的毕赤酵母中的一株命名为毕赤酵母DS115/pPICZαA/Chy，毕赤酵母DS115/pPICZαA/Chy(Pichia pastoris)已于2008年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏号为CCTCC NO.M 208217。

本发明所述的重组毕赤酵母可用来生产凝乳酶。

本发明首次在毕赤酵母表达系统中分泌表达了牛凝乳酶，分泌表达无需破碎细胞且培养基中杂蛋白含量极低，纯化步骤简单，适宜工业化生产。毕赤酵母适合于工业规模的高密度发酵，培养基廉价，操作简单，产物具有很好的生物安全性，适用于食品和医药等领域。

附图说明

图1为XhoI和XbaI酶切鉴定重组菌。

图2为酵液上清的SDS-PAGE电泳检测结果。

具体实施方式

实施例1、表达牛凝乳酶的毕赤酵母

1)牛凝乳酶Chy的克隆

从刚出生的小牛皱胃中提取粘膜，加入液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管。室温放置10min，使其充分裂解，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃ 12,000g离心15min，吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。4℃ 12,000g离心10min，弃上清，按1ml75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃ 8,000g离心5min，弃上清，室温晾干5-10min，用70ul TE溶解总RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。

设计引物P1和P2，扩增牛凝乳酶基因，引物P1和P2的核苷酸序列如下：

P1：5’ATGAGGTGTCTCGTGGTGCTAC 3’；

P2：5’GGGACAGTGAGGTTCTTGGT 3’。

PCR反应体系如下：

10X PCR Buffer Minus Mg 5μl、50mM MgCl₂ 1.5μl、10mM dNTP Mix 1μl、20uM P1 0.5μl、20uM P2 0.5μl、Platium tag DNA polymerase(5U/μl)0.4μl、cDNA 2μl、DEPC水39.1μl，总体积50μl。

反应条件：94℃变性30s，52℃退火30s、72℃延伸90s、32次循环，72℃延伸10min。

用Fermentas公司的DNA Extraction Kit试剂盒(#K0513)回收PCR产物，PCR产物与pMD18-T载体16℃连接，构建重组载体pMD18-Chy，重组载体pMD18-Chy转化大肠杆菌JMi09感受态细胞，获得重组菌，挑取重组菌单克隆，提取质粒，进行测序，测序结果表明扩增的牛凝乳酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2)表达牛凝乳酶(Chy)的毕赤酵母的构建

设计引物ZaAPreS1和ZaAPreS2，引物的核苷酸序列如下：

ZaAPreS1：5’CGCTCGAGAAAAGAATGAGGTGTCTCGTGGT 3’(下划线为Xho I酶切位点)(AAAAGA为pPICZα系列载体α分泌因子的Kex2切割位点)

ZaAPreAS2：5’TGCTCTAGAATGATGGCTTTGGCCAGCC 3’(下划线为Xba I酶切位点)

以ZaAPreS1和ZaAPreS2为引物，重组载体pMD18-Chy作为模板，用TaKaRa公司的Ex Taq酶进行PCR扩增。

反应条件：94℃预变性5min；然后进行94℃变性30s，52℃退火30s、72℃ 延伸90s，32次循环；72℃延伸10min。

用Fermentas公司的DNA Extraction Kit试剂盒(#K0513)回收PCR产物，PCR产物用XhoI和XbaI双酶切与用同样酶切的pPICZaA载体在T4 DNA连接酶的作用下22℃连接，构建重组表达载体pPICZaA-Chy，重组载体pPICZaA-Chy转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组菌，挑取重组菌单克隆，提取质粒用XhoI和XbaI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示。酶切产物中目的条带在1.7kb左右的克隆为阳性克隆。图1中，“1”为Marker，“2”为重组菌酶切产物。

重组载体pPICZaA-Chy和pPICZaA载体用Sac I酶切后，分别电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得重组菌，重组菌用MMH和MDH平板筛选，整合Chy基因的毕赤酵母p-Chy和转入pPICZaA载体的毕赤酵母pA。

MMH平板由如下物质组成：

1.34g/100mlYNB，4×10^-5g/100ml生物素，0.5ml/100ml甲醇，0.04g/100ml组氨酸，1.5g/100ml琼脂。

MDH平板由如下物质组成：

1.34g/100mlYNB，4×10^-5g/100ml生物素，2g/100ml葡萄糖，0.04g/100ml组氨酸，1.5g/100ml琼脂。

挑选毕赤酵母p-Chy和毕赤酵母pA单菌落于BMGY培养基中，30℃/300rpm培养至OD₆₀₀＝2-6；收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD₆₀₀＝1.0左右，向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5％；每24小时添加甲醇至终浓度0.5％，96h后结束诱导，SDS-PAGE电泳检测诱导96h后发酵液上清。

BMGY培养基组成成分：

1g/100ml酵母粉，2g/100ml蛋白胨，100mM pH6.0磷酸钾，1.34g/100mlYNB，4×10^-5g/100ml生物素，1g/100ml甘油。

BMMY培养基组成成分：

1g/100ml酵母粉，2g/100ml蛋白胨，100mM pH6.0磷酸钾，1.34g/100mlYNB，4×10^-5g/100ml生物素，0.5ml/100ml甲醇。

SDS-PAGE电泳结果如图2所示，在分子量42kDa处有明显的条带，略大于天然牛凝乳酶，这是由于重组蛋白上带有表达载体的部分片段，使目的蛋白的大小增加。使用Gelpro软件对蛋白条带进行扫描分析，表达蛋白占上清总蛋白的28.7％。

图2中，“1”代表诱导96小时毕赤酵母pA的发酵液上清，“3”代表诱导96小时毕赤酵母p-Chy的发酵液上清。

取毕赤酵母p-Chy诱导96小时的发酵液1L，使用Bradford法测菌液总蛋白含量为0.92g/L。3000g离心5min，收集上清液，使用Bradford法测上清液蛋白含量为0.18g/L。经计算得到表达Chy蛋白约占细胞总蛋白的5.6％(计算方法为：0.18×28.7％/0.92＝0.056)。然后加入饱和过硫酸铵溶液至过硫酸铵终浓度为60％，4℃放置过夜。12000g离心10min，收集蛋白沉淀，真空冷冻干燥，得到Chy酶制剂4.3g。

Bradford法测总蛋白含量的步骤如下：

1、分别在各个玻璃试管中加入5，10，15，20，25，30，40，60，80，100μl1mg/mL BSA，以双蒸水补足100μl，同时以100μl的双蒸水作空白对照。

2、每管加入1ml考马氏亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。

3、用1cm光径的微量比色检测A595，取A595吸光度值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，用Excel求出标准方程。

4、取100μl稀释后的待测样品，加入同样体积的考马氏亮蓝溶液1ml，摇匀，室温静置2分钟，以空白管调零比色，将吸光度值代入标准方程，算出样品的蛋白质浓度。

取毕赤酵母pA诱导96小时的发酵液1L，3000g离心5min，收集上清液，然后加入饱和过硫酸铵溶液至过硫酸铵终浓度为60％，4℃放置过夜。12000g离心10min，收集蛋白沉淀，真空冷冻干燥，得到pA酶制剂4.86g。

3)凝乳酶酶活测定

采用Arima K的方法进行凝乳酶活的测定。用0.01mol/L CaCl₂溶液配制10％脱脂乳。此溶液配制后在室温下放置40min后使用，取5ml 10％脱脂乳于35℃保温10min，分别加入适量稀释的Chy酶制剂和pA酶制剂，震荡均匀并开始计时，观察管壁上开始出现凝乳颗粒为终点，记录凝乳时间。在上述条件下，40min凝结1ml 10％脱脂乳的酶量定义为一个Soxhlet单位(SU)，实验重复3次，结果以三次重复的平均值表示。

凝乳酶活的测定结果表明，Chy酶制剂的活力为1000SU/g(4300SU/L发酵液)，pA酶制剂未检测出凝乳活力。

Chy酶制剂的活力为1000SU/g的毕赤酵母p-Chy命名为毕赤酵母DS115/pPICZ αA/Chy，毕赤酵母DS115/pPICZαA/Chy已于2008年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉大学)，保藏号为CCTCC NO.M 208217。

序列表

<110>吉林省农业科学院

<120>表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用

<130>CGGNARW81997

<160>1

<210>1

<211>1279

<212>DNA

<213>牛属牛

<400>1

Claims

1.一种重组毕赤酵母，其特征在于：所述重组毕赤酵母的名称为Pichia pastorisGS115/pPICZαA/Chy，其保藏号为CCTCC NO：M 208217，保藏日为2008年11月12日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述的重组毕赤酵母在生产凝乳酶中的应用。