CN108018216B - 提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸酸产量的方法及应用，该方法是通过敲除生产柠檬酸的黑曲霉中的葡萄糖基转移酶基因，构建基因工程菌，并将其用于柠檬酸发酵来实现。葡萄糖基转移酶基因的敲除可以使还原糖含量降低8.96‑9.89％，总糖含量降低9.78‑10.26％，异麦芽糖含量降低6.12‑7.01％，柠檬酸产量提高10.28‑12.16％，一年可以减少残糖至少约1.5万吨，具有显著的经济效益。

Description

提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用

技术领域：

本发明属于基因工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种通过基因工程手段提高产柠檬酸工业菌株的糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用。

背景技术：

柠檬酸(citric acid)又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷-1，2，3-三羟酸(2-hydroxytricarboxylic acid)，是一种三羧酸类化合物，易溶于水，无毒，无臭，具有很强的酸味，是一种重要的、多功能的有机酸，广泛应用于食品、医药化工等领域。柠檬酸全球产量超过170万吨，随着在生物聚合、药物运输、细胞培养等新兴产业领域的广泛应用，每年以5％的速度增长，是世界第二大发酵产品，产量仅次于酒精产量。我国是柠檬酸的主要生产国和出口国，年产量占世界总产量的70％，但由于柠檬酸国际市场竞争激烈，整个柠檬酸行业处于非常困难的状况。国际上有大量的研究在不断推进柠檬酸发酵的生产工艺，同时作为发酵的基础，柠檬酸生产菌种黑曲霉的改良也一直是研究人员所关注的焦点，获得更优质的生产菌株对巩固我国柠檬酸生产大国的地位和促进柠檬酸行业的发展有重要的现实意义。

尽管我国在柠檬酸发酵行业取得巨大进步，但柠檬酸发酵单位粮耗仍在1.8t左右，发酵残糖约2％-3％。目前我国柠檬酸产率在160-175g/L，按2016年我国柠檬酸产量约130万吨计算，一年发酵形成的残糖最少约15万吨，造成原料的极大浪费。因此，如何降低残糖是提高糖类利用率和柠檬酸产量的关键因素。

通过对柠檬酸发酵液残糖成分进行分析，残糖的主要成分是非发酵性的异麦芽糖。异麦芽糖是由α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)的催化形成的。α-葡萄糖苷酶又叫α-D-葡萄糖苷水解酶，以前称作麦芽糖酶(maltase)。

葡萄糖基转移酶的功能是催化活化的葡萄糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。本申请意外地发现，敲除产柠檬酸工业菌株中的一种葡萄糖基转移酶(candidate glucosyltransferase)，可以降低残糖和异麦芽糖的含量，提高糖类利用率和柠檬酸的产量。根据NCBI的基因注释，该葡萄糖转移酶的功能是将长链醇磷酸上活化的葡萄糖基转移到Man9GlcNAc2-dolichyl-pyrophosphate上，涉及N-糖基化途径(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/134057334)，并不参加残糖和异柠檬酸的形成。因此，目前对该基因降低残糖和异麦芽糖含量的作用原理尚不清楚。

本发明通过对产柠檬酸黑曲霉菌株的基因组进行分析和基因敲除，证明敲除该葡萄糖基转移酶基因(candidate glucosyltransferase)能够有效降低发酵液中的残糖特别是异麦芽糖的含量，提高糖类利用率和柠檬酸产量。

发明内容：

为了解决现有技术中柠檬酸发酵过程中形成2％-3％的残糖，导致糖利用率和柠檬酸产量低的问题，本发明将通过对柠檬酸生产菌株黑曲霉进行分子改造，通过农杆菌介导的方法敲除黑曲霉中一个注释为葡萄糖基转移酶(candidate glucosyltransferase)的基因，构建基因工程菌，降低发酵液中的残糖，提高糖的利用率，同时提高柠檬酸产量。

所述基因工程菌通过敲除黑曲霉出发菌株中的一个葡萄糖基转移酶基因获得的；

所述基因工程的出发菌株为黑曲霉γ-144或黑曲霉Co860；

进一步地，所述的基因工程菌具体为黑曲霉KO-174680；

所述基因工程的出发菌株还可以是黑曲霉ATCC1015；

所述的葡萄糖基转移酶氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

进一步地，所述的葡萄糖基转移酶基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

进一步地，用于敲除葡萄糖基转移酶基因(candidate glucosyltransferase)的载体为pPZP-HYG2(Walton FJ,et al，Novel gene functions required formelanization of the human pathogen Cryptococcus neoformans.MolecularMicrobiology(2005),57(5):1381–1396)，用于转化所述敲除载体的微生物宿主细胞为农杆菌AGL-1和黑曲霉γ-144或黑曲霉Co860或黑曲霉ATCC1015；

进一步地，所述基因工程菌的构建步骤概述如下：

(1)通过PCR技术扩增产柠檬酸黑曲霉基因组的葡萄糖基转移酶基因(candidateglucosyltransferase)的上游同源臂LB和下游同源臂RB。LB序列的5’端加上HindⅢ酶切位点，3’端加上SpeⅠ酶切位点；RB序列的5’端加上XhoⅠ酶切位点，3’端加上KpnⅠ酶切位点；

(2)分别将LB和RB连接至载体pPZP-HYG2中潮霉素抗性基因(简写为HYG或HygR)的两端，构建敲除载体pPZP-174680；

(3)将敲除载体电转入农杆菌AGL-1；

(4)农杆菌介导敲除载体pPZP-174680转入黑曲霉菌株，筛选得到敲除菌株。

有益效果：

1、本发明所提供的敲除葡萄糖基转移酶基因的基因工程菌，与出发菌株相比，96h发酵结束时还原糖含量降低8.96-9.89％，总糖含量降低9.78-10.26％，异麦芽糖含量降低6.12-7.01％，柠檬酸产量提高10.28-12.16％。

2、本发明为柠檬酸的工业化生产提供了新思路，以KO-174680为例，葡萄糖基转移酶基因的敲除可以降低残糖和异麦芽糖分别约为10.1％和6.87％，柠檬酸产率提高约11.53％，按2016年我国柠檬酸产量计算，一年可以减少残糖至少约1.5万吨，具有显著的经济效益。

附图说明：

图1为本发明构建的敲除载体质粒图谱；

图2为本发明实施例5黑曲霉Co860与突变菌株KO-174680不同时间还原糖含量测定图；

图3为本发明实施例5黑曲霉Co860与突变菌株KO-174680不同时间总糖含量测定图；

图4为本发明实施例5黑曲霉Co860与突变菌株KO-174680不同时间异麦芽糖含量测定图；

图5为本发明实施例5黑曲霉Co860与突变菌株KO-174680不同时间柠檬酸含量测定图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

以下实施例分别以黑曲霉γ-144、黑曲霉Co860及黑曲霉ATCC1015为出发菌株进行基因敲出和发酵验证；

实验操作未详述的，均根据实验室手册——如《分子克隆》进行操作。

黑曲霉γ-144、黑曲霉Co860是本领域生产柠檬酸的常用菌株，在本申请提交前已被多次公开，如：周永生，满云《我国柠檬酸行业的产业化现状及可持续发展》.生物加工过程(1672-3678.2010.06.014)；

农杆菌AGL-1为本领域常用基因敲除介导细胞，保存于申请人实验室，也可购自北京华越洋生物；

pPZP-HYG2质粒的构建方法参考Walton FJ,et al，Novel gene functionsrequired for melanization of the human pathogen Cryptococcusneoformans.Molecular Microbiology(2005),57(5):1381–1396。

实施例1：黑曲霉Co860中的葡萄糖基转移酶基因的克隆

(1)黑曲霉Co860的总RNA的提取

a.将培养好的菌体用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗2～3遍，收集菌体；

b.收集好的新鲜菌体迅速放入已盛有适量液氮的研钵中，按顺时针方向不断研磨至菌体成均匀粉末；

c.将上述菌粉快速加入到含有适量Trizol的50mL离心管中，漩涡震荡20min；

d.分装匀浆于1.5mL EP管中，每管1mL，静置10min；

e.每管加入200μL氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡30s，静置10min；

f.4℃，12000r/min离心10min，将上清移至新的EP管中；

g.加入等体积的氯仿:苯酚(1：1)抽提3～4次至中间层无过多蛋白质；

h.吸取上清至另一EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，-70℃放置20min。

i.4℃，12000r/min离心10min，去上清；

j.沉淀用现配预冷的75％乙醇洗涤2遍，4℃，12000r/min离心5min，去上清，开盖挥发；

k.每管中加入适量DEPC处理水溶解，取3μL用于定量与电泳，余下的RNA立即置于-70℃保存。

(2)cDNA的合成：

a.在处理过的微量离心管中加入下列物质：

总RNA	2μg
		Oligo(dT)	2μL
DEPC处理水	补至6μL

混匀，70℃放置10min；

b.低速离心几秒后冰上放置2min；

c.在管中加入RNA酶抑制剂0.25μL，dNTP 0.5μL，M-MLV 0.5μL，5×buffer 2μL，ddH₂O 0.75μL，轻轻混合，42℃温浴1h；

d.72℃处理15min，冰上放置5min，-20℃保存。

(3)葡萄糖转移酶基因的PCR扩增

根据NCBI上报道的葡萄糖转移酶基因序列设计引物GT174680F和GT174680R，以提取的总RNA合成的cDNA为模板进行PCR扩增：

引物序列：

GT174680F：5’-ATGGCGCCTCCTCCGTCCTC-3’

GT174680R：5’-TCACTGGTTCTTCTTCTCCGTCTCCT-3’

PCR反应体系：PCR反应体系和反应条件如下

PCR反应体系：

cDNA	3μL
		dNTP	4μL
10×Buffer	5μL
		GT174680F	2μL
GT174680R	2μL
		Pfu DNA聚合酶	2μL
水	32μL
		总体积	50μL

反应条件：95℃变性3min；然后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，进行30个循环；再72℃延伸5min；最后4℃保存并回收。

(4)葡萄糖基转移酶基因的测序

PCR反应结束后，取3μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果并将余下的PCR产物回收。回收产物连接到pUCm-T载体，转化入DH5α，转化子经筛选鉴定后提交上海生工进行测序。测序结果如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：黑曲霉Co860基因组DNA的提取：

(1)将黑曲霉孢子接种麦芽汁培养基中，35℃，220r/min培养48h；

(2)用六层纱布过滤收集菌体，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分；

(3)迅速液氮冷冻，液氮研磨至粉末状；

(4)将菌体粉末分装于1.5mL EP管中，加入900μL裂解液(5g/L SDS，14g/LNaCl，7.5g/L EDTA，5％β-巯基乙醇，25％的50mM Tris-HCl(pH7.5))混匀，12000r/min离心15min；

(5)将上清转移至另一新的EP管中，加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)，56℃水浴2-6h；

(6)向EP管中加入30μL RNase(20mg/mL)，37℃放置1-2h；

(7)加入等体积的酚仿，充分震荡混匀，12000r/min离心5min；

(8)重复步骤(7)1-2次；

(9)取上清于一新的EP管中，加入等体积的氯仿，充分震荡混匀，12000r/min离心5min；

(10)加入2V体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，置于-70℃，20min；

(11)12000r/min离心10min，弃上清，用600μL 75％的乙醇洗涤2次；

(12)12000r/min离心5min，弃上清，晾干后加入适量的去离子水，得黑曲霉Co860基因组DNA。

实施例3：黑曲霉Co860敲除载体的构建

(1)利用引物174680LF和174680LR以黑曲霉Co860基因组DNA为模板PCR扩增葡萄糖基转移酶基因(candidate glucosyltransferase)的LB(序列如SEQ IDNO.3所示)，序列上、下游含HindⅢ和SpeⅠ酶切位点，连接到pMD19上测序正确，用这两个限制性内切酶酶切，将该序列连接到同样酶切的pPZP-HYG2上，得到pPZP-174680-LB；

(2)利用引物174680RF和174680RR以黑曲霉Co860基因组为模板PCR扩增候选葡萄糖基转移酶基因(candidate glucosyltransferase)的RB(序列如SEQ IDNO.4所示)，序列上下游含XhoⅠ和KpnⅠ酶切位点，连接到pMD19上测序正确，用这两个限制性内切酶酶切，将该序列连接到同样酶切的pPZP-174680-LB上，得到敲除载体pPZP-174680。

引物如下：

174680LF：

CCCAAGCTTCCGTGGAGGGGCAAAAAGTGAAG(SEQ ID NO.5)；

174680LR：

GACTAGTGATCTTATCGGCGATAGACTGCGAG(SEQ ID NO.6)；

174680RF：

CCGCTCGAGGATTCACAAGCAATGGACCAAATCACG(SEQ ID NO.7)；

174680RR：

GGGGTACCAGAGCCCTTCTTGGTAACGGACTTG(SEQ ID NO.8)。

(3)PCR反应体系和反应条件如下

PCR反应体系：

基因组模板	1μL
		dNTP	4μL
10×Buffer	5μL
		174680LF或174680RF	2μL
174680LR或174680RR	2μL
		Taq DNA聚合酶	2μL
水	36μL
		总体积	50μL

反应条件：95℃变性10min；然后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸65sec，进行30个循环；再72℃延伸5min；最后4℃保存并回收。

实施例4：农杆菌AGL-1介导的敲除载体pPZP-174680转化黑曲霉

4.1农杆菌AGL-1感受态细胞的制备

(1)挑取农杆菌AGL-1单菌落接种于5mL LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl)液体培养基，28℃，220r/min摇床培养20-24h得种子液；

(2)按2％的接种量将种子液转接至50mL LB液体培养基，同样条件培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0；

(3)冰浴30min，4℃，5000r/min离心收集菌体；

(4)用10mL灭菌的蒸馏水重悬菌体，同样条件离心，去上清；

(5)重复步骤(4)；

(6)用10mL10％的灭菌甘油重悬，4℃，5000r/min离心10min，去上清；

(7)重复步骤(6)；

(8)用1mL预冷的无菌10％甘油重悬菌体，按50μL等份分装，-80℃保存。

4.2敲除载体pPZP-174680转化农杆菌AGL-1

(1)从-80℃冰箱取出新鲜制备的农杆菌AGL-1感受态细胞，冰上放置数分钟使其慢慢解冻；

(2)向感受态细胞中加入5μg敲除载体pPZP-174680，轻轻混匀，冰上放置20min；

(3)转入电转杯(0.1cm、25μF、200Ω、1800V)电击；

(4)立即加入1mL液体LB培养基，28℃，180r/min复苏3h；

(5)涂布于含kana抗生素的LB板上，28℃倒置培养至转化子长出。

4.3黑曲霉Co860的培养及孢子悬液的制备

(1)将黑曲霉Co860孢子接种于PDA斜面培养基，35℃培养箱培养2-4d；

(2)用无菌水洗下分生孢子，血球计数板计数，再用无菌水调节孢子悬液至一定浓度备用。

4.4农杆菌介导的黑曲霉转化

(1)将鉴定正确的农杆菌转化子接种到含卡那霉素(kana)的LB液体培养基，28℃，180r/min培养20-24h；

(2)5000r/min离心10min，弃上清，用含100μg/mL卡那霉素和0.2μmol/mL乙酰丁香酮(AS)的IM液体培养基重悬，4000r/min离心5min，弃上清，再用5mL的IM液体培养基重悬菌体，移至无菌试管中，28℃，100r/min，培养5h至OD₆₀₀达0.8；

(3)用无菌的镊子将0.45μm的微孔滤膜放置于含有200mmol/LAS和100μg/mLkana的IM平板上，尽量避免产生气泡；

(4)取100μl步骤(2)所得的OD₆₀₀约为0.8的农杆菌与步骤3.3(2)所得的100μL浓度为1.0×10⁷个/mL的黑曲霉孢子，混匀后涂布于贴有微孔滤膜的IM平板上，25℃培养2-5d；

(5)将附着共培养菌体的微孔滤膜用无菌镊子转移至含有20μg/mL头孢噻肟钠和200μg/mL潮霉素抗性的CM平板上，35℃培养2d后将微孔滤膜揭下，继续培养至转化子长出，挑单菌落传代，每个菌落进行3次单孢子传代，获得成功敲除SEQ ID NO.1所示葡萄糖基转移酶基因的黑曲霉，菌株命名为KO-174680。

本实施例中所用的培养基组成如下：

IM液体培养基：900mL去离子水，121℃灭菌20min，加入预先灭菌或过滤除菌的Kbuffer 0.8mL，MN buffer 20mL，1％CaCl₂ 1mL，0.01％FeSO₄·7H₂O 10mL，IM Traceelements 5mL，20％NH₄NO₃ 2.5mL，1mol/L MES 40mL，50％甘油10mL，20％葡萄糖10mL，摇匀备用。

K buffer：用1.25mol/LK₂HPO₄调节1.25mol/L KH₂PO₄的pH至4.8，121℃灭菌20min备用。

MN buffer：3.0g MgSO₄·7H₂O，1.5g NaCl，溶于去离子水并定容至100mL，121℃灭菌20min备用。

IM Trace Elements：0.1g ZnSO₄·7H₂O，0.1g CuSO₄·5H₂O，0.1g H₃BO₃，0.1gMnSO₄，0.1g Na₂MoO₄·2H₂O，溶于去离子水并定容至100mL，121℃灭菌20min备用。

1mol/LMES：19.524g MES溶于去离子水并定容至100mL，用2mol/L的NaOH调节pH至5.5，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

IM固体培养基：905mL去离子水，加入20g琼脂，121℃灭菌20min。加入预先灭菌或过滤除菌的K buffer 0.8mL，MN buffer 20mL，1％CaCl₂ 1mL，0.01％FeSO₄·7H₂O 10mL，IMTrace elements 5mL，20％NH₄NO₃ 2.5mL，1mol/L MES 40mL，50％甘油10mL，20％葡萄糖5mL。

CM培养基：琼脂20g，加入90mL去离子水，121℃灭菌20min，加入预先灭菌或过滤除菌的ASP+N 20mL,1mol/L MgSO₄ 2mL,CM Trace elements 1mL,10％酪蛋白水解物10mL,10％酵母浸出物50mL,50％葡萄糖20mL。

ASP+N：2.61g KCl,7.48g KH₂PO₄,29.75g NaNO₃,用去离子水溶解并定容至100mL,用5mol/L KOH调节pH至5.5,121℃灭菌20min备用。

CM Trace elements：2.1g ZnSO₄·7H₂O,1.1g H₃BO₃,0.5g MnCl₂·4H₂O,0.5gFeSO₄·7H₂O,0.17g CuSO₄·5H₂O,0.15g NaMoO₄·2H₂O,5.1g EDTA,去离子水溶解并定容至100mL，121℃灭菌20min备用。

实施例5：黑曲霉KO-174680发酵生产柠檬酸性能鉴定

将出发菌株黑曲霉Co860和敲除菌株KO-174680分别接种于PDA斜面，35℃生孢培养5d，刮取孢子，以10⁵个/mL接种量接种于发酵培养基(20％玉米淀粉，其总糖量为7.5％)，35℃，220r/min培养96h，12h开始取样，每12h取样一次。

5.1还原糖含量测定

离心后的发酵液稀释10倍，取2mL，加入DNS试剂1.5mL沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25mL摇匀，在520nm波长测吸光度。测定结果如图2所示。结果显示，96h发酵结束，敲除菌株相比出发菌株还原糖含量降低9.44％。

5.2总糖含量测定

5.2.1发酵液中总糖的水解

取发酵液0.5mL，加6mol/L的盐酸溶液2mL，在沸水浴中加热15min水解，冷水冷却后加6mol/L氢氧化钠溶液1.8mL，并定容至50mL，得总糖水解液。

5.2.2发酵液中总糖的测定

取总糖水解液2mL，加入DNS试剂1.5mL沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25mL摇匀，在520nm波长测吸光度。测定结果如图3所示。结果显示，96h发酵结束，敲除菌株相比原始菌株总糖含量降低10.1％。

5.3异麦芽糖含量测定

异麦芽糖含量检测采用Aligent1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差检测器和工作站)；色谱条件：采用Prevail Carbohydrate ES(4.6×250mm,5um)色谱柱，以67％乙腈做流动相，流速为1.0mL/min。测定结果如图4所示。结果显示，96h发酵结束，敲除菌株相比出发菌株异麦芽糖含量降低6.87％。

5.4柠檬酸含量测定

柠檬酸含量检测采用Aligent1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)；色谱条件：采用AtlantisC18(4.6×150mm,5um)色谱柱，以0.05mol /LNa₂HPO₄(pH 2.80)溶液做流动相，流速为0.8mL/min，波长210nm。测定结果如图5所示。结果显示，96h发酵结束，敲除菌株相比出发菌株柠檬酸含量提高11.53％。

实施例6：黑曲霉发酵生产柠檬酸性能鉴定

采用实施例1-5相同的方法，构建以黑曲霉γ-144为出发菌株敲除SEQ ID NO.1所示葡萄糖基转移酶基因的敲除菌株(命名为144KO-174680)，并以黑曲霉γ-144为对照，验证菌株144KO-174680的发酵性能；

采用实施例1-5相同的方法，构建以黑曲霉ATCC1015为出发菌株敲除SEQ ID NO.1所示葡萄糖基转移酶基因的敲除菌株(命名为1015KO-174680)，并以黑曲霉ATCC1015为对照，验证菌株1015KO-174680的发酵性能；

具体如下表：

菌株	还原糖含量	总糖	异麦芽糖含量	柠檬酸含量
					144KO-174680	降低9.89％	降低10.26％	降低7.01％	提高12.16％
1015KO-174680	降低8.96％	降低9.78％	降低6.12％	提高10.28％

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用

<130> 1

<141> 2017-12-26

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1779

<212> DNA

<213> 黑曲霉Co860()

<400> 1

atggcgcctc ctccgtcctc ttaccgtccg cggaagaaga gaaagcttcc ctcgtctttc 60

gccggctcta acaattccct cattgttgac gttggaggga aggcctcccc agctttccca 120

ttggtgtctt ttctctggtc tgctcgcgct ggtgtctcac aatggctcgt actacccttg 180

atattgatgg cagtgggttt gtttcgctgg gctgtcagtt tgtggggata ttctggcttc 240

ggagtacccc ctatgcatgg tgactttgaa gcacagaggc attggatgga gatcacgact 300

catctaccca tttcaaaatg gtacttgtac gatctgcaat actgggggtt ggactacccg 360

ccgttgactg cataccacag ctggttgctt ggaaaacttg gttctctctt tgaccccgca 420

tggtttgccc tggaccaatc ccgtggcata gaagatccct tgttgaaggt gttcatgcgc 480

ggaactgtga ttgcttcgga ataccttgtc tacatcccgg ccgtcgttac cttcctgcgc 540

cgcttcaccc gcatgcagag cgttccggtt tggtctgctt caattgccct cactgcgatc 600

ctcctacagc cggcgactat tctcattgac cacggtcatt tccaatataa cacggtgatg 660

ctgggactgg ttgttgcgag cttggatgcc attctggctg gacgcatgct atgggcctgc 720

atcttcttcg tgggtgctct gggtttcaag cagatggccc tgtactatgc tccggttatg 780

ttcgccttcc ttcttggtgt ctgcatcttt cccaagatcc ggttcctccg tctcatctcc 840

atttctcttg tcacccttgt tgcatttgct gtcctgcttg ctccaatgct cattggagcg 900

attggtatcg aggcgcaagc aactctggca tttgcccctg cacctccgct tttgcagatt 960

ctcccgatcg agctggacaa gagctcaatg ctttatgcag tcatcttcca gctgactcaa 1020

attatccacc gcgtcttccc ctttgctcgt ggtctgttcg aggacaaggt cgcgaatgcg 1080

tggtgtgcca tccatacgtt ctacaaactc caccgattcg aggccactct gctccagcgc 1140

atgtcccttg gagcgacgct ggcatccatt gccgtcccgt gcgccatcat cttccgtcac 1200

ccgcgcgcct cgctactcct cccagccttg tcaagtgtag cgtggggctt cttcttgttc 1260

tcgttccagg tgcatgagaa gagcgttctc cttcccttgc tccccatgac tcttctcctg 1320

gctggagatg gcggcctaag taaagagacc cgggcttggg tgggctgggc caatatgctt 1380

ggctcgtgga ccatgtatcc tctcctgcag cgtgacgaac ttcgaatccc ctacttcgtc 1440

ttgactctgc tttgggccta cctattgggg ctccctccaa cgtcgctggg aacattccgc 1500

cgccgcgcct ccttggagga caccacctcc ggtgccgagc ttcatgtgct gaccaagctt 1560

ttgcatgcct gcttttacct tgctatgatc gcatggcatg tcctggaagc cttcgtggcg 1620

ccccctcctg gcaagccgga tctgtgggtg gtgctgaatg ccctcatcgg tgctggagga 1680

tttggaattg cgtatctgtg gtgtttctgg aagctgatcc agcagtgccg caaaatcgac 1740

caaaaggcag ccgaggagac ggagaagaag aaccagtga 1779

<210> 2

<211> 592

<212> PRT

<213> 黑曲霉Co860()

<400> 2

Met Ala Pro Pro Pro Ser Ser Tyr Arg Pro Arg Lys Lys Arg Lys Leu

1 5 10 15

Pro Ser Ser Phe Ala Gly Ser Asn Asn Ser Leu Ile Val Asp Val Gly

20 25 30

Gly Lys Ala Ser Pro Ala Phe Pro Leu Val Ser Phe Leu Trp Ser Ala

35 40 45

Arg Ala Gly Val Ser Gln Trp Leu Val Leu Pro Leu Ile Leu Met Ala

50 55 60

Val Gly Leu Phe Arg Trp Ala Val Ser Leu Trp Gly Tyr Ser Gly Phe

65 70 75 80

Gly Val Pro Pro Met His Gly Asp Phe Glu Ala Gln Arg His Trp Met

85 90 95

Glu Ile Thr Thr His Leu Pro Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Tyr Asp Leu

100 105 110

Gln Tyr Trp Gly Leu Asp Tyr Pro Pro Leu Thr Ala Tyr His Ser Trp

115 120 125

Leu Leu Gly Lys Leu Gly Ser Leu Phe Asp Pro Ala Trp Phe Ala Leu

130 135 140

Asp Gln Ser Arg Gly Ile Glu Asp Pro Leu Leu Lys Val Phe Met Arg

145 150 155 160

Gly Thr Val Ile Ala Ser Glu Tyr Leu Val Tyr Ile Pro Ala Val Val

165 170 175

Thr Phe Leu Arg Arg Phe Thr Arg Met Gln Ser Val Pro Val Trp Ser

180 185 190

Ala Ser Ile Ala Leu Thr Ala Ile Leu Leu Gln Pro Ala Thr Ile Leu

195 200 205

Ile Asp His Gly His Phe Gln Tyr Asn Thr Val Met Leu Gly Leu Val

210 215 220

Val Ala Ser Leu Asp Ala Ile Leu Ala Gly Arg Met Leu Trp Ala Cys

225 230 235 240

Ile Phe Phe Val Gly Ala Leu Gly Phe Lys Gln Met Ala Leu Tyr Tyr

245 250 255

Ala Pro Val Met Phe Ala Phe Leu Leu Gly Val Cys Ile Phe Pro Lys

260 265 270

Ile Arg Phe Leu Arg Leu Ile Ser Ile Ser Leu Val Thr Leu Val Ala

275 280 285

Phe Ala Val Leu Leu Ala Pro Met Leu Ile Gly Ala Ile Gly Ile Glu

290 295 300

Ala Gln Ala Thr Leu Ala Phe Ala Pro Ala Pro Pro Leu Leu Gln Ile

305 310 315 320

Leu Pro Ile Glu Leu Asp Lys Ser Ser Met Leu Tyr Ala Val Ile Phe

325 330 335

Gln Leu Thr Gln Ile Ile His Arg Val Phe Pro Phe Ala Arg Gly Leu

340 345 350

Phe Glu Asp Lys Val Ala Asn Ala Trp Cys Ala Ile His Thr Phe Tyr

355 360 365

Lys Leu His Arg Phe Glu Ala Thr Leu Leu Gln Arg Met Ser Leu Gly

370 375 380

Ala Thr Leu Ala Ser Ile Ala Val Pro Cys Ala Ile Ile Phe Arg His

385 390 395 400

Pro Arg Ala Ser Leu Leu Leu Pro Ala Leu Ser Ser Val Ala Trp Gly

405 410 415

Phe Phe Leu Phe Ser Phe Gln Val His Glu Lys Ser Val Leu Leu Pro

420 425 430

Leu Leu Pro Met Thr Leu Leu Leu Ala Gly Asp Gly Gly Leu Ser Lys

435 440 445

Glu Thr Arg Ala Trp Val Gly Trp Ala Asn Met Leu Gly Ser Trp Thr

450 455 460

Met Tyr Pro Leu Leu Gln Arg Asp Glu Leu Arg Ile Pro Tyr Phe Val

465 470 475 480

Leu Thr Leu Leu Trp Ala Tyr Leu Leu Gly Leu Pro Pro Thr Ser Leu

485 490 495

Gly Thr Phe Arg Arg Arg Ala Ser Leu Glu Asp Thr Thr Ser Gly Ala

500 505 510

Glu Leu His Val Leu Thr Lys Leu Leu His Ala Cys Phe Tyr Leu Ala

515 520 525

Met Ile Ala Trp His Val Leu Glu Ala Phe Val Ala Pro Pro Pro Gly

530 535 540

Lys Pro Asp Leu Trp Val Val Leu Asn Ala Leu Ile Gly Ala Gly Gly

545 550 555 560

Phe Gly Ile Ala Tyr Leu Trp Cys Phe Trp Lys Leu Ile Gln Gln Cys

565 570 575

Arg Lys Ile Asp Gln Lys Ala Ala Glu Glu Thr Glu Lys Lys Asn Gln

580 585 590

<210> 3

<211> 960

<212> DNA

<213> 黑曲霉Co860()

<400> 3

ccgtggaggg gcaaaaagtg aagaagaaga aagacttgaa gcagcgggcc gtgatgcagc 60

attcccctga caacccaatt atttccgttt gttcccataa attttccccg accgccgctc 120

cggccgcccg caggcaccat ttccgccgtt tccgggcaat cgcatcatta ttcagcatct 180

tttcgtcttg ctcagcctcc gactgctgtt cgttttcgtc gtcaatcctg tcgctctctg 240

cccattgtca ttcactgagc ctattgcttc atttcaattc cattcctcat catgtcgtgg 300

ctgtccggtt cctctaacag tacgtattcc catacatgct cgccgcagga tccatacctc 360

ttgcctcgct agtatatcgg agtgactcaa ggctgacaat cttttttgat aatagctgag 420

aaggctgctg cccctgctcc tgccgagtcg gcacctgcgg aaaagcccaa ggtatgccca 480

ttgcccacac gacaccgaga tagcccagaa tgtccgactg accgagtcac agccatgctg 540

cgtttgcaag accgaaaaga ccgcccgcga tgactgcatg ctcttctcca agaccgacga 600

tcccacacag gagtgcaagc ctctgattga gcagtacaag gcctgcatgg ctggctatgg 660

cttcaaggtc taagttgcac tatacccgac tgctgccggg acagctgcac aatgaggatg 720

atacatagag ttcagcgcat gcaaatattg gtgttcggtt atgggtttat tctgggttac 780

atgtattgta taggtcattt tcgacgtcta taggtggagc atctcccttc ttgtgcaata 840

aatgtatatt atctatgtca tcatgttctg ggaatattgt atggatcgaa ggcttaagca 900

accgctttta tctccaccag gcgcaagaag cataactcgc agtctatcgc cgataagatc 960

<210> 4

<211> 857

<212> DNA

<213> 黑曲霉Co860()

<400> 4

gattcacaag caatggacca aatcacgaga gttccattga ctgcgcgtag atgtcaagca 60

gccgtgacag gtctaaagga atgacaggta gttggagtcg atagttagtg gactggctgg 120

aggtggttga ctgcggaggg acactctggt tccaacggtc tgccggtgga ccaatgagag 180

gcccggtcgg agtcgggcca agtcaagtta gtctcctagc cagttcccca cttagttcct 240

gagctagtgc agctgcagca ggcggtaggg gatgttgatt tttttctgcc agcctccaaa 300

ttttttttgc gtttagtcgc cttatcagag ctgctccccc agctaggaat tttcttcttc 360

cttcattcct gtcctactct tccccttcac ctttttccat cattttttat cactcttctt 420

cacttggttg tcttttcaac taagtgttct atctcttttc attgcatatc taacggtacg 480

cttcaacaga cactctgtgg gcttcttgca ttgagggctg tgggctgtag catactacat 540

ctattctgtg ggatctgtgg gatactctcg tgggtttcat atcatagacg gtagcttccc 600

tgtcgtctcg tgtgggctta gacactgtcg ttgtgggtta cctgtgggta tttgaaaatt 660

tccattacaa atcgggtgat tgtgggatta taagatctgc cgcacattcc tagcttttca 720

ctgtatactt gcttagttta cagtttcttt ggttcgtctc tttccttcct gtcactctgt 780

ttgttttccc ctatactaat tcctatccct ttcagatcaa aatgtccaag accaagtccg 840

ttaccaagaa gggctct 857

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cccaagcttc cgtggagggg caaaaagtga ag 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gactagtgat cttatcggcg atagactgcg ag 32

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ccgctcgagg attcacaagc aatggaccaa atcacg 36

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ggggtaccag agcccttctt ggtaacggac ttg 33

Claims (8)

1.一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，通过敲除生产柠檬酸的黑曲霉菌株中的葡萄糖基转移酶来获得；

所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的出发菌株为黑曲霉γ-144或黑曲霉Co860。

4.权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌出发菌株为黑曲霉ATCC1015。

5.权利要求1所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法如下：

(1)PCR扩增葡萄糖基转移酶基因上、下游同源臂；

(2)分别将上、下游同源臂连接至载体，构建敲除载体；

(3)将敲除载体电转入农杆菌AGL-1；

(4)农杆菌介导敲除载体转入黑曲霉菌株，筛选得到敲除葡萄糖基转移酶基因的菌株。

6.如权利要求5所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述载体为pPZP-HYG2。

7.如权利要求5所述的一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的基因工程菌，其特征在于，所述黑曲霉为黑曲霉γ-144或黑曲霉Co860。

8.权利要求1-7任一所述基因工程菌在发酵生产柠檬酸中的应用。

Images