CN107267537B

CN107267537B - 一种杂合抗菌肽mlh的制备方法

Info

Publication number: CN107267537B
Application number: CN201710572118.5A
Authority: CN
Inventors: 龚国利; 魏媛; 刘莹; 蔡文静; 张晓旭
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: CN107267537A

Abstract

本发明公开了一种基因工程技术制备融合抗菌肽的方法，以家蝇抗菌肽、LL‑37和幽门螺杆菌肽为母体肽，利用生物信息学方法分析获得MLH的氨基酸序列，并根据E.coli密码子偏好性编码杂合基因MLH的基因片断。采用SOE‑PCR技术合成所需的目的基因，并将其与表达载体pET‑32a(+)连接，转化至大肠杆菌表达菌株构建重组基因工程菌pET‑32a‑MLH/BL21(DE3)，经IPTG诱导蛋白融合表达，最后对获得的融合表达的杂合肽进行抑菌活性鉴定，结果表明，融合表达的杂合肽对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有明显的抑菌效果。

Description

一种杂合抗菌肽MLH的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种杂合抗菌肽MLH的制备方法。

背景技术

近些年来，随着抗生素广泛使用甚至滥用，出现越来越多的抗生素耐药性菌株，甚至耐多重药物菌株。细菌耐药性问题已经成为公共健康、环境与食品安全问题。抗菌肽因其稳定的理化性质、广谱的抗菌性以及对靶菌株不易产生耐药性等特点有望成为新型抗生素。具有与抗生素不同的作用靶点和机制，对抗生素耐药菌也有很好的抑菌效果，具有广谱的抗菌性，对G⁺、G^－菌以及真菌等均有一定的抑制作用。

目前抗菌肽的获得主要有三种途径：从生物体中直接分离提取；化学方法直接合成；运用基因工程方法获得。天然来源抗菌肽资源有限，化学合成抗菌肽成本高且工艺复杂，因此采用基因工程生产抗菌肽成为目前研究工作的首选，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种杂合抗菌肽MLH的制备方法，通过融合表达对包涵体进行变性以及复性处理提高重组蛋白表达产量。

本发明采用以下技术方案：

一种杂合抗菌肽MLH的制备方法，通过合成MLH基因并克隆至质粒形成重组质粒pET-32a-MLH；然后转化感受态E.coli BL21，构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21；经过IPTG强诱导剂诱导菌体表达，获得融合蛋白；对融合蛋白的分离纯化及复性；最后经EK酶切获得杂合抗菌肽MLH，所述杂合抗菌肽MLH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述杂合抗菌肽MLH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

优选的，包括以下步骤：

S1、以家蝇抗菌肽、LL-37和幽门螺杆菌肽为母体肽，获得MLH的氨基酸序列，在MLH基因的5’端加入肠激酶酶切位点序列，合成基因并将其克隆至质粒pET-32a中，构建重组质粒pET-32a-MLH；

S2、将步骤S1构建的重组质粒pET-32a-MLH转化至感受态E.coli BL21(DE3)中，构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21；

S3、挑取步骤S2获得的阳性菌株进行扩大培养，12000rpm，离心15min，收集菌体；

S4、对步骤S3收集的菌体进行超声破碎，分别收集细胞破碎后的上清液和沉淀；

S5、将步骤S4所得沉淀进行包涵体纯化和复性处理，得到包含目的蛋白的融合蛋白；

S6、将步骤S5所得融合蛋白加入EK酶，25℃过夜酶切，用截留分子量为10kDa超滤管进行超滤浓缩，得到杂合抗菌肽MLH。

优选的，步骤S1中重组质粒pET-32a-MLH质粒表达含有His标签融合的MLH。

优选的，步骤S2中，将构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21(DE3)经过氨苄青霉素抗性平板筛选阳性菌株。

优选的，步骤S3中，按照1％的接种量将菌体培养至OD600达到0.6，加入1.0mMIPTG、16℃、220rpm，诱导10h，收集菌体。

优选的，步骤S5中，将步骤S4所得沉淀充分溶解于Binding Buffer中，进行Ni²⁺离子亲和层析纯化，收集流穿液，使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白，使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰，将纯化后的蛋白经透析脱盐。

优选的，对步骤S4的上清液和沉淀进行SDS-PAGE和Western Blot检测，目的蛋白主要以包涵体形式存在，其中，所述Western Blot检测具体为：

分别将重组菌株未经IPTG诱导和经IPTG诱导的产物进行SDS-PAGE检测后，200mA，湿电转膜2h；5％脱脂奶粉封闭；加入1:1000比例稀释的His抗体，4℃过夜孵育；TBST洗涤3次，每次5min；加入1:1000比例稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1h；TBST洗涤4次，每次5min；BeyoECL Star kit显色。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

1、本发明创造性的将家蝇抗菌肽、LL-37和幽门螺杆菌肽做为母体肽，经IPTG诱导，目的蛋白主要以包涵体形式存在，之后通过进行包涵体变性和复性处理，经过肠激酶酶切，最终获得具有活性的杂合抗菌肽，对研发新型抗菌肽具有重要意义。

2、由于抗菌肽在宿主细胞中会产生毒性，且表达量较低，易被宿主降解，为了便于目的蛋白的分离纯化，本发明使用pET-32a表达系统进行融合表达，pET-32a含有His等标签，可以与镍离子特异性结合，通过亲和层析达到纯化的目的。

3、大肠杆菌表达系统具有成本低、操作简单、产量高等特点，同时大肠杆菌表达系统表达外源蛋白时容易形成不溶性包涵体，包涵体的形成可以有效的防止蛋白质的降解、减少对宿主细胞的毒害作用、提高重组蛋白表达产量。本发明通过包涵体进行变性和复性处理以提高重组蛋白的表达产量。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明制备方法流程图；

图2为本发明杂合肽MLH对大肠杆菌抑菌性测定；

图3为本发明杂合肽MLH对金黄色葡萄球菌抑菌性测定。

具体实施方式

本发明提供了一种杂合抗菌肽MLH的制备方法，以家蝇抗菌肽、LL-37和幽门螺杆菌肽为母体肽，获得MLH的氨基酸序列，并在该MLH基因的5’端加入肠激酶酶切位点序列，化学合成MLH基因并克隆至质粒pET-32a，构建重组质粒。将重组质粒转化至表达菌株，构建重组基因工程菌pET-32a-MLH/BL21(DE3)。经IPTG诱导，目的蛋白与载体标签蛋白进行融合表达，SDS-PAGE和Western Blot进行检测，目的蛋白主要以包涵体形式存在，之后通过进行包涵体变性和复性处理，经过肠激酶酶切，最终获得具有活性的杂合抗菌肽MLH。

请参阅图1，本发明一种杂合抗菌肽MLH的制备方法，具体步骤如下：

1、设计杂合基因MLH的基因片断。

杂合基因MLH的氨基酸序列为：

GWLKKIGKKIERVGQHTRKRIVQRIKAKKVFKRLEKLFSKIQN；

编码杂合基因MLH的碱基序列为：

GGTTGGCTGAAAAAAATCGGTAAAAAAATCGAACGTGTTGGTCAGCACACCCGTAAACGTATCGTTCAGCGTATCAAAGCTAAAAAAGTTTTCAAACGTCTGGAAAAACTGTTCTCTAAAATCCAGAAC。

在该MLH基因的5’端加入肠激酶酶切位点序列(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，根据E.coli密码子偏爱性设计编码杂合基因MLH的基因片断，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因的合成，并直接克隆至质粒pET-32a中，构建重组质粒pET-32a-MLH，该质粒表达含有His等多种标签融合的MLH。

2、采用CaCl₂法制备感受态宿主细胞E.coli BL21细胞，并将步骤1构建重组质粒pET-32a-MLH转化至感受态细胞中，菌落PCR进行验证。将阳性克隆的培养物送测序公司进行重组质粒的序列测定，分析重组质粒中外源基因是否正确插入。

菌落PCR验证步骤：挑取一些菌落分别接种于5mL LB培养基中(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养后，取培养物PCR反应筛选阳性克隆。

20uL PCR体系为：Pre mix taq 10uL，上游引物1uL，下游引物1uL，模板1uL，水7uL，PCR条件：94℃预热5min；94℃、30s，62℃、30s，72℃、30s，共35个循环；72℃延伸5min。

3、将步骤2中鉴定正确的阳性菌株进行过夜培养。

按照1％的接菌量将过夜培养液接种于4mL LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600约为0.6，加入1.0mM IPTG，18℃，220rpm诱导10h。12000rpm，离心15min，收集菌体。

将菌体重悬与适量PBS中超声破碎细胞，4℃，12000rpm离心15min，分别收集细胞破碎后上清液和沉淀。

4、将步骤3收集细胞破碎后上清液和沉淀进行SDS-PAGE和Western Blot检测，结果表明，融合蛋白成功在大肠杆菌中表达且主要以包涵体形式存在。

Western Blot：分别将重组菌株未经IPTG诱导和经IPTG诱导的产物进行SDS-PAGE检测后，200mA，湿电转膜2h；5％脱脂奶粉封闭；加入1:1000比例稀释的His抗体，4℃过夜孵育；TBST洗涤3次，每次5min；加入1:1000比例稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1h；TBST洗涤4次，每次5min；BeyoECL Star kit显色。

5、将步骤4所得沉淀进行包涵体纯化和复性处理，获得具有活性的融合蛋白。

包涵体变性处理：将步骤4所得沉淀充分溶解于Binding Buffer(Tris-HCl(pH7.9)20mM、咪唑5mM、NaCl 0.5M、尿素8M)中。

Ni²⁺亲和层析纯化：离心后以10倍柱体积/小时流速上样，收集流穿液。使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白，使用适量Elution Buffer(Tris-HCl(pH7.9)20mM、咪唑500mM、NaCl 0.5M、尿素8M)洗脱，收集洗脱峰，将纯化后的蛋白经透析脱盐。

包涵体复性：TGE透析复性(复性液：Tris 50mM，EDTA 0.5mM，NaCl 50mM，10％甘油，1％甘氨酸，pH 7.9，4～8h换一次透析液，透析24h)。

6、对步骤5所得融合蛋白中加入EK酶，25℃过夜酶切，用截留分子量为10kDa超滤管进行超滤浓缩，所得产物即为杂合抗菌肽MLH。

7、将步骤6所得杂合抗菌肽MLH采用琼脂孔穴扩散法进行抑菌活性验证。

请参阅图2和图3，杂合抗菌肽MLH对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

核苷酸序列表

<110> 陕西科技大学

<120>一种杂合抗菌肽MLH的制备方法

<160> 2

<210> 1

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln His Thr Arg Lys Arg

1 5 10 15 20

Ile Val Gln Arg Ile Lys Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys

25 30 35 40

Ile Gln Asn

43

<210> 2

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggttggctga aaaaaatcgg taaaaaaatc gaacgtgttg gtcagcacac ccgtaaacgt 60

atcgttcagc gtatcaaagc taaaaaagtt ttcaaacgtc tggaaaaact gttctctaaa 120

atccagaac 129

Claims

1.一种杂合抗菌肽MLH的制备方法，其特征在于，以家蝇抗菌肽、LL-37和幽门螺杆菌肽为母体肽，通过合成MLH基因并克隆至质粒形成重组质粒pET-32a-MLH；然后转化感受态E.coli BL21（DE3），构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH / BL21（DE3）；经过IPTG强诱导剂诱导菌体表达，获得融合蛋白；对融合蛋白的分离纯化及复性；最后经EK酶切获得杂合抗菌肽MLH，所述杂合抗菌肽MLH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述杂合抗菌肽MLH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，包括以下步骤：

S2、将步骤S1构建的重组质粒pET-32a-MLH转化至感受态E.coli BL21(DE3)中，构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21（DE3）；

S5、将步骤S4所得沉淀进行包涵体纯化和复性处理，得到包含目的蛋白的融合蛋白，具体为：

将步骤S4所得沉淀充分溶解于Binding Buffer，Binding Buffer：pH7.9的Tris-HCl20mM、咪唑5mM、NaCl 0.5M、尿素8M；

进行Ni²⁺离子亲和层析纯化：离心后以10倍柱体积/小时流速上样，收集流穿液；

使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白，使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰，将纯化后的蛋白经透析脱盐，Elution Buffer：Tris-HCl pH7.9 20mM、咪唑500mM、NaCl 0.5M、尿素8M；

包涵体复性：TGE透析复性，TGE透析复性液为Tris 50mM，EDTA 0.5mM，NaCl 50mM，10%甘油，1%甘氨酸，pH 7.9，4~8h换一次透析液，透析24h；

S6、将步骤S5所得融合蛋白加入EK酶，25℃过夜酶切，用截留分子量为10 kDa超滤管进行超滤浓缩，得到杂合抗菌肽MLH。

2.根据权利要求1所述的一种杂合抗菌肽MLH的制备方法，其特征在于，步骤S1中重组质粒pET-32a-MLH质粒表达含有His标签融合的MLH。

3.根据权利要求1所述的一种杂合抗菌肽MLH的制备方法，其特征在于，步骤S2中，将构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH / BL21（DE3）经过氨苄青霉素抗性平板筛选阳性菌株。

4.根据权利要求1所述的一种杂合抗菌肽MLH的制备方法，其特征在于，步骤S3中，按照1%的接种量将菌体培养至OD600达到0.6，加入1.0 mM IPTG、16℃、220 rpm，诱导10 h，收集菌体。

5.根据权利要求1所述的一种杂合抗菌肽MLH的制备方法，其特征在于，对步骤S4的上清液和沉淀进行SDS-PAGE和Western Blot检测，目的蛋白主要以包涵体形式存在，其中，所述Western Blot检测具体为：

分别将重组菌株未经IPTG诱导和经IPTG诱导的产物进行SDS-PAGE检测后，200 mA，湿电转膜2 h；5%脱脂奶粉封闭；加入1:1000比例稀释的His抗体，4 ℃过夜孵育；TBST洗涤3次，每次5 min；加入1:1000比例稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1 h；TBST洗涤4次，每次5 min；BeyoECL Star kit显色。