CN102079778B - 一种抗菌蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗菌蛋白和编码该抗菌蛋白的基因，同时提供了这种抗菌蛋白的制备方法和应用。本发明抗菌蛋白对革兰氏阳性菌有抑菌活性，对人红细胞无溶血活性，安全性好。本发明通过选择适合酵母表达的优化密码子，构建的抗菌蛋白基因能够在毕赤酵母中高效表达，可以实现工业化，降低生产成本。带有组氨酸标签抗菌蛋白能够通过镍柱快速纯化蛋白，简化制备方案。本发明抗菌蛋白可用于制备抗菌药物和消毒杀菌剂。将本发明抗菌蛋白用于抗菌和消毒杀菌，可以克服由于滥用抗生素带来的不良后果，达到预防和治疗感染类疾病和消毒杀菌效果，并能降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物化学和分子生物学领域，涉及抗菌蛋白，具体涉及抗菌蛋白的氨基酸序列及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素人类抵御细菌感染类疾病的主要武器，在医学发展史上发挥着重要的作用。但随着抗生素长期使用及滥用，导致许多细菌耐药性增加，如临床上耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、铜绿假单孢菌等。最近出现的“超级细菌”能够耐受几乎所有的抗生素，已有多起致死病例，引起了世界性恐慌。寻找无细菌耐药性、能够替代抗生素的药物迫在眉睫。
抗菌蛋白是生物体经免疫诱导产生的小蛋白，有抑杀细菌、真菌、原虫和肿瘤细胞等多种功能。由于抗菌蛋白主要通过破坏细胞膜机制杀死细胞，不易诱导产生耐药菌株，容易被降解，不在微生物体内富集，因此被认为是能够替代抗生素的首选药物。已有报道来自青蛙皮的抗菌蛋白能够对抗“超级细菌”，但对人体细胞也有潜在毒性。寻找高效、无药物抗性、对人体细胞无毒害的新型抗菌蛋白是目前研究的热点。
天然抗菌蛋白的含量很低，提取步骤复杂；化学合成法制备蛋白的成本很高，远不能满足应用需要；抗菌蛋白对细菌有杀伤作用，不宜在原核系统中直接表达。毕赤酵母真核表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，具有许多优点：(1)利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOXI)启动子，可严格控制外源基因的表达，在胞外和胞内都可表达外源基因；(2)毕赤酵母生长速度快，培养条件简单，适合高密度发酵，有利于提高目的蛋白产量；(3)毕赤酵母作为真核细胞生物，可进行翻译后的蛋白加工，使其表达的蛋白得到正确的折叠和修饰，避免活性损失。国内外已有抗菌蛋白在毕赤酵母中成功分泌表达的报道。只要设计出适合酵母表达的抗菌蛋白基因序列，就能通过毕赤酵母大规模生产目的蛋白，降低生产成本，为抗菌药物的生产提供大量原料。
发明内容
本发明的任务是提供一种抗菌蛋白，同时提供这种抗菌蛋白的制备方法和应用。
实现本发明的具体方案是：
本发明提供的这种抗菌蛋白具有序列表中序列1或序列15所示的氨基酸序列。
本发明还提供了编码本发明抗菌蛋白的基因，该基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列或依照遗传密码简并性而衍生于序列2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了制备本发明抗菌蛋白的重组表达载体，该重组表达载体含有编码本发明抗菌蛋白的基因。进一步说，该重组表达载体是在表达载体的多克隆位点中插入了编码本发明抗菌蛋白的基因，在所插入的编码本发明抗菌蛋白的基因的5’端加入了酶切位点和甲硫氨酸密码子，在所插入的编码本发明抗菌蛋白的基因的3’端加入了终止密码子和酶切位点。制备该重组表达载体的表达载体可以是pPIC9K质粒。
表达本发明抗菌蛋白的pPIC9K重组质粒的构建方法，包括以下步骤：
(1)DNA聚合酶进行延伸反应：反应条件为：序列表中序列3所示的引物P1和序列表中序列4所示的引物R1(10μmol/L)各5μL，2×pfu PCR MasterMix 10μL，94℃变性3min，72℃延伸10min，得到DNA产物；
(2)PCR(聚合酶链反应)扩增DNA片段：PCR反应条件为：上述步骤(1)中的DNA产物1μL，序列表中序列5所示的引物P2(10μmol/L)和序列表中序列6所示的引物R2(10μmol/L)各1μL，2×pfu PCR MasterMix 10μL，超纯水7μL，94℃变性3min后，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min，得到扩增的DNA产物；
(3)用上述步骤(2)的DNA产物1μL，序列表中序列7所示的引物P3(10μmol/L)和序列表中序列8所示的引物R3(10μmol/L)各1μL，PCR条件与上述步骤(2)相同，得到进一步扩增的DNA产物；
(4)用上述步骤(3)中的DNA产物1μL，序列表中序列9所示的引物P4(10μmol/L)和序列表中序列10所示的引物R4(10μmol/L)各1μL，PCR条件与上述步骤(2)相同，合成得到具有序列表中序列11所示序列的含有本发明抗菌蛋白基因的DNA产物；
(5)上述步骤(4)中的DNA产物用EcoRI酶切，pPIC9K质粒用EcoRI酶切并用CIAP碱性磷酸酶去磷酸化，电泳并回收酶切后的DNA产物和pPIC9K，经T4DNA连接酶16℃连接4h，得到的混合溶液体系中，含有正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒和反向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒；
(6)将上述步骤(5)中含有混合重组质粒的溶液体系转化感受态大肠杆菌TOP10菌株，在含氨苄青霉素抗性的LB培养基上挑选单菌落，扩大培养后提取质粒；
(7)用序列表中序列12所示的引物α-Factor和序列表中序列10所示的引物R4，利用PCR方法筛选正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒，PCR反应条件是：以1μL上述步骤(6)中的质粒作为模板，α-Factor和R4(10μmol/L)引物各1μL，2×PCRMasterMix10μL，超纯水7μL，94℃变性3min，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min；经电泳检测，将能扩增出约370bp片段的质粒进一步进行EcoRI酶切鉴定；酶切后的质粒经电泳检测，将得到约290bp酶切片段的质粒进行DNA序列测定，在EcoRI酶切位点上正向插入了序列表中序列2的质粒，即为表达本发明抗菌蛋白的pPIC9K重组质粒。
制备本发明抗菌蛋白的方法：
用SalI酶切按上述方法构建的pPIC9K重组质粒，电泳回收线性化的pPIC9K重组质粒，用电转化法将回收的线性化的pPIC9K重组质粒转入毕赤酵母中，将转入了pPIC9K重组质粒的毕赤酵母菌株接种到适合的培养基，在适合的条件下培养诱导抗菌蛋白基因表达，离心收集培养基上清液，经纯化得到本发明抗菌蛋白。所述的用电转化法将回收的线性化的pPIC9K重组质粒转入毕赤酵母中的具体方法是：取100μL新鲜制备的毕赤酵母GS115感受态细胞，加入20μL线性化的pPIC9K重组质粒充分混合后，1.5KV，25μF，200Ω，电击5ms，迅速加入1ml预冷的山梨醇混匀，取200μL酵母悬液涂布于MM平板，30℃培养3-4天，挑选生长出的菌落到含有0.25mg/mL G418的YPD培养基中进行培养，将生长出的菌落接种到YPD液体培养基中扩大培养，离心收集菌体并重悬于蒸馏水中，超声破碎后离心收集上清液进行PCR鉴定，PCR反应条件为：上清液1μL，序列表中序列9所示的引物P4和序列表中序列10所示的引物R4(10μmol/L)各1μL，2×PCR Master Mix 10μL，超纯水7μL，94℃变性5min，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min。所述的将转入了pPIC9K重组质粒的毕赤酵母菌株接种到适合的培养基，在适合的条件下培养诱导抗菌蛋白基因表达，离心收集培养基上清液，经纯化得到本发明抗菌蛋白的具体方法是：将转入了pPIC9K重组质粒的毕赤酵母菌株接种到BMGY培养基，250rpm摇床培养24h后，更换BMMY培养基，并添加0.5％甲醇继续培养，此后每24h补加0.5％甲醇诱导抗菌蛋白基因的表达，培养72小时后，离心收集培养基上清液，80℃加热处理20min并冷却，真空浓缩到1/10体积，经70％硫酸胺沉淀过夜，抽滤收集蛋白沉淀，冷冻干燥得到重组抗菌蛋白，用0.2mol/L盐酸(含6mol/L盐酸胍)溶解该重组抗菌蛋白，再加入50mg/mL溴化氰定向切割增加的N端融合肽段，室温避光作用24h后，缓慢加入去离子水稀释20倍终止反应，用截流分子质量7000Da的透析袋透析除盐，冷冻干燥得到本发明抗菌蛋白。
本发明的抗菌蛋白对革兰氏阳性菌有抑菌活性，对人红细胞无溶血活性，安全性好。本发明通过选择适合酵母表达的优化密码子，构建的抗菌蛋白基因能够在毕赤酵母中高效表达，可以实现工业化，降低生产成本。带有组氨酸标签抗菌蛋白能够通过镍柱快速纯化蛋白，简化制备方案。本发明抗菌蛋白可用于制备抗菌药物和消毒杀菌剂。将本发明抗菌蛋白用于抗菌和消毒杀菌，可以克服由于滥用抗生素带来的不良后果，达到预防和治疗感染类疾病和消毒杀菌效果，并能降低生产成本。
附图说明
图1：含有抗菌蛋白基因的DNA片段合成示意图，图中P1，P2，P3，P4：上游引物；R1，R2，R3，R4：下游引物；PCR：聚合酶链反应。
图2：含有抗菌蛋白基因片段的pPIC9K重组质粒构建示意图，图中：pPIC9K：穿梭质粒；pPIC9K重组质粒：含有抗菌蛋白基因片段的酵母表达重组质粒；AOX：甲醇氧化酶基因；T4DNAligase：T4DNA连接酶；Ampr：氨苄青霉素抗性基因；G418r：G418抗性基因。
图3：蛋白质电泳检测在不同培养时间重组抗菌蛋白在培养基上清液和酵母菌体中的表达量，图中：(A)酵母上清液；(B)酵母细胞沉淀。结果表明，毕赤酵母菌经甲醇诱导12小时后，酵母菌即开始分泌分子量约10kDa的重组抗菌蛋白到培养基上清液中，酵母菌体内也存在大量抗菌蛋白。
图4：蛋白质电泳检测在不同培养时间带组氨酸标签的重组抗菌蛋白在培养基上清液和酵母菌体中的表达量，图中：(A)酵母上清液；(B)酵母细胞沉淀。结果表明，毕赤酵母菌经甲醇诱导12小时后，酵母菌即开始分泌分子量约10kDa的带组氨酸标签的重组抗菌蛋白到培养基上清液中，酵母菌体内也存在大量带组氨酸标签的抗菌蛋白。
图5：毕赤酵母菌分泌到培养基上清液中带组氨酸标签的重组抗菌蛋白对枯草杆菌的抗菌活性检测。图中显示：30℃培养48h后，加入100ul无菌水的(A)孔周围的抑菌圈直径为零；加入100μL培养基上清液的(B)孔的抑菌圈直径约18mm，清晰；加入100μL氨苄青霉素(0.5μg/μL)的(C)孔的抑菌圈直径约18mm，但比较模糊。结果说明100μL酵母培养基上清液中带有组氨酸标签的抗菌蛋白的抑菌活性相当于50μg氨苄青霉素的抑菌活性，但枯草杆菌不会对带有组氨酸标签重组抗菌蛋白产生抗性，该蛋白的抗菌活性强于氨苄青霉素。
具体实施方式
实施例1：合成含有抗菌蛋白基因的DNA产物
根据抗菌蛋白的氨基酸序列设计基因序列(如序列表中序列2所示)，用DNA合成仪合成四对引物：序列表中序列3所示的引物P1和序列表中序列4所示的引物R1、序列表中序列5所示的引物P2和序列表中序列6所示的引物R2、序列表中序列7所示的引物P3和序列表中序列8所示的引物R3、序列表中序列9所示的引物P4和序列表中序列10所示的引物R4。引物P4引入EcoRI酶切位点(GAATTC)和蛋氨酸密码子(ATG)，引物R4引入终止密码子和EcoRI酶切位点。引入蛋氨酸是为了用溴化氰定向切割以除去融合蛋白中增加的N端融合肽段。利用四对引物合成含有本发明抗菌肽基因的DNA产物(见图1)，具体过程为：
(1)引物P1和引物R1用DNA聚合酶进行延伸反应。延伸反应条件为：P1和R1(10μmol/L)各5μL，2×pfu PCR MasterMix 10μL，94℃变性3min，72℃延伸10min，得到DNA产物；
(2)PCR(聚合酶链反应)扩增。反应条件为：上述步骤(1)中的DNA产物1μL，引物P2和引物R2(10μmol/L)各1μL，2×pfu PCR MasterMix 10μL，超纯水7μL，94℃变性3min后，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min，得到扩增的DNA产物；
(3)用上述步骤(2)中的DNA产物1μL，引物P3和引物R3(10μmol/L)各1μL，PCR条件与上述步骤(2)相同，得到进一步扩增的DNA产物；
(4)用上述步骤(3)中的DNA产物1μL，引物P4和引物R4(10μmol/L)各1μL，PCR条件与上述步骤(2)相同，合成得到含有本发明抗菌蛋白的基因的DNA产物(见序列表中序列11)。
实施例2：构建含有抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒。具体过程为：
(1)将实施例1步骤(4)中的DNA产物用EcoRI酶切。
(2)pPIC9K质粒用EcoRI酶切并用CIAP碱性磷酸酶去磷酸化。
(3)电泳并回收酶切后的DNA产物和pPIC9K，用T4DNA连接酶16℃连接4h，将连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株，在含氨苄青霉素抗性的LB培养基上挑选单菌落，扩大培养后提取质粒。
(4)PCR方法筛选正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒。PCR反应条件是：待检测质粒1μL，序列表中序列12所示的引物α-Factor和序列表中序列10所示的引物R4(10μmol/L)各1μL，2×PCR MasterMix 10μL，超纯水7μL，94℃变性3min，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min，将得到的DNA产物进行电泳，挑选能扩增出约370bp片段的质粒进一步进行酶切鉴定。
(5)将步骤(4)中的质粒用EcoRI酶切，电泳，将能得到约290bp酶切片段的质粒进行DNA序列测定，测序结果与序列表中序列2完全一致，得到正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒，构建过程见图2所示。
LB培养基配方：酵母提取物，5g；蛋白胨，10g；NaCl，10g；加水到1000mL，调整pH到7.0。固体培养基添加琼脂粉15g，需要时添加50mg/L氨苄青霉素。
实施例3：合成带有组氨酸标签的抗菌蛋白基因的DNA产物。具体过程为：
与实施例1步骤相同，只是在步骤(4)中用序列表中序列13所示的引物R5代替序列10所示的引物R4进行PCR扩增，得到带有组氨酸标签的抗菌蛋白基因的DNA产物(见序列表中序列14)，过程如图1所示。引物R5引入编码六个组氨酸的密码子(CATCACCATCACCATCAC)、终止密码子(TAA)和EcoRI酶切位点(GAATTC)。
实施例4：构建含有带有组氨酸标签的抗菌蛋白pPIC9K重组质粒。具体过程为：
只是在步骤(1)中将实施例3得到的带有组氨酸标签的抗菌蛋白基因的DNA产物用EcoRI酶切，其余与实施例2步骤相同。得到正向插入带有组氨酸标签的抗菌蛋白pPIC9K重组质粒，构建过程见图2所示。
实施例5：制备重组抗菌蛋白。具体过程为：
(1)将实施例2中构建的含有抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒用SalI酶切，电泳回收线性化的pPIC9K重组质粒。
(2)取100μL新鲜制备的毕赤酵母GS115感受态细胞，加入20μL线性化的pPIC9K重组质粒，充分混合后，1.5KV，25μF，200Ω，电击5ms，迅速加入1ml预冷的山梨醇混匀，取200μL涂布于MM平板，30℃培养3-4天，挑选生长出的菌落到含有0.25mg/mL G418的YPD培养基中进行培养。
(3)将生长出的菌落接种到YPD液体培养基中扩大培养，离心收集菌体并重悬于蒸馏水中，超声破碎后离心收集上清液进行PCR鉴定。PCR反应条件为：上清液1μL，P4和R4(10μmol/L)引物各1μL，2×PCR Master Mix 10μL，超纯水7μL，94℃变性5min，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min，电泳检测PCR产物，能扩增出约370bp片段的样品所对应的菌落，即是成功地将外源抗菌蛋白基因整合到酵母基因组中的酵母菌株。
(4)将步骤(3)的酵母菌株接种到BMGY培养基，250rpm摇床培养24h后，更换BMMY培养基，并添加0.5％甲醇继续培养。此后每24h补加0.5％甲醇诱导抗菌蛋白基因的表达。培养72小时后，离心收集菌体和培养基上清液，上清液80℃加热处理20min并冷却。
(5)真空浓缩培养基上清液到1/10体积，经70％硫酸胺沉淀过夜，抽滤收集蛋白沉淀，冷冻干燥得到重组抗菌蛋白。
MM固体培养基配方：无菌蒸馏水，800ml；琼脂粉，15g；高压灭菌。使用前加热并冷却到60℃，依次加入以下试剂：10×YNB，100ml；500×B，2ml；10×M，100ml。
10×YNB配方：酵母氮源碱(YNB)，34g；硫酸铵，100g；蒸馏水，1000ml；过滤除菌。
500×B配方：生物素，20mg；蒸馏水，100ml；过滤除菌。
10×M配方：甲醇，5ml；蒸馏水，95ml；过滤除菌。
YPD液体培养基配方：酵母提取物，20g；蛋白胨，10g；葡萄糖，20g；加水到1000mL，固体培养基添加琼脂粉20g。
BMMY溶液配方：酵母提取物，10g；蛋白胨Peptone，20g；蒸馏水，700ml；高压灭菌后保存。使用前加入以下试剂：1M磷酸钾缓冲液，100ml；10×YNB，100ml；500×B，2ml；10×M，100ml。
BMGY溶液配方：酵母提取物，10g；蛋白胨Peptone，20g；蒸馏水，700ml；高压灭菌后保存。使用前加入以下试剂：1M磷酸钾缓冲液，100ml；10×YNB，100ml；500×B，2ml；10×GY，100ml。
1M磷酸钾缓冲液配方：K2HPO4·3H2O，3.01g；KH2PO4，11.8g；调整pH至6.0，加水至100ml。
10×GY溶液配方：甘油，100ml；蒸馏水，900ml；高压灭菌。
实施例6：制备带有组氨酸标签的重组抗菌蛋白。具体过程为：
只是在步骤(1)中将实施例4得到的带有组氨酸标签的抗菌蛋白pPIC9K重组质粒用SalI酶切，电泳回收线性化的带有组氨酸标签的抗菌蛋白pPIC9K重组质粒，其余与实施例5步骤(2)(3)(4)(5)相同，得到带有组氨酸标签的重组抗菌蛋白，如序列表中序列15所示。
实施例7：蛋白质电泳检测在不同培养时间重组抗菌蛋白在培养基上清液和酵母菌体中的表达量。具体过程为：
(1)将实施例5步骤(3)得到的酵母菌株接种到100mL BMGY培养基中，250rpm摇床培养24h。
(2)离心收集菌体，并重悬到250mL含0.5％甲醇的BMMY培养基中继续摇床培养。取出1mL培养液，离心收集上清液和酵母菌体，经处理后进行蛋白质电泳。
(3)此后每24h补加0.5％甲醇，每隔12h取出1mL培养液，离心收集上清液和酵母菌体，加入电泳上样缓冲液处理后进行蛋白质电泳。
电泳结果见图3。结果表明样品中存在大量分子量约10kDa的重组抗菌蛋白，经甲醇诱导12小时后，酵母菌即开始分泌重组抗菌蛋白到培养基上清液中，酵母菌体内也存在大量抗菌蛋白。
实施例8：蛋白质电泳检测在不同培养时间带有组氨酸标签的重组抗菌蛋白在培养基上清液和酵母菌体中的表达量。具体过程为：
只是在步骤(1)中将实施例7步骤(3)得到的酵母菌株接种到100mL BMGY培养基中，250rpm摇床培养24h。其余与实施例7步骤(2)(3)相同。
电泳结果见图4。结果表明样品中存在大量分子量约10kDa的带有组氨酸标签的重组抗菌蛋白，经甲醇诱导12小时后，酵母菌即开始分泌带有组氨酸标签的重组抗菌蛋白到培养基上清液中，菌体内也存在大量带有组氨酸标签的抗菌蛋白。
实施例9：制备抗菌蛋白。具体过程为：
(1)用0.2mol/L盐酸(含6mol/L盐酸胍)溶液溶解实施例5得到的重组抗菌蛋白。
(2)加入50mg/mL溴化氰定向切割增加的N端融合肽段，室温避光作用24h后，缓慢加入去离子水稀释20倍终止反应。
(3)将步骤(2)得到的溶液装入截流分子质量7000Da的透析袋，透析除盐，冷冻干燥得到抗菌蛋白。
(4)将步骤(3)得到的抗菌蛋白进行蛋白质电泳，并电转到PVDF膜上，用化学测序法测定抗菌蛋白的全部氨基酸序列，结果与序列表中序列1所示的氨基酸序列完全相同。
实施例10：制备高纯度的带有组氨酸标签的抗菌蛋白。具体过程为：
实施例6得到的带有组氨酸标签的抗菌蛋白溶于10mmol/L咪唑溶液，经镍柱纯化，收集150mmol/L咪唑溶液的洗脱峰，透析脱盐并冻干，得到高纯度的带组氨酸标签的重组抗菌蛋白。
实施例11：抗菌蛋白的最低抑菌浓度(MIC)检测。具体过程为：
将细菌或真菌摇床培养到对数生长期，再调整菌体浓度为104cfu/mL作为待测菌液。抗菌蛋白用无菌水配制成1mmol/L母液，取适量抗菌蛋白母液到不同的待测菌液中达到不同的终浓度，37℃培养24h，用分光光度计检测菌液在600nm的光吸收值。对照组用无菌水代替抗菌蛋白溶液。最低抑菌浓度(MIC)即是能抑制细菌生长的最低抗菌蛋白浓度。供试菌株为：革兰氏阳性菌如苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)；革兰氏阴性菌如大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；真菌如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，假丝酵母(Candida albicans)。
结果表明，抗菌蛋白的抗菌谱为：对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，对革兰氏阴性菌和酿酒酵母、假丝酵母无抑菌活性。具体的最低抑菌浓度为：枯草杆菌(MIC 0.4μmol/L)、苏云金芽胞杆菌(MIC 0.8μmol/L)、金黄色葡萄球菌(MIC 13.3μmol/L)。
实施例12：带有组氨酸标签的抗菌蛋白的最低抑菌浓度(MIC)检测。具体过程为：
将实施例10中得到的高纯度的带有组氨酸标签的抗菌蛋白按实施例9的方法检测最低抑菌浓度，结果表明，它和抗菌蛋白的抗菌谱和最低抑菌浓度相同。
实施例13：带有组氨酸标签的抗菌蛋白的溶血活性测定。具体过程为：
收集健康人血液1mL，1500rpm，4℃离心10min，弃上清液，血细胞用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次后，按10％体积比重悬。将实施例10中得到的带有组氨酸标签的抗菌蛋白用PBS溶解成母液，取适量添加到红细胞悬液中达到不同的终浓度，37℃孵育1h。样品4000rpm离心5min，用分光光度计检测上清液在567nm的光吸收值(A样)。负对照中用PBS代替抗菌蛋白溶液测得A负，正对照用0.2％Ttiton X-100代替抗菌蛋白溶液测得A正，样品溶血率＝(A样-A负)/(A正-A负)×100％。溶血实验结果表明，20μmol/L带有组氨酸标签的抗菌蛋白对人红细胞的溶血率为1.29％，5μmol/L带有组氨酸标签的抗菌蛋白对人红细胞的溶血率为0.5％，表明该抗菌蛋白对人的红细胞无明显的溶血活性，具有药物开发的可行性。
实施例14：对比分泌带有组氨酸标签的抗菌蛋白的酵母的培养基上清液和氨苄青霉素对枯草杆菌的抑菌活性。具体过程为：
(1)采用抑菌圈法测定样品的抗菌活性，具体方法是：接种枯草杆菌到50mL液体LB培养基中，37℃，150rpm摇瓶培养16小时，得到对数生长期的细菌悬液。加热融化LB固体培养基，冷却到55-60℃，每10mL培养基中加入20μL细菌悬液，快速混匀后倒入培养皿冷却，制备成含菌固体培养基，用打孔器打出直径10mm的上样孔，每个孔内加入待测样品30-100μL，待溶液充分吸收后，37℃倒置培养12-16h，测定抑菌圈直径。抑菌圈越大、越清晰，说明样品的抗菌活性越强。
(2)取实施方案6步骤(4)中经甲醇诱导培养72小时的酵母菌培养液，离心收集培养基上清液，80℃加热处理20min并冷却。
(3)分别取100μL步骤(2)的培养基上清液和100μL 0.5μg/μL的氨苄青霉素(共含有50μg氨苄青霉素)溶液添加到含有枯草杆菌的固体培养基平板的上样孔中，30℃培养。
24h后两者都能形成约18mm的清晰抑菌圈，但培养48h后，氨苄青霉素形成的抑菌圈变模糊，但培养基上清液形成的抑菌圈依然清晰，见图5。结果说明：100μL酵母培养基上清液中带有组氨酸标签的抗菌蛋白的抑菌活性相当于50μg氨苄青霉素的抑菌活性，但枯草杆菌不会对带有组氨酸标签重组抗菌蛋白产生抗性，该蛋白的抗菌活性强于氨苄青霉素。
实施例15：用带有组氨酸标签的重组抗菌蛋白制备抗菌消毒剂和抗菌漱口水等外用药物。具体过程为：
(1)将实施例10得到的带组氨酸标签的重组抗菌蛋白分装、加盖、包装。
(2)制备溶媒：将下列各组份混合，充分溶解，超滤除菌，分装、加盖、包装。
(3)抗菌消毒剂按以下配方(重量百分比)制备：丙三醇，1.0；氮酮，0.2；海藻糖，2.0；透明质酸，0.05；生理盐水，加至100.0。
(4)抗菌漱口水按以下配方(重量百分比)制备：丙三醇，10.0；薄荷香精，1ppm；生理盐水，加至100.0。
(5)将混合制得的水溶液单独保存，使用时由使用者抽取小量，注入含有带组氨酸标签的抗菌蛋白冻干粉的另一无菌容器中，达到2％的抗菌蛋白终浓度。待带组氨酸标签的抗菌蛋白充分溶解后，该溶液用于皮肤外用或漱口。
实施例16：含抗菌蛋白的毕赤酵母饲料添加剂制备。具体过程为：
按照实施例5和实施例6的(1)(2)(3)(4)步骤，离心收集表达重组抗菌蛋白的毕赤酵母菌作为饲料添加剂。将此酵母按0.1％(即0.1g酵母/kg饲料)的剂量混入饲料中饲喂动物。
以下为序列表，各序列分别为：
序列1为抗菌蛋白的氨基酸序列；
序列2为编码序列1的抗菌蛋白基因的核苷酸序列；
序列3为引物P1的核苷酸序列；
序列4为引物R1的核苷酸序列；
序列5为引物P2的核苷酸序列；
序列6为引物R2的核苷酸序列；
序列7为引物P3的核苷酸序列；
序列8为引物R3的核苷酸序列；
序列9为引物P4的核苷酸序列；
序列10为引物R4的核苷酸序列；
序列11为含有序列2的DNA的核苷酸序列；
序列12为引物α-Factor的核苷酸序列；
序列13为引物R5的核苷酸序列；
序列14为含有序列2和组氨酸标签的DNA的核苷酸序列；
序列15为含有序列1和组氨酸标签的重组抗菌蛋白的氨基酸序列。
序列表
<110>华中科技大学
<120>一种抗菌蛋白及其制备方法和应用
<130>/
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Claims (11)
1.一种抗菌蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
2.编码权利要求1所述的抗菌蛋白的基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的编码权利要求1所述的抗菌蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，它是在表达载体的多克隆位点中插入了权利要求2所述的基因，在所插入的权利要求2所述基因的5’端加入了酶切位点和甲硫氨酸密码子，在所插入的权利要求2所述基因的3’端加入了终止密码子和酶切位点。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体是pPIC9K质粒。
6.表达权利要求1所述抗菌蛋白的pPIC9K重组质粒的构建方法，包括以下步骤：
（1）DNA聚合酶进行延伸反应：反应条件为：序列表中序列3所示的浓度为10μmol/L的引物P1和序列表中序列4所示的浓度为10μmol/L的引物R1各5μL,2×pfu PCR MasterMix10μL,94℃变性3min,72℃延伸10min，得到DNA产物；
（2）PCR(聚合酶链反应)扩增DNA片段：PCR反应条件为：上述步骤（1）中的DNA产物1μL，序列表中序列5所示的浓度为10μmol/L的引物P2和序列表中序列6所示的浓度为10μmol/L的引物R2各1μL,2×pfu PCR MasterMix10μL,超纯水7μL，94℃变性3min后,按94℃30sec,55℃30sec,72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min,得到扩增的DNA产物；
（3）用上述步骤（2）的DNA产物1μL，序列表中序列7所示的浓度为10μmol/L的引物P3和序列表中序列8所示的浓度为10μmol/L的引物R3各1μL，PCR条件与上述步骤（2）相同，得到进一步扩增的DNA产物；
（4）用上述步骤（3）中的DNA产物1μL，序列表中序列9所示的浓度为10μmol/L的引物P4和序列表中序列10所示的浓度为10μmol/L的引物R4各1μL，PCR条件与上述步骤（2）相同，合成得到具有序列表中序列11所示序列的含有本发明抗菌蛋白基因的DNA产物；
（5）上述步骤（4）中的DNA产物用EcoRI酶切，pPIC9K质粒用EcoRI酶切并用CIAP 碱性磷酸酶去磷酸化，电泳并回收酶切后的DNA产物和pPIC9K，经T4DNA连接酶16℃连接4h，得到的混合溶液体系中，含有正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒和反向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒；
（6）将上述步骤（5）中含有混合重组质粒的溶液体系转化感受态大肠杆菌TOP10菌株，在含氨苄青霉素抗性的LB培养基上挑选单菌落，扩大培养后提取质粒；
（7）用序列表中序列12所示的引物α-Factor和序列表中序列10所示的引物R4，利用PCR方法筛选正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重组质粒，PCR反应条件是：以1μL上述步骤（6）中的质粒作为模板，浓度为10μmol/L的α-Factor和R4引物各1μL,2×PCRMasterMix10μL,超纯水7μL，94℃变性3min,按94℃30sec,55℃30sec,72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min；经电泳检测，将能扩增出约370bp片段的质粒进一步进行EcoRI酶切鉴定；酶切后的质粒经电泳检测，将得到约290bp酶切片段的质粒进行DNA序列测定，在EcoRI酶切位点上正向插入了序列表中序列2的质粒，即为表达本发明抗菌蛋白的pPIC9K重组质粒。
7.一种制备权利要求1所述的抗菌蛋白的方法，其特征在于：用SalI酶切以权利要求6所述方法构建的pPIC9K重组质粒，电泳回收线性化的pPIC9K重组质粒，用电转化法将回收的线性化的pPIC9K重组质粒转入毕赤酵母中，将转入了pPIC9K重组质粒的毕赤酵母菌株接种到适合的培养基，在适合的条件下培养诱导抗菌蛋白基因表达，离心收集培养基上清液，经纯化得到本发明抗菌蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备权利要求1所述的抗菌蛋白的方法，其特征在于,所述的用电转化法将回收的线性化的pPIC9K重组质粒转入毕赤酵母中的具体方法是：取100μL新鲜制备的毕赤酵母GS115感受态细胞，加入20μL线性化的pPIC9K重组质粒充分混合后，1.5KV,25μF,200Ω,电击5ms，迅速加入1ml预冷的山梨醇混匀，取200μL酵母悬液涂布于MM平板，30℃培养3-4天，挑选生长出的菌落到含有0.25mg/mL G418的YPD培养基中进行培养，将生长出的菌落接种到YPD液体培养基中扩大培养，离心收集菌体并重悬于蒸馏水中，超声破碎后离心收集上清液进行PCR鉴定，PCR反应条件为：上清液1μL，序列表中序列9所示的浓度为10μmol/L的引物P4和序列表中序列10所示的浓度为10μmol/L引物R4各1μL,2×PCR Master Mix10μL,超纯水7μL，94℃变性5min,按94℃30sec,55℃30sec,72℃1min共30次循环，再72℃延伸5min；所述的MM平板之MM固体培养基配方是：无菌蒸馏水，800ml；琼脂粉，15g，高压灭菌，使用前加热并冷却到60℃，依次加入以下试剂：10×YNB，100ml；500×B，2ml；10×M，100ml；其中：10×YNB的配方是：酵 母氮源碱（YNB），34g；硫酸铵，100g；蒸馏水，1000ml，过滤除菌；500×B的配方是：生物素，20mg；蒸馏水，100ml，过滤除菌；10×M的配方是：甲醇，5ml；蒸馏水，95ml，过滤除菌。
9.根据权利要求7所述的制备权利要求1所述的抗菌蛋白的方法，其特征在于,所述的将转入了pPIC9K重组质粒的毕赤酵母菌株接种到适合的培养基，在适合的条件下培养诱导抗菌蛋白基因表达，离心收集培养基上清液，经纯化得到本发明抗菌蛋白的具体方法是：将转入了pPIC9K重组质粒的毕赤酵母菌株接种到BMGY培养基，250rpm摇床培养24h后，更换BMMY培养基，并添加0.5%甲醇继续培养，此后每24h补加0.5%甲醇诱导抗菌蛋白基因的表达，培养72小时后，离心收集培养基上清液，80℃加热处理20min并冷却，真空浓缩到1/10体积，经70%硫酸铵沉淀过夜，抽滤收集蛋白沉淀，冷冻干燥得到重组抗菌蛋白，用含6mol/L盐酸胍的0.2mol/L盐酸溶解该重组抗菌蛋白,再加入50mg/mL溴化氰定向切割增加的N端融合肽段，室温避光作用24h后,缓慢加入去离子水稀释20倍终止反应，用截流分子质量7000Da的透析袋透析除盐，冷冻干燥得到本发明抗菌蛋白。
10.根据权利要求4或5所述的重组表达载体，其特征在于，在所插入的权利要求2所述基因的3’端与所加入的终止密码子之间增加了编码六个组氨酸的密码子。
11.权利要求1所述抗菌蛋白在制备抗菌革兰氏阳性菌的抗菌剂中的应用。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Application publication date: 20110601 Assignee: YIJI WUHAN BIOLOGY TECHNOLOGY CO.,LTD. Assignor: Huazhong University of Science and Technology Contract record no.: 2015420000133 Denomination of invention: Antibacterial protein and preparation method and application thereof Granted publication date: 20130918 License type: Exclusive License Record date: 20150709 |
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