CN103361341A - 杀菌肽ll-37的基因工程的表达及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

杀菌肽LL-37的基因工程的表达及其制备方法及用途，包括合成编码杀菌肽LL-37的DNA序列，连接到适合的表达载体进行表达和纯化，其中编码杀菌肽LL-37的DNA序列，采用在大肠杆菌偏爱的密码子，在大肠杆菌融合表达系统表达的LL-37，占菌体总蛋白的20％左右。纯化后的融合蛋白经过溴化氰切断，得到目的多肽LL-37，经HPLC制备后得到纯度＞90％的LL-37粉末。低浓度的LL-37就可在人体外用制剂方面可发挥巨大的杀菌效果，其作为外用药物如皮肤感染的治疗。本发明的优点是将杀菌肽LL-37以融合蛋白形式表达并制备，工艺简单，每立升发酵液收率可达20mg，具有工业量产意义。

Description

杀菌肽LL-37的基因工程的表达及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及杀菌肽LL-37的基因工程表达方法及其制备方法以及杀菌肽LL-37在皮肤感染中的应用。

背景技术

自1909年奥地利科学家首先报道、1932年德国科学家第一个将合成磺胺类药物百浪多息应用于临床以来，抗菌药物的研发在整个药物研发领域占据重要地位，人类与病原体的斗争一度占据上风。然而随着抗生素的广泛应用，滥用抗生素及伴随而来的细菌的耐药性、抗生素的副作用等问题逐渐成为人类面临的严峻问题。多重耐药菌(multiple drug-resistant，MDR)、极度耐药菌(extensivelydrug-resistant，XDR)及泛耐药菌(Pan drug-resistant，PDR)的高频率出现，是目前公共卫生面临的重大难题。近期报道的超级细菌指携带新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metal-beta-lactamase 1，NDM-1)的一类细菌，属于XDR或PDR，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA)也是较为常见的MDR。

开发新型抗生素的周期很长，传统方法需要10年左右，而细菌针对一种新的抗菌药物产生耐药性的平均周期为2年，抗生素新药研发的脚步已经追不上细菌诡变的脚步。开发具有新型结构、新作用机制、新作用靶点的安全的抗菌药物是公共卫生安全的需要。杀菌肽(antimicrobial peptide，AMP)是一种多肽类抗菌药物，作用机制与目前的抗生素不同，正是目前的一个研究热点。

生物体对外界微生物的入侵本能的反应产生杀菌肽，通过迅速有效的天然免疫从而保护机体不受病菌侵害。杀菌肽通常是由不到50个氨基酸组成的富含赖氨酸和精氨酸的阳离子多肽。30余年来，科学家已从各种生物体内分离出1000多种杀菌肽。杀菌肽杀菌与细菌细胞膜的结合有关，而病原体的细胞膜很难对杀菌肽产生耐药。还可能通过刺激B淋巴细胞及其它免疫细胞，包括细胞迁徙、增殖、产生细胞因子和趋化因子发挥作用。杀菌肽对革兰氏阴性、阳性细菌及厌氧菌有效，包括MDR、XDR及PDR。此外还可杀灭部分病毒、真菌、原虫及寄生虫，又被称为“新型抗生素”。同时由于杀菌肽本身没有毒性，代谢产物为人体本身的氨基酸，已受到国内外广泛关注。

LL-37是目前在人类发现的唯一的内源性生物杀菌肽(cathelicidin)，呈兼性的α-螺旋，由中性粒细胞、巨噬细胞、粘膜上皮细胞和成角质细胞等产生，是中性粒细胞颗粒中的主要成分，在血浆、呼吸道表面分泌的液体和伤口的分泌物中均能检测到LL-37的存在，在血浆中的浓度较低，具有广谱的杀菌作用和免疫调节作用。带有大量正电荷的LL-37与细菌细胞膜结合，破坏细胞壁的完整性；LL-37刺激中性粒细胞、单核细胞和T细胞的趋化作用，对巨噬细胞具有双向调节的作用，一方面与IL-1β协同促进巨噬细胞的炎症反应，另一方面与脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的结合抑制LPS引起的巨噬细胞炎性细胞因子的产生并降低TRL介导的巨噬细胞激活；LL-37还可抑制细菌粘附和生物膜的形成，从而破坏细菌在宿主体内的自我保护而起到杀细菌作用。因为许多院内感染细菌通过吸附作用及其后形成的生物膜对抗宿主的天然免疫，并逃避传统抗生素的杀菌作用，也是细菌产生多重耐药的机制之一。因而LL-37有可能应用于对院内感染的预防和治疗，并可能成为对多重耐药菌的治疗策略的一部分。LL-37临床杀菌效果好，最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)低，无明显的溶血反应，性质稳定，具有广阔的应用天地。

杀菌肽能否通过基因工程量产是其成为临床候选药物广泛应用的关键。LL-37需要量产以满足基础科学研究及临床试验的需要。LL-37目前主要是化学合成。多肽化学合成的每一步，都要去掉其副产物，所以随着氨基酸序列的长度越长，多肽的化学合成越繁杂，HPLC制备副产物越多，价格越昂贵，LL-37由于其兼性的α-螺旋的结构，可能存在空间位阻，化学合成十分困难。目前LL-37化学合成的市场价格高达每毫克一千美元，且生产过程中会产生大量的有机溶剂废液(生产1kgLL-37约1000L有机废液)，不利于环保。而基因工程生产杀菌肽应该是一种能够量产及相对廉价的方法，然而，尚在起步阶段，多国投入巨大资金进行研究。

基因工程生产杀菌肽存在一个悖论：在基因工程菌发酵的过程中，基因工程菌分泌的杀菌肽会杀死基因工程菌本身，限制发酵使之不能继续。为解决这个问题，国内目前研究有用毕赤(Pichia Pastoris)酵母作为表达系统，以甲醇诱导分泌性融合蛋白表达杀菌肽的方法。然而，酵母发酵时间需要5天5夜，分泌到发酵液中的小肽量少，从大量发酵液中回收纯化十分困难。2002年中国科学院上海生物工程研究中心报道采用毕赤酵母表达杀菌肽爪蟾素magainin，报道中未提及收率与目的多肽的回收方法。如果将LL-37基因与融合蛋白基因连接，表达后获得可溶性融合蛋白同样需要再进一步切断(化学切断或酶切)，也会出现融合蛋白切点错误的问题。如重庆第三军医大学采用毕赤酵母表达杀菌肽hPAB-β(人β-defensin 2的异构体)，报道收率为241.2±29.5mg/L，然而仅36％是切点准确的目的多肽hPAB-β。可利用大肠杆菌作为基因工程菌，通过在大肠杆菌内应用一个较大的融合蛋白载体或串联的方式解决抗菌肽对宿主细胞的毒性。采用带有大量负电荷的氨基酸的载体蛋白作为配体来中和抗菌肽的大量正电荷，或串联时在每个抗菌肽前有时有一小段负电荷的配体，有利于包涵体的形成。如采用融合蛋白则分子量大使收率显著降低，如串联则因为通常使用溴化氰作为化学切割的物质，其产物只有1/n是目的多肽，其余(n-1)/n的C-terminal均为高丝氨酸内酯多肽，故其真实收率并不高。

综上所述，国外多利用大肠杆菌作为基因工程菌，将杀菌肽(富含正电荷)与特定的载体蛋白(富含负电荷)形成包涵体，可以解决杀菌肽杀死基因工程菌本身的问题，融合蛋白纯化后进一步进行切断从而获得目的多肽。融合蛋白化学切断多使用溴化氰(Cyanogen bromide，CNBr)，如杀菌肽C末端是甲硫氨酸，被溴化氰切断后会产生错误的产物同型丝氨酸(Homo-serine)。韩国报道通过大肠杆菌制备杀菌肽buforin II，采用溴化氰切断融合蛋白，其目的多肽C-末端为同型丝氨酸(Homo-serine)，非人体正常氨基酸，收率107mg/L。其他方法的切断工艺复杂，切断错误也很常见，因此目的多肽收率往往较低。2001美国专利通过大肠杆菌制备buforin II采用溴化氰切断融合蛋白，报道中未提及收率。加拿大温哥华Micrologix Biotech公司通过大肠杆菌制备buforin II采用15个拷贝串联增加表达量，CNBr切断融合蛋白后目的多肽末端也是错误的同型丝氨酸，收率100mg/L。2010年葡萄牙报道生产在大肠杆菌内LL-37融合蛋白表达后为避免使用溴化氰以甲酸切断纯化，下游工艺并不复杂，但收率仅1mg/L。国内也有报道采用大肠杆菌系统产生包涵体生产杀菌肽，复旦大学生命科学院、同济大学生命科学院及上海高科生物技术公司合作研究的杀菌肽GK1，收率仅5.7mg/L，其多肽末端也是同型丝氨酸，天津大学化工学院与天士力公司合作研究报道生产杀菌肽pexiganan的收率为1.1mg/L发酵液，中国医学科学院血液研究所通过基因工程菌大肠杆菌产生包涵体的方式生产LL-37，切断融合蛋白后最终产物为GSLL-39，在LL-37肽链的N-端多了甘氨酸(Glycine)及丝氨酸(Serine)两个氨基酸，收率仅1.1mg/L。以上研究均未转化成工业化生产。

因此，基因工程生产杀菌肽要解决发酵过程中表达产生的杀菌肽会将基因工程菌本身杀死而使发酵不能进行的问题，还要解决表达过低以及下游工艺切断的问题，高效率地准确地切断融合蛋白。

在通过大肠杆菌发酵获得不溶性包涵体后，必需切断融合蛋白获得目的多肽。杀菌肽结构中往往不含有甲硫氨酸(Methionine)、酪氨酸(Tyrosine)及色氨酸(Tryptophan)，故可以设计甲硫氨酸作为其切点采用溴化氰化学切断融合蛋白。溴化氰必须是对目的多肽N末端甲硫氨酸进行切断才能获得正确的产物。在杀菌肽的研究中，许多科学家都采取了溴化氰切断的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的缺陷，采用大肠杆菌JM109作为基因工程菌，将LL-37基因N端以甲硫氨酸密码子ATG与高效表达的融合蛋白基因连接，转入Lac质粒中，用异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，工程菌高密度发酵后获得菌体，并解决了大量菌体破壁及融合蛋白纯化的问题，采用溴化氰切断融合蛋白-methionine-LL-37结构LL-37 N端的甲硫氨酸的方法，因此不会改变目的多肽的结构。

本发明提供的杀菌肽LL-37的基因工程的表达方法，包括合成编码杀菌肽LL-37的DNA序列，，连接到表达载体：GST载体或pUC18载体或pEZZ载体，在原核表达系统大肠杆菌JM109中进行表达和纯化，其中LL-37基因工程菌的表达载体中的单链DNA结构SEQ ID：

-CTG-CTG-GGT-GAT-TTC-TTC-CGT-AAA-AGC-AAA-GAA-AAA-ATC-GGT

-AAA-GAA-TTC-AAA-CGT-ATC-GTT-CAG-CGT-ATC-AAA-GAT-TTC-CTG

-CGT-AAC-CTG-GTT-CCG-CGT-ACC-GAA-AGC。

其中所含的核酸序列在原核表达系统中进行表达。所含的核酸序列在大肠杆菌JM109中进行表达，所用的表达载体是融合表达载体，GST载体或pUC18载体或pEZZ载体。

所含的核酸序列还可以在真核表达系统中进行表达。表达系统包括合适的宿主细胞，以及能够在宿主细胞中复制并稳定存在的质粒或载体。

可以作为宿主细胞的例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链球菌、鼠伤寒沙门氏菌等；真核细胞，如酵母等。

可以使用的载体可以包括染色体来源的、非染色体来源的及合成的DNA序列。如：噬菌体DNA、杆状病毒、细菌质粒、酵母质粒以及由质粒、噬菌体和病毒DNA组合衍生的载体。

优选的，在原核表达系统中表达本发明的多肽。更优选的，可以将本发明的多肽克隆入高效率的表达载体(如市售的表达载体)与载体蛋白进行融合表达。

为提高生物利用率并增强免疫效果，本发明制备的LL-37还可以含有药学上可以接受的载体和或辅料等物质，所述的载体是DDH2O或生理盐水。所述的辅料是异丙醇及丙二醇或γ-多聚谷氨酸。

本发明的又一目的是提供杀菌肽LL-37的基因工程制备方法，包括基因重组、重组融合蛋白的获得纯化和切断，目的多肽的纯化，其步骤如下：

(1)为合成基因工程菌LL-37，用化学合成的方法合成编码LL-37的DNA序列连接在载体蛋白上，之间以大肠杆菌偏爱的甲硫氨酸Methionine的DNA密码子ATG连接；

(2)为合成基因工程菌LL-37，将载体蛋白-Methionine-LL-37的DNA序列插入Lac质粒载体(pUC18)；

(3)将上述重组质粒转入大肠杆菌JM109进行表达，得到基因工程菌杀菌肽LL-37菌株；

(4)将菌株置于营养丰富的LB培养基中发酵，发酵温度37℃，发酵时间为12-24小时，发酵液中加入氨苄西林使其最后浓度为50μg/ml，以及IPTG，终浓度为0.5mM，发酵结束后离心获得菌体，经细胞粉碎，包涵体复性，融合蛋白的分离纯化；

(5)冻干后融合蛋白加入70％甲酸反应体系(蛋白浓度1mg/ml)，通氮气1小时后，加入溴化氰的乙腈溶液，W溴化氰/W融合蛋白＝100∶1，W溴化氰/V乙腈＝1g∶1ml，封瓶后黑暗中磁力搅拌7天，加入2N氢氧化钠调节至pH5-6，溶液呈无色，终止反应，2000分子量透析过夜，冻干除去溴化氰，加60％乙腈溶解，制备RP-HPLC C18柱(φ30X300mm，Agilent，USA)。线性梯度20-80％乙腈，含0.1％三氟乙酸，30ml/min 30分钟一个周期。220nm的每个峰均进行小肽蛋白电泳分析。收取目的多肽。旋蒸后冻干，获得重组LL-37粉末，纯度＞90％；

(6)杀菌肽LL-37粉末溶于载体或辅料形成药品用于治疗。

本发明提供所述的杀菌肽LL-37形成药品用于治疗皮肤感染。

本发明的优点是利用基因工程技术成功的生产LL-37。本发明将杀菌肽LL-37以融合蛋白形式表达并制备，工艺简单，每立升发酵液收率可达20mg，具有工业量产意义。本发明提供一种新型的抗生素--杀菌肽LL-37，是一种人体内源性物质，杀菌浓度MIC低，无明显的溶血反应，可用于治疗双重感染或多重耐药菌，对真菌感染也有效。使用本发明的杀菌肽LL-37具有以下优点：

1)杀菌效果好，可以治疗多重耐药菌或混合感染，甚至真菌感染，杀菌浓度MIC低。

2)安全性好，多肽在体内最终分解成氨基酸，没有明显的肝肾毒性，杀菌肽LL-37是人体内源性物质，没有明显的溶血作用。在实验动物中，以较高剂量对小鼠进行腹腔注射，在较长的观测期内，小鼠健康存活。

3)利用本发明可以通过基因工程的方法大规模生产，降低了成本。

附图说明

图1是质粒的构建过程示意图，图示如何将基因片段插入Lac质粒(如pUC18)的过程；

图2是纯化后的LL-37的HPLC图，图示19分钟峰为目的多肽LL-37；

图3是纯化后的LL-37的质谱图，图示LL-37分子量4492.7，符合设计；

图4是杀菌实验示意图(菌落：E.Coli)。

具体实施方式

实施例一：

根据LL-37的氨基酸序列，设计合成DNA基因片段，其基因工程菌是基因工程菌(E.Coli.)。为合成基因工程菌(LL-37)的载体，本实施例以常规PCR方法扩增联接构成含Met-LL-37的密码子，克隆到Lac质粒中，酶切位点为BamH I及SalI，形成融合蛋白基因，构建表达质粒，阳性重组质粒用PCR的方法证实。将阳性重组质粒转染大肠杆菌E.Coli.JM109构建LL-37基因工程菌。参见图1。

LL-37基因工程菌的表达载体中的单链DNA结构SEQ ID：

-CTG-CTG-GGT-GAT-TTC-TTC-CGT-AAA-AGC-AAA-GAA-AAA-ATC-GGT-AAA-GAA-TTC-AAA-CGT-ATC-GTT-CAG-CGT-ATC-AAA-GAT-TTC-CTG-CGT-AAC-CTG-GTT-CCG-CGT-ACC-GAA-AGC。

合成DNA的8条引物如下：

引物1 ccaaatGGATCCTGCATGCTGCTGGG；

引物2 CTTTTACGGAAGAAATCACCCAGCAGCATGC；

引物3 TGATTTCTTCCGTAAAAGCAAAGAAAAAATCGGTAAAGAA；

引物4 CTGAACGATACGTTTGAATTCTTTACCGATTTTTTCTTTG；

引物5 TTCAAACGTATCGTTCAGCGTATCAAAGATTTCCTGCGTA；

引物6 CGGTACGCGGAACCAGGTTACGCAGGAAATCTTTGATACG；

引物7 ACCTGGTTCCGCGTACCGAAAGCTAGgtcgacccaaat；

引物8 ATTTGGGTCGACCTAGCTTT。

经5次PCR循环得到目的DNA

根据杀菌肽LL-37的结构，将其在基因工程菌(E.Coli.)通过Lac载体进行表达，将载体蛋白通过methionine与LL-37进行联接，将融合蛋白的DNA序列用BamH I及Sal I酶解转入Lac载体，进行诱导表达后的产物是含有LL-37的融合蛋白，可以避免杀死基因工程菌本身，融合蛋白经纯化切断后可以释放LL-37。参见图2。

250ml种子培养液(1000ml种子培养液含有蛋白胨10g，酵母抽提物5g，0.02mol/L的磷酸缓冲液20ml，pH7.0)置于1000ml三角烧瓶中，120℃灭菌20分钟，冷却后加入20％的葡萄糖溶液5ml。将1ml低温保存于20％甘油管中的菌株加入上述溶液，加氨苄西林(Ampicillin)使其最后浓度为50μg/ml，37℃，摇床培养12-14小时(150rpm)。发酵后，4000rpm离心30min收集菌体。

将菌体以1000g/3L的比例悬浮于含1％的氯化钠、1mmol/L的EDTA、20mmol/L的磷酸钾pH7.0的溶液中，在悬浮液中加入1g溶菌酶，室温搅拌1小时，以破碎细胞，菌体悬浮液于10000rpm离心30min，弃上清。

将上述沉淀以250g/L的比例加入8mol/L的尿素溶液。搅拌、抽提过夜，20000rpm离心30min，取上清，复性后有沉淀产生，以10000rpm离心30min，取沉淀，2M Urea打碎洗涤1次，再打碎水洗1次。分离、纯化包涵体：沉淀溶于8M尿素，Sephadex G-100层析A280nm检测，将收集液透析过夜，置于冻干机内冻干。

将包涵体悬浮在70％甲酸反应体系(蛋白浓度1mg/ml)，通氮气1小时后，加入溴化氰的乙腈溶液(W溴化氰/W融合蛋白＝100∶1，W溴化氰/V乙腈＝1g∶1ml)，封瓶后黑暗中磁力搅拌7天，加入2N氢氧化钠调节至pH5-6，溶液呈无色，终止反应，2000分子量透析过夜，冻干除去溴化氰，加60％乙腈溶解，制备RP-HPLC C18柱(φ30X300mm，Agilent，USA)。线性梯度20-80％乙腈，含0.1％三氟乙酸，30ml/min 30分钟一个周期。220nm的每个峰均进行小肽蛋白电泳分析。收取目的多肽。旋蒸后冻干，获得重组LL-37粉末，纯度＞90％。LL-37溶于水，可以用于治疗皮肤感染。这是一种人体内源性物质，杀菌浓度MIC低，无明显的溶血反应，可用于治疗双重感染或多重耐药菌，对真菌感染也有效。

实施例二：

1：构建表达质粒

基因工程菌是基因工程菌(LL-37)。

为合成基因工程菌(LL-37)的载体，我们以常规PCR方法扩增联接构成含Met-LL-37的密码子，克隆到Lac(pUC18)质粒中，酶切位点为BamH I及Sal I，形成融合蛋白基因，构建质粒，阳性重组质粒用PCR的方法证实。将阳性重组质粒转染大肠杆菌E.Coli.JM19构建基因工程菌。

2：发酵

250ml种子培养液(1000ml种子培养液含有蛋白胨10g，酵母抽提物5g，0.02mol/L的磷酸缓冲液20ml，pH7.0)置于1000ml三角烧瓶中，120℃灭菌20分钟，冷却后加入20％的葡萄糖溶液5ml。将1ml低温保存于20％甘油管中的菌株加入上述溶液，加氨苄西林(Ampicillin)使其最后浓度为50μg/ml，37℃，摇床培养12-14小时(150rpm)作为扩大培养的种子菌。

第二日转至发酵罐培养，培养液组成为M9培养液，加葡萄糖浓度1％及微量元素CaCl2、NiNO3、CoCl3、MgSO4、FeCl3各1mg，氨苄西林(Ampicillin)最后浓度为50μg/ml，溶氧维持在20％以上，防泡剂为国产泡敌，pH用氨水调节。维持所列条件进行发酵(发酵罐：100L；温度：37℃；搅拌速度：700rpm；通气量：80L/min；pH7.0-7.5)。间隔一定时间各取1ml发酵液置于2个塑料离心管中，8000rpm离心10min，除去上清液，称取菌体重量为湿重(g/L)。当菌体浓度达log曲线中线，加IPTG，浓度为0.5mM，继续发酵4～6小时，在发酵8-12个小时后，细菌浓度达到峰值，离心收集菌体为湿重100～150g/L。

发酵后，4000rpm离心30min收集菌体。

3：下游工艺

将菌体以1000g/3L的比例悬浮于含1％的氯化钠、1mmol/L的EDTA、20mmol/L的磷酸钾pH7.0的溶液中，在悬浮液中加入1g溶菌酶，室温搅拌1小时，以破碎细胞，菌体悬浮液于10000rpm离心30min，弃上清。

将上述沉淀以250g/L的比例加入8mol/L的尿素溶液。搅拌、抽提过夜，20000rpm离心30min，取上清，复性后有沉淀产生，以10000rpm离心30min，取沉淀，2M Urea打碎洗涤1次，再打碎水洗1次。分离、纯化包涵体：沉淀溶于8M尿素，Sephadex G-100层析A280nm检测，将收集液透析过夜，置于冻干机内冻干。

将纯化的融合蛋白悬浮在加入溴化氰，在70％甲酸的反应体系中，封瓶后黑暗中磁力搅拌7天，加入2N氢氧化钠调节至pH5-6，溶液呈无色，终止反应，2000分子量透析过夜，冻干除去溴化氰，制备RP-HPLC，C18柱(

30X300mm)。线性梯度20-80％乙腈，含0.1％三氟乙酸，30ml/min 30分钟一个周期。220nm的每个峰均进行小肽蛋白电泳分析。旋蒸冻干后获得纯度90％以上的重组LL-37粉末。

4：杀菌肽LL-37的检测

将1mgLL-37粉末溶于1ml水，用标准Edman分析方法进行全序列分析，与LL-37多肽序列完全一致。对RP-HPLC层析出的肽峰，用合成的参考肽及MALDT-MS(LCQDeka XP Plus，Thermo Fenian，USA)的方法分析。分子量4492.7Da与计算分子量相同。

5：杀菌肽LL-37杀菌活性的测定

对照组为E.Coli(浓度为A600nm＝1 O.D.后再稀释10倍，约107/ml)预混生理盐水液体中保温0、1、2、3、4小时后涂板，LL-37与E.Coli预混生理盐水液体中保温0、1、2、3、4小时后涂板，LL-37浓度分别是10μg/ml及20μg/ml。各组涂板后37℃保温过夜后数平板菌落数。计算杀菌百分数并作图。从图中可以发现，保温3小时后，20μg/ml LL-37杀菌效果＞95％。参见图3。

选择皮肤感染常见的E.Coli、B族链球菌及金黄色葡萄球菌(MASA)，浓度约为107/ml，预混生理盐水液体中，治疗组中加入LL-37使其终浓度为20μg/ml，对照组与细菌治疗组同时37℃保温2小时后涂板，各组涂板后37℃保温过夜后数平板菌落数。计算杀菌百分数。参见表1。

表1：杀菌实验(菌落数％)

6：杀菌肽LL-37的安全性实验(小鼠实验)

雄性昆明小鼠20只，每只体重20g左右，购自中科院上海动物中心。分为两组，一组为基因工程制备的杀菌肽重组LL-37，另一组为对照组注射无菌水盐水。

取1mg纯化的杀菌肽重组LL-37用1ml无菌水悬浮，对照组注射1ml无菌水，对小鼠进行腹腔注射进行观察24小时。

表2：安全性实验(昆明鼠)

Claims (6)

1.一种杀菌肽LL-37的基因工程的表达方法，包括合成编码杀菌肽LL-37的DNA序列，连接到表达载体：GST载体或pUC18载体或pEZZ载体，在原核表达系统大肠杆菌JM109中进行表达和纯化，其中LL-37基因工程菌的表达载体中的单链DNA结构SEQ ID：

-CTG-CTG-GGT-GAT-TTC-TTC-CGT-AAA-AGC-AAA-GAA-AAA-ATC-GGT-AAA-GAA-TTC-AAA-CGT-ATC-GTT-CAG-CGT-ATC-AAA-GAT-TTC-CTG-CGT-AAC-CTG-GTT-CCG-CGT-ACC-GAA-AGC。

2.如权利要求1所述的杀菌肽LL-37的基因工程的表达方法，其中所述的杀菌肽LL-37还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

3.如权利要求2所述的杀菌肽LL-37的基因工程的表达方法，其中所述的载体是DDH20或生理盐水。

4.如权利要求2所述的杀菌肽LL-37的基因工程的表达方法，其中所述的辅料是异丙醇及丙二醇或γ-多聚谷氨酸。

5.一种杀菌肽LL-37的基因工程制备方法，包括基因重组、重组融合蛋白的获得纯化和切断，目的多肽的纯化，其步骤如下：

(1)为合成基因工程菌LL-37，用化学合成的方法合成编码LL-37的DNA序列连接在载体蛋白上，之间以大肠杆菌偏爱的甲硫氨酸Methionine的DNA密码子ATG连接；

(2)为合成基因工程菌LL-37，将载体蛋白-Methionine-LL-37的DNA序列插入Lac质粒载体；

(3)将上述重组质粒转入大肠杆菌JM109进行表达，得到基因工程菌杀菌肽LL-37菌株；

(4)将菌株置于营养丰富的LB培养基中发酵，发酵温度37℃，发酵时间为12-24小时，发酵液中加入氨苄西林使其最后浓度为50μg/ml，以及IPTG，终浓度为0.5mM，发酵结束后离心获得菌体，经细胞粉碎，包涵体复性，融合蛋白的分离纯化；

(5)冻干后融合蛋白加入70％甲酸反应体系(蛋白浓度1mg/ml)，通氮气1小时后，加入溴化氰的乙腈溶液，W溴化氰/W融合蛋白＝100∶1，W溴化氰/V乙腈＝1g∶1ml，封瓶后黑暗中磁力搅拌7天，加入2N氢氧化钠调节至pH5-6，溶液呈无色，终止反应，2000分子量透析过夜，冻干除去溴化氰，加60％乙腈溶解，制备RP-HPLC C18柱(φ30X300mm，Agilent，USA)。线性梯度20-80％乙腈，含0.1％三氟乙酸，30ml/min 30分钟一个周期。220nm的每个峰均进行小肽蛋白电泳分析。收取目的多肽。旋蒸后冻干，获得重组LL-37粉末，纯度＞90％；

(6)杀菌肽LL-37粉末溶于载体或辅料形成药品用于治疗。

6.如权利要求5所述的杀菌肽LL-37的基因工程制备方法，杀菌肽LL-37形成药品用于治疗皮肤感染。

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