CN106591161A

CN106591161A - 一种产凝乳酶的重组毕赤酵母及其应用

Info

Publication number: CN106591161A
Application number: CN201611157248.4A
Authority: CN
Inventors: 丁重阳; 张琦; 艾连中; 王琼; 杭锋; 苑畅; 石贵阳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明公开了一种产凝乳酶的重组毕赤酵母及其应用，属于酶工程技术领域。本发明构建的重组毕赤酵母，是将自筛的Bacillus amyloliquefaciens JNU002的凝乳酶基因cMCE导入毕赤酵母GS115中获得凝乳酶的重组菌。本发明应用该重组菌进行发酵，并通过每12h流加12g/L的蛋白胨，提高了发酵液中凝乳酶的酶活，使凝乳酶活相对于改进前提高了6.8倍。该方法制备的凝乳酶杂蛋白少，易纯化，安全性好，适于工业生产。

Description

一种产凝乳酶的重组毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明涉及一种产凝乳酶的重组毕赤酵母及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

凝乳酶是一种最早在未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，可专一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键，破坏酪蛋白胶束使牛奶凝结，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成为干酪生产中形成质构和特殊风味的关键性酶，被广泛地应用于奶酪和酸奶的制作。

细菌生长周期短，但是存在发酵过程中生物量偏少，目的蛋白含量少难于分离提取，蛋白水解能力强，菌种不符合工业生产安全要求等多方面问题，所以找到合适的真菌宿主异源表达细菌源凝乳酶很有必要。

最近，我国也在基因工程凝乳酶的研究方面获得了一定的进展。冯镇等(2008)将牛凝乳酶基因在乳酸克鲁维酵母中表达，得到了具有凝乳活性的凝乳酶。邱重晏等(2005)也将微小毛霉凝乳酶在巴斯德毕赤酵母中进行表达，所获重组菌种在诱导96-102h后，酶活性达到5.4S SU/mL。王博达等尝试在大肠杆菌中异源表达凝乳酶，但重组菌分泌到胞外的凝乳酶活力仅为4.67SU·m L(《一种细菌凝乳酶基因的克隆及表达的研究》，2015年)。研究并构建一种能够高效表达并高产能够分泌到胞外的凝乳酶的基因工程菌对于凝乳酶的工业化生产具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种表达细菌来源凝乳酶的重组毕赤酵母，是以pPIC9K为载体，在毕赤酵母中表达SEQ ID NO.1所示基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母是以毕赤酵母GS115为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述SEQ ID NO.1所示的基因来源于Bacillusamyloliquefaciens JNU002，已于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2011045。

本发明的第二个目的是提供所述重组毕赤酵母的构建方法，是以pPIC9K为载体，将SEQ ID NO.1的基因在毕赤酵母中进行表达。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

1)在酵母表达载体的多克隆位点插入凝乳酶基因构建重组酵母表达载体；

2)将所述重组酵母表达载体导入毕赤酵母中获得表达凝乳酶的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母表达载体为pPIC9K。所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

本发明的第三个目的是提供一种凝乳酶的生产方法，所述方法是将所述重组菌接种至发酵培养基中，30℃培养48～96h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为BMMY培养基，每L含有：10g/L酵母粉，20g/L蛋白陈，3g/L磷酸氢二钾，11.8g/L磷酸二氢钾，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5ml/L甲醇。

在本发明的一种实施方式中，每12h添加终浓度0.5％(v/v)的甲醇进行诱导。

本发明的第四个目的是提供一种提高凝乳酶产量的方法，是在所述生产方法的基础上，每12h加入12～14g/L的蛋白胨。

本发明还提供所述方法在制备含凝乳酶的产品中的应用。

有益效果：(1)本发明改善了甲醇诱导表达培养基，减少了目的蛋白的损耗，提高了单位发酵液的酶活，使分泌到胞外的凝乳酶活达到122SU/L，为工业生产创造了更大的商业价值；(2)本发明首次在毕赤酵母表达系统中分泌表达了解淀粉芽孢杆菌源凝乳酶，使其在胞外分泌表达，无需破碎细胞且培养基中杂蛋白含量极低，纯化步骤简单，适宜工业化生产。毕赤酵母适合于工业规模的高密度发酵，培养基廉价，操作简单，产物具有很好的生物安全性，适用于食品和医药等领域。

附图说明

图1为EcoR I和Not I双酶切鉴定重组菌凝胶电泳图；1～5，酶切后的重组转化子；M₁，2000bp Marker；M₂，10000bp Marker；

图2为Sac I酶切位点线性化琼脂糖凝胶图；1，Sac I酶切后；2，重组载体pPIC9K-cMCE；M：10000bp Marker；

图3为转化子菌落PCR验证的结果；M₁，2000bp Marker；M₂，10000bp Marker；1～11，重组转化子

图4为酵液上清的SDS-PAGE电泳检测结果；M，marker；1，诱导96小时毕赤酵母P-cMCE的发酵液浓缩上清

图5为每12h流加不同浓度的蛋白胨对凝乳酶活的影响

具体实施方式

凝乳酶酶活测定：

采用Arima方法，1ml上清液35℃保温5min，加入到于35℃保温10min的5mL 10％脱脂牛奶中，计时，至管壁出现颗粒为止。记录凝乳时间T。酶活定义：在35℃温度下，40min凝乳1mL 10％脱脂乳的酶量为一个酶活单位(SU)。

按如下公式计算凝乳酶活力：凝乳酶活力＝[(5×2400)/(0.5×T)]×n；其中：T为凝乳时间(s)，n为稀释倍数。实验重复3次，结果以三次重复的平均值表示。

培养基：

BMGY培养基：10g/L酵母粉，20g/L蛋白陈，3g/L磷酸氢二钾，11.8g/L磷酸二氢钾，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，10g/L甘油。

BMMY培养基：10g/L酵母粉，20g/L蛋白陈，3g/L磷酸氢二钾，11.8g/L磷酸二氢钾，13.4g/L YNB,4×10^-4g/L生物素，5ml/L无水甲醇。

MM培养基：13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5ml/L甲醇，15g/L琼脂。

MD培养基：13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，20g/L葡萄糖，0.4g/L组氨酸，15g/L琼脂。

实施例1

(1)解淀粉芽孢杆菌凝乳酶cMCE的克隆

在500mL摇瓶里培养Bacillus amyloliquefaciens JNU002至OD₆₀₀于3.0左右，取1.5mL发酵液，12000rpm离心30s，再用无菌水洗涤两次。加入600μL无菌水重悬，再加入15μL溶菌酶(10mg/mL)，37℃水浴30min。加入60μL 10％SDS混匀后立即添加10uL蛋白酶K(20mg/mL)，65℃水浴2～6h。取600μL处理液于新管，加入等体积酚氯仿，12000rpm，离心5min，取上清，加入等体积的酚氯仿，抽提2～4次，直到白色沉淀较少，取上清，加入等体积的氯仿，抽提2次。混入1/10体积的乙酸钾(10mol/L)，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀染色体，晾干乙醇，溶于50μL无菌水中，琼脂糖凝胶电泳验证并4℃保存染色体。

根据cMCE序列1来设计引物P1和P2，扩增凝乳酶基因cMCE，引物P1和P2的核苷酸序列如下：

P1(p9K-EcoR I-F)：5’CCGGAATTCGTGAGAGGCAAAAAAGTATG3'

P2(p9K-Not I-R)：5'ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGAGCTGCCGCCTGTA3'

PCR反应体系如下:super pfu PCR Master Mix 50μL,ddH2O 50μL，20μM/L P1 2μL,20μM/L P2 2μL，总体积100μL，分装10管，每管10μL。反应条件:94℃预变性5min，94℃变性30s，45℃/68℃(8个梯度)退火30s，72℃延伸80s、29次circle，72℃延伸10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择8个梯度中最合适的退火温度，按照原来的体系进行PCR。由于使用super pfu作为DNA聚合酶，PCR产物没有粘性末端。取30μL PCR产物加入30μL的Taq PCR Master Mix，72℃金属浴10min。

用杭州宝赛生物科技有限公司的试剂盒(PE03)纯化PCR产物，PCR产物与T-vector-19PMD(simple)载体通过SolutionⅠ连接酶在16℃金属浴下过夜连接，构建重组载体19Tsimple-cMCE，重组载体T-vector-19PMD(simple)转化到大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组菌，挑取重组菌单克隆，提取质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果表明扩增的凝乳酶基因的核昔酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(2)构建表达凝乳酶(cMCE)的载体：

用EcoR I和Not I双酶切重组载体19Tsimple-cMCE，用同样的方式酶切的pPIC9K载体，通过切割琼脂糖凝胶纯化回收，SolutionⅠ连接(10μL)体系：pPIC9K载体3μL，目的片段2μL，SolutionⅠ连接酶Mix 5μL。在SolutionⅠ连接酶的作用下16℃连接，构建重组表达载体pPIC9K-cMCE。

重组载体pPIC9K-cMCE转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组菌，挑取重组菌单克隆，提取质粒用EcoR I和Not I进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示。酶切产物中目的条带在1.2kb左右的克隆为阳性克隆。

将重组质粒pPIC9K-cMCE送于生工生物工程(上海)股份有限公司测序，通过DNAman序列比对结果，结果显示，一致性达到100％，符合异源表达的要求。

重组载体pPIC9K-cMCE用Sac I酶切线性化后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。左起第一和第二泳道分别为线性化前后的重组质粒pPIC9K-cMCE。

2500V，5ms电转化毕赤酵母GSll5感受态细胞先后涂布到MM和MD平板上，筛选出His⁺和Mut⁺型转化子P-cMCE。

挑选转化子进行菌落PCR验证，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。

挑选转化子于BMGY培养基中，30℃/300rpm培养至0D₆₀₀＝2～6；收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD₆₀₀＝5.0左右，向培养基中添加无水甲醇至终浓度为0.5％(v/v，5mL甲醇/L培养基)；每12h添加终浓度0.5％(v/v)的甲醇，96h后结束诱导，浓缩诱导96h后发酵液上清。

取毕赤酵母P-cMCE诱导96小时的发酵液100mL，然后加入饱和过硫酸按溶液至过硫酸按终浓度为60％，4℃放置过夜。10000rpm离心10min，收集蛋白沉淀，收集蛋白沉淀，真空冷冻干燥，得到P-cMCE酶制剂0.566g。10mL磷酸缓冲盐溶液复溶，取20ul样品进行SDS-PAGE电泳检测。

SDS-PAGE电泳结果如图4所示，在分子量27kDa处有明显的条带，符合原菌凝乳酶蛋白大小。凝乳酶活的测定结果表明，P-cMCE发酵液凝乳酶活为18SU/g。

实施例2

按实施例1的方法在相同条件下进行凝乳酶发酵，区别在于，每12h分别流加2、4、6、8、10、12、14、16、18g/L的蛋白胨，比较不同蛋白胨浓度对凝乳酶活的影响。如图5所示，当流加蛋白胨的浓度提升达到12～14g/L时，凝乳酶活达到最大值122SU/L，相比于对照(用BMMY培养基发酵)凝乳酶活提高了6.8倍。当蛋白胨浓度过高时，发酵液粘度变大，单位体积溶氧量下降，影响菌体的生长代谢，导致酶活下降。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产凝乳酶的重组毕赤酵母及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgagaggca aaaaagtatg gatcagtttg ctgtttgctt tagcgttaat ctttacgatg 60

gcgttcggca gcacatcctc tgcccaggcg gcagggaaat caaacgggga aaagaaatat 120

attgtcgggt ttaaacagac aatgagcacg atgagcgccg ctaagaagaa agatgtcatt 180

tctgaaaaag gcgggaaagt gcaaaagcaa ttcaaatatg tagacgcagc ttcagctaca 240

ttaaacgaaa aagctgtaaa agaattgaaa aaagacccga gcgtcgctta cgttgaagaa 300

gatcacgtag cacatgcgta cgcgcagtcc gtgccttacg gcgtatcaca aattaaagcc 360

cctgctctgc actctcaagg ctacactgga tcaaatgtta aagtagcggt tatcgacagc 420

ggtatcgatt cttctcatcc tgatttaaag gtagcaggcg gagccagcat ggttccttct 480

gaaacaaatc ctttccaaga caacaactct cacggaactc acgttgccgg cacagttgcg 540

gctcttaata actcaatcgg tgtattaggc gttgcgccaa gcgcatcact ttacgctgta 600

aaagttctcg gtgctgacgg ttccggccaa tacagctgga tcattaacgg aatcgagtgg 660

gcgatcgcaa acaatatgga cgttattaac atgagcctcg gcggaccttc tggttctgct 720

gctttaaaag cggcagttga taaagccgtt gcatccggcg tcgtagtcgt tgcggcagcc 780

ggtaacgaag gcacttccgg cagctcaagc acagtgggct accctggtaa atacccttct 840

gtcattgcag taggcgctgt tgacagcagc aaccaaagag catctttctc aagcgtagga 900

cctgagcttg atgtcatggc acctggcgta tctatccaaa gcacgcttcc tggaaacaaa 960

tacggggcgt acaacggtac gtcaatggca tctccgcacg ttgccggagc ggctgctttg 1020

attctttcta agcacccgaa ctggacaaac actcaagtcc gcagcagttt agaaaacacc 1080

actacaaaac ttggtgattc tttctactat ggaaaagggc tgatcaacgt acaggcggca 1140

gctcagtaa 1149

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccggaattcg tgagaggcaa aaaagtatg 29

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ataagaatgc ggccgcttac tgagctgccg cctgta 36

Claims

1.一种表达细菌来源凝乳酶的重组毕赤酵母，其特征在于，以pPIC9K为载体，在毕赤酵母中表达SEQ ID NO.1所示基因。

2.根据权利要求2所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母是以毕赤酵母GS115为宿主。

3.权利要求1所述的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，以pPIC9K为载体，将SEQID NO.1的基因与载体连接，并在毕赤酵母中进行表达。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在酵母表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO.1所示的编码凝乳酶的基因，构建重组酵母表达载体；(2)将所述重组酵母表达载体导入毕赤酵母GS115中获得表达凝乳酶的重组菌。

5.一种凝乳酶的生产方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组毕赤酵母接种至发酵培养基中，30℃培养48～96h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为BMMY培养基，每L含有：10g/L酵母粉，20g/L蛋白陈，3g/L磷酸氢二钾，11.8g/L磷酸二氢钾，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5ml/L甲醇。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，每12h加入终浓度12～14g/L的蛋白胨。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，每12h添加终浓度5～10mL/L的甲醇进行诱导。

9.权利要求1或2所述的重组毕赤酵母在制备含凝乳酶的产品中的应用。