JP3362050B2 - 抗微生物ペプチドを大量生産するための方法 - Google Patents
抗微生物ペプチドを大量生産するための方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、抗微生物ペプチドの大量生産のための方法
に、より詳しくは遺伝子操作により外来ペプチドとの融
合タンパク質の形態における抗微生物ペプチドを生産す
ることによる抗微生物ペプチドを大量生産するための方
法に関する。
に、より詳しくは遺伝子操作により外来ペプチドとの融
合タンパク質の形態における抗微生物ペプチドを生産す
ることによる抗微生物ペプチドを大量生産するための方
法に関する。
先行技術の記載
一般に、抗微生物ペプチドは、熱、アルカリ等のよう
な物理的及び化学的因子により容易にそれらの生物活性
を失わない。更に、それらは、直ちに微生物に対する耐
性を誘導せず、それらは慣用的な抗生物質から明確に識
別される特徴的な作用機構による抗微生物活性を示す。
これにより、抗微生物ペプチドは、薬学、食品等の分野
において高い工業上利用性を有している。
な物理的及び化学的因子により容易にそれらの生物活性
を失わない。更に、それらは、直ちに微生物に対する耐
性を誘導せず、それらは慣用的な抗生物質から明確に識
別される特徴的な作用機構による抗微生物活性を示す。
これにより、抗微生物ペプチドは、薬学、食品等の分野
において高い工業上利用性を有している。
しかしながら、慣用技術は低い価格での抗微生物ペプ
チドの大量生産をすることができないので、そのペプチ
ドの工業的な適用に重大な問題がある。例えば、化学合
成は、経済的に抗微生物ペプチドを大量生産することが
できない。これに関して、組換え微生物を用いる遺伝子
操作技術がかわりの手段として当該技術において示唆さ
れている。しかしながら、それは、その発現された抗微
生物ペプチドが組換え微生物の増殖を阻害するので、生
産性が低いという欠点も示す。
チドの大量生産をすることができないので、そのペプチ
ドの工業的な適用に重大な問題がある。例えば、化学合
成は、経済的に抗微生物ペプチドを大量生産することが
できない。これに関して、組換え微生物を用いる遺伝子
操作技術がかわりの手段として当該技術において示唆さ
れている。しかしながら、それは、その発現された抗微
生物ペプチドが組換え微生物の増殖を阻害するので、生
産性が低いという欠点も示す。
USP 5,205,154は、セクロピン（cecropin）の抗微生
物活性を示す担体ポリペプチドの遺伝子及びセクロピン
の遺伝子を含む遺伝子構成物を開示する。ここで、araB
が担体ポリペプチドとして用いられるが、担体ポリペプ
チドの性質は重大でない。
物活性を示す担体ポリペプチドの遺伝子及びセクロピン
の遺伝子を含む遺伝子構成物を開示する。ここで、araB
が担体ポリペプチドとして用いられるが、担体ポリペプ
チドの性質は重大でない。
USP 5,593,866は、細菌のタンパク質分解を阻害する
ために負に荷電したペプチドとの融合タンパク質として
の正に荷電した抗微生物ペプチドを調製するための方法
を教授する。ここで、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのIgG結合ドメイ
ン、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeru
ginosa）からのプロテインＦ又はプレプロデフェンシン
（defensin）が負に荷電したペプチドとして用いられ
る。
ために負に荷電したペプチドとの融合タンパク質として
の正に荷電した抗微生物ペプチドを調製するための方法
を教授する。ここで、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのIgG結合ドメイ
ン、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeru
ginosa）からのプロテインＦ又はプレプロデフェンシン
（defensin）が負に荷電したペプチドとして用いられ
る。
従って、経済的に抗微生物ペプチドを大量生産するた
めのかわりの手段を探究及び開発するための強い理由が
ある。
めのかわりの手段を探究及び開発するための強い理由が
ある。
発明の概要
本発明らは、抗微生物ペプチドを製造する過程におけ
る低い生産性及び貧しい経済性の欠点を解決するための
努力を行い、組換えDNA技術により大量にかつ経済的に
抗微生物ペプチドを調製するのに成功した。
る低い生産性及び貧しい経済性の欠点を解決するための
努力を行い、組換えDNA技術により大量にかつ経済的に
抗微生物ペプチドを調製するのに成功した。
本発明の主な目的は、抗微生物ペプチドの大量生産を
許容する発現系を用いる組換え微生物において抗微生物
ペプチドを大量生産するための方法を提供することであ
る。
許容する発現系を用いる組換え微生物において抗微生物
ペプチドを大量生産するための方法を提供することであ
る。
図面の簡単な記載
本発明の先の及び他の目的並びに特徴は、添付の図面
と合わせて以下の説明から明らかになるであろう： 図１（Ａ）は、グアメリン（Guamerin）遺伝子のヌク
レオチド配列（配列番号:1）及びそれから翻訳されたア
ミノ酸配列（配列番号:2）を示す。
と合わせて以下の説明から明らかになるであろう： 図１（Ａ）は、グアメリン（Guamerin）遺伝子のヌク
レオチド配列（配列番号:1）及びそれから翻訳されたア
ミノ酸配列（配列番号:2）を示す。
図１（Ｂ）は、MMIS（改変されたマガイニン（Magain
in）介在セグメント）のヌクレオチド配列（配列番号:
3）及びそれから翻訳されたアミノ酸配列を示す。
in）介在セグメント）のヌクレオチド配列（配列番号:
3）及びそれから翻訳されたアミノ酸配列を示す。
図２（Ａ）は、PCRによるブホリン（Buforin）II遺伝
子とのグアメリン遺伝子の融合産物（配列番号:5）の作
製ストラテジーを示す概略図である。
子とのグアメリン遺伝子の融合産物（配列番号:5）の作
製ストラテジーを示す概略図である。
図２（Ｂ）は、PCRによるブホリンII遺伝子とのMMIS
遺伝子の融合産物（配列番号:6）を示す概略図である。
遺伝子の融合産物（配列番号:6）を示す概略図である。
図３は、遺伝子増幅ベクターを用いる多重結合融合遺
伝子の作製ストラテジーを示す概略図である。
伝子の作製ストラテジーを示す概略図である。
図４（Ａ）は、抗微生物ペプチドMSI−78の遺伝子及
びグアメリンの遺伝子を含む融合遺伝子（遺伝子Ｉ）
（配列番号:7）の作製ストラテジーを示す概略図であ
る。
びグアメリンの遺伝子を含む融合遺伝子（遺伝子Ｉ）
（配列番号:7）の作製ストラテジーを示す概略図であ
る。
図４（Ｂ）は、抗微生物ペプチドMSI−78の遺伝子及
びグアメリンの遺伝子を含む融合遺伝子（遺伝子II）
（配列番号:8）の作製ストラテジーを示す概略図であ
る。
びグアメリンの遺伝子を含む融合遺伝子（遺伝子II）
（配列番号:8）の作製ストラテジーを示す概略図であ
る。
図５（Ａ）は、タンパク質発現の誘導の後の、グアメ
リン又はMMISを含む多重結合融合遺伝子を含むベクター
形質転換された大腸菌の細胞ライゼートのSDS−PAGEパ
ターンである。
リン又はMMISを含む多重結合融合遺伝子を含むベクター
形質転換された大腸菌の細胞ライゼートのSDS−PAGEパ
ターンである。
図５（Ｂ）は、タンパク質発現の誘導の後の、プレプ
ロマガイニン遺伝子を含むベクターで形質転換された大
腸菌の細胞ライゼートのSDS−PAGEパターンである。
ロマガイニン遺伝子を含むベクターで形質転換された大
腸菌の細胞ライゼートのSDS−PAGEパターンである。
図６は、タンパク質発現の誘導の後の、グアメリン遺
伝子及び種々の抗微生物ペプチドの遺伝子を含む融合遺
伝子を含むベクターで形質転換された大腸菌の細胞ライ
ゼートのSDS−PAGEパターンである。
伝子及び種々の抗微生物ペプチドの遺伝子を含む融合遺
伝子を含むベクターで形質転換された大腸菌の細胞ライ
ゼートのSDS−PAGEパターンである。
図７は、タンパク質発現の誘導の後のグアメリン遺伝
子及び種々の抗微生物ペプチドの遺伝子を含む融合遺伝
子を含むベクターで形質転換された大腸菌の細胞ライゼ
ートのSDS−PAGEパターンである。
子及び種々の抗微生物ペプチドの遺伝子を含む融合遺伝
子を含むベクターで形質転換された大腸菌の細胞ライゼ
ートのSDS−PAGEパターンである。
発明の詳細な記載
本発明の抗微生物ペプチドを大量生産するための方法
は、少くとも２のシステイン残基を有する酸性ペプチド
をコードする第１の遺伝子及び塩基性抗微生物ペプチド
をコードする第２の遺伝子を含む融合遺伝子を作製し；
該融合遺伝子を含む発現ベクターで宿主微生物を形質転
換し；該形質転換された微生物を培養して前記酸ペプチ
ド及び抗微生物ペプチドを含む融合ペプチドを発現さ
せ；そして該融合ペプチドから前記抗微生物ペプチドを
回収するステップを含む。
は、少くとも２のシステイン残基を有する酸性ペプチド
をコードする第１の遺伝子及び塩基性抗微生物ペプチド
をコードする第２の遺伝子を含む融合遺伝子を作製し；
該融合遺伝子を含む発現ベクターで宿主微生物を形質転
換し；該形質転換された微生物を培養して前記酸ペプチ
ド及び抗微生物ペプチドを含む融合ペプチドを発現さ
せ；そして該融合ペプチドから前記抗微生物ペプチドを
回収するステップを含む。
本発明を行うことにおいて、少くとも２のシステイン
残基を有する酸性ペプチドをコードする第１の遺伝子及
び塩基性ペプチドをコードする第２の遺伝子を含む遺伝
子構成物、並びに少くとも２のシステイン残基を有する
酸性ペプチドをコードする第１の遺伝子及び塩基性抗微
生物ペプチドをコードする第２の遺伝子を含む遺伝子配
列に作用可能に連結したプロモーターを含む発現ベクタ
ーが本質的に必要とされ、そしてその融合遺伝子は単量
体又は多量体の形態で存在し得る。
残基を有する酸性ペプチドをコードする第１の遺伝子及
び塩基性ペプチドをコードする第２の遺伝子を含む遺伝
子構成物、並びに少くとも２のシステイン残基を有する
酸性ペプチドをコードする第１の遺伝子及び塩基性抗微
生物ペプチドをコードする第２の遺伝子を含む遺伝子配
列に作用可能に連結したプロモーターを含む発現ベクタ
ーが本質的に必要とされ、そしてその融合遺伝子は単量
体又は多量体の形態で存在し得る。
USP 5,593,866の結果と反対に、本発明者らは、一般
的な酸性ペプチド遺伝子は塩基性抗微生物ペプチドの有
効な発現を許容しないこと、及び該酸性ペプチド内の少
くとも２のシステイン残基の存在は前記問題を有効に解
決し得ることを発見した。
的な酸性ペプチド遺伝子は塩基性抗微生物ペプチドの有
効な発現を許容しないこと、及び該酸性ペプチド内の少
くとも２のシステイン残基の存在は前記問題を有効に解
決し得ることを発見した。
本発明の遺伝子構成物において、第１の遺伝子は少く
とも２のシステイン残基を有し、実質的に抗微生物ペプ
チドの正電荷を中和する酸性ペプチドをコードする。そ
の酸性ペプチドの長さは限られないが、好ましくは、正
電荷の長さ及び分布を考慮する場合に要求される抗微生
物ペプチドの電荷を有効に中和するために、前記抗微生
物ペプチドの長さと等しいかそれより長い。更に、その
酸性ペプチドは２又はそれ超のシステイン残基を有す
る。システイン残基はジスルフィド結合を介する二次構
造の形成により、酸性ペプチドの負電荷と抗微生物ペプ
チドの正電荷との間の相互作用を促進することが仮定さ
れる。
とも２のシステイン残基を有し、実質的に抗微生物ペプ
チドの正電荷を中和する酸性ペプチドをコードする。そ
の酸性ペプチドの長さは限られないが、好ましくは、正
電荷の長さ及び分布を考慮する場合に要求される抗微生
物ペプチドの電荷を有効に中和するために、前記抗微生
物ペプチドの長さと等しいかそれより長い。更に、その
酸性ペプチドは２又はそれ超のシステイン残基を有す
る。システイン残基はジスルフィド結合を介する二次構
造の形成により、酸性ペプチドの負電荷と抗微生物ペプ
チドの正電荷との間の相互作用を促進することが仮定さ
れる。
本発明によれば、酸性ペプチドは、人工的に合成され
ても天然の酸性ペプチドの中から選択されてもよく、そ
のペプチドをコードする合成遺伝子を用いて得ても天然
のものから単離してもよい。人工的にデザインした酸性
ペプチドは、２又はそれ超のシステイン残基を有し、天
然の酸性ペプチドは十分なシステイン残基を有するよう
に改変することができる。また、酸性ペプチド遺伝子
は、抗微生物ペプチドをコードする第２の遺伝子との容
易な融合、該融合ペプチドからの抗微生物ペプチドの容
易な単離、又は融合遺伝子の種々の多量体形態の調製の
目的のための種々の方法において改変することができ
る。
ても天然の酸性ペプチドの中から選択されてもよく、そ
のペプチドをコードする合成遺伝子を用いて得ても天然
のものから単離してもよい。人工的にデザインした酸性
ペプチドは、２又はそれ超のシステイン残基を有し、天
然の酸性ペプチドは十分なシステイン残基を有するよう
に改変することができる。また、酸性ペプチド遺伝子
は、抗微生物ペプチドをコードする第２の遺伝子との容
易な融合、該融合ペプチドからの抗微生物ペプチドの容
易な単離、又は融合遺伝子の種々の多量体形態の調製の
目的のための種々の方法において改変することができ
る。
例えば、酸性ペプチド遺伝子は、要求される抗微生物
ペプチドを生ずる正確な読み枠を有するように抗微生物
ペプチドに連結することができるように合成され又は改
変され得る。また、酸性ペプチド遺伝子は、発現された
融合ペプチドから抗微生物ペプチドを単離するために、
特定のプロテアーゼ又は化学物質のための開裂部位をコ
ードするヌクレオチド配列に合成され又は改変され得
る。
ペプチドを生ずる正確な読み枠を有するように抗微生物
ペプチドに連結することができるように合成され又は改
変され得る。また、酸性ペプチド遺伝子は、発現された
融合ペプチドから抗微生物ペプチドを単離するために、
特定のプロテアーゼ又は化学物質のための開裂部位をコ
ードするヌクレオチド配列に合成され又は改変され得
る。
酸性ペプチド遺伝子は、酸性ペプチド遺伝子の単量体
又は多量体の中から、抗微生物ペプチドの中和のために
最も適した長さを有するように選択することができる。
酸性ペプチド遺伝子の多量体は、遺伝子増幅技術を用い
ることにより調製することができる。例えば、酸性ペプ
チド遺伝子の多量体を含むベクターは、酸性ペプチド遺
伝子を、２つの反対方向を向いたクラスII S制限酵素部
位を含むベクターの２つのクラスII S制限酵素部位の間
に挿入し、そのベクターをクラスII S制限酵素で消化
し、その酸性ペプチド遺伝子を含むDNAフラグメントを
単離し、その単離したDNAフラグメントを自己連結させ
て多量体を調製し、そしてその種々の多量体を、クラス
II S制限酵素で消化したベクター内にクローニングする
ことによって調製することができる（Lee,J.H.ら、Gene
tic Analysis:Biomolecular Engineering,13:139−145
（1996）を参照のこと）。
又は多量体の中から、抗微生物ペプチドの中和のために
最も適した長さを有するように選択することができる。
酸性ペプチド遺伝子の多量体は、遺伝子増幅技術を用い
ることにより調製することができる。例えば、酸性ペプ
チド遺伝子の多量体を含むベクターは、酸性ペプチド遺
伝子を、２つの反対方向を向いたクラスII S制限酵素部
位を含むベクターの２つのクラスII S制限酵素部位の間
に挿入し、そのベクターをクラスII S制限酵素で消化
し、その酸性ペプチド遺伝子を含むDNAフラグメントを
単離し、その単離したDNAフラグメントを自己連結させ
て多量体を調製し、そしてその種々の多量体を、クラス
II S制限酵素で消化したベクター内にクローニングする
ことによって調製することができる（Lee,J.H.ら、Gene
tic Analysis:Biomolecular Engineering,13:139−145
（1996）を参照のこと）。
本発明によれば、抗微生物ペプチドは、人工的にデザ
インしても天然の酸性ペプチドの中から選択してもよ
く、要求されるペプチドをコードする合成遺伝子を用い
て得ても天然物から単離してもよい。抗微生物ペプチド
遺伝子は、酸性ペプチド遺伝子との容易な融合、融合ペ
プチドからの抗微生物ペプチドの容易な単離、又は融合
遺伝子の種々の多量体形態の調製の目的のための種々の
方法において改変することができる。
インしても天然の酸性ペプチドの中から選択してもよ
く、要求されるペプチドをコードする合成遺伝子を用い
て得ても天然物から単離してもよい。抗微生物ペプチド
遺伝子は、酸性ペプチド遺伝子との容易な融合、融合ペ
プチドからの抗微生物ペプチドの容易な単離、又は融合
遺伝子の種々の多量体形態の調製の目的のための種々の
方法において改変することができる。
例えば、抗微生物ペプチド遺伝子は、抗微生物ペプチ
ドのＣ末端領域が正確な読み枠において酸性ペプチドの
Ｎ末端領域に連結され得るように改変することができる
（抗微生物ペプチド遺伝子Ｉ）。
ドのＣ末端領域が正確な読み枠において酸性ペプチドの
Ｎ末端領域に連結され得るように改変することができる
（抗微生物ペプチド遺伝子Ｉ）。
また、抗微生物ペプチド遺伝子は、発現された融合ペ
プチドからの抗微生物ペプチド、及び抗微生物ペプチド
のＣ末端におけるペプチド合成の終了を許容するヌクレ
オチド配列を単離するために、Ｎ末端において特定のプ
ロテアーゼ又は化学物質により開裂される部位をコード
するヌクレオチド配列を含むように改変することができ
る（抗微生物ペプチド遺伝子II）。
プチドからの抗微生物ペプチド、及び抗微生物ペプチド
のＣ末端におけるペプチド合成の終了を許容するヌクレ
オチド配列を単離するために、Ｎ末端において特定のプ
ロテアーゼ又は化学物質により開裂される部位をコード
するヌクレオチド配列を含むように改変することができ
る（抗微生物ペプチド遺伝子II）。
更に、抗微生物ペプチド遺伝子は、発現された融合ペ
プチドからの抗微生物ペプチドを単離するために、抗微
生物ペプチドのＮ末端及びＣ末端において特定のプロテ
アーゼ又は化学物質のための開裂部位をコードするヌク
レオチド配列（例えばCNBrによる開裂のためのメチオニ
ン残基をコードするコドン）を含むように改変すること
ができる（抗微生物ペプチド遺伝子III）。
プチドからの抗微生物ペプチドを単離するために、抗微
生物ペプチドのＮ末端及びＣ末端において特定のプロテ
アーゼ又は化学物質のための開裂部位をコードするヌク
レオチド配列（例えばCNBrによる開裂のためのメチオニ
ン残基をコードするコドン）を含むように改変すること
ができる（抗微生物ペプチド遺伝子III）。
融合遺伝子は、上述の通り調製された酸性ペプチド遺
伝子及び抗微生物ペプチド遺伝子を連結することにより
調製することができ、そして酸性ペプチド遺伝子又は抗
微生物ペプチド遺伝子は上述の通り単量体又は多量体で
あり得る。
伝子及び抗微生物ペプチド遺伝子を連結することにより
調製することができ、そして酸性ペプチド遺伝子又は抗
微生物ペプチド遺伝子は上述の通り単量体又は多量体で
あり得る。
本発明によれば、融合遺伝子は、酸性ペプチドをコー
ドする第１の遺伝子及び抗微生物ペプチド遺伝子をコー
ドする第２の遺伝子を含み、これらは、その２つの遺伝
子が正確な読み枠内で接続するなら、直接的に又はリン
カーを通して間接的に連結することができる。
ドする第１の遺伝子及び抗微生物ペプチド遺伝子をコー
ドする第２の遺伝子を含み、これらは、その２つの遺伝
子が正確な読み枠内で接続するなら、直接的に又はリン
カーを通して間接的に連結することができる。
本発明の好ましい実施形態において、融合遺伝子は、
酸性ペプチド遺伝子及び抗微生物ペプチド遺伝子を、各
々の遺伝子の一本鎖の３′末端において相補的なヌクレ
オチド配列を有するように改変し、２つの遺伝子を部分
的なハイブリダイゼーションを通してアニーリングし、
そしてテンプレートとしてハイブリダイズした遺伝子、
及び各々の一本鎖遺伝子の５′末端に対する配列に対応
するプライマーを用いてPCRを行うことにより調製する
ことができる。
酸性ペプチド遺伝子及び抗微生物ペプチド遺伝子を、各
々の遺伝子の一本鎖の３′末端において相補的なヌクレ
オチド配列を有するように改変し、２つの遺伝子を部分
的なハイブリダイゼーションを通してアニーリングし、
そしてテンプレートとしてハイブリダイズした遺伝子、
及び各々の一本鎖遺伝子の５′末端に対する配列に対応
するプライマーを用いてPCRを行うことにより調製する
ことができる。
これにより調製された種々の数の融合遺伝子のモノマ
ーは、当該技術で慣用的な方法；例えば融合遺伝子の自
己連結により融合遺伝子の種々の多量体を調製するため
に濃縮することができる。融合遺伝子の多量体は、遺伝
子増幅システムを用いることによっても調製することが
できる。例えば、融合遺伝子の多量体を含むベクター
は、その融合遺伝子を、２つの反対方向に向いたクラス
II S制限酵素部位を含むベクター２つのクラスII S制限
酵素部位の間に挿入し、そのベクターをクラスII S制限
酵素で消化し、その融合遺伝子を含むDNAフラグメント
を挿入し、単離されたDNAフラグメントを自己連結して
融合遺伝子の多量体を調製し、そしてその融合遺伝子の
多量体を、クラスII S制限酵素で消化したベクターにク
ローニングすることにより調製することができる。
ーは、当該技術で慣用的な方法；例えば融合遺伝子の自
己連結により融合遺伝子の種々の多量体を調製するため
に濃縮することができる。融合遺伝子の多量体は、遺伝
子増幅システムを用いることによっても調製することが
できる。例えば、融合遺伝子の多量体を含むベクター
は、その融合遺伝子を、２つの反対方向に向いたクラス
II S制限酵素部位を含むベクター２つのクラスII S制限
酵素部位の間に挿入し、そのベクターをクラスII S制限
酵素で消化し、その融合遺伝子を含むDNAフラグメント
を挿入し、単離されたDNAフラグメントを自己連結して
融合遺伝子の多量体を調製し、そしてその融合遺伝子の
多量体を、クラスII S制限酵素で消化したベクターにク
ローニングすることにより調製することができる。
本発明の好ましい実施形態において、融合遺伝子の多
量体は、抗微生物ペプチド遺伝子IIIを含む融合遺伝子
の多量体である。
量体は、抗微生物ペプチド遺伝子IIIを含む融合遺伝子
の多量体である。
本発明の好ましい実施形態において、融合遺伝子の多
量体は、抗微生物ペプチド遺伝子IIを含む融合遺伝子
が、抗微生物ペプチド遺伝子Ｉを含む融合遺伝子の単量
体又は多量体の３′末端に連結している多量体である。
量体は、抗微生物ペプチド遺伝子IIを含む融合遺伝子
が、抗微生物ペプチド遺伝子Ｉを含む融合遺伝子の単量
体又は多量体の３′末端に連結している多量体である。
本発明の好ましい実施形態において、融合遺伝子の多
量体は、抗微生物ペプチド遺伝子IIを含む融合遺伝子
が、抗微生物ペプチド遺伝子IIIを含む融合遺伝子の単
量体又は多量体の３′末端に連結している多量体であ
る。
量体は、抗微生物ペプチド遺伝子IIを含む融合遺伝子
が、抗微生物ペプチド遺伝子IIIを含む融合遺伝子の単
量体又は多量体の３′末端に連結している多量体であ
る。
融合遺伝子の多量体は、融合ペプチドの多量体を発現
させるために、適切な発現ベクターにクローニングし、
微生物、例えば大腸菌内で発現させることができる。融
合ペプチドの多量体は、酸性ペプチドを除去し、抗微生
物ペプチドを単量体に分離するために、酵素又は化学物
質、例えばCNBrで処理され、抗微生物ペプチドは陽イオ
ン交換クロマトグラフィー等を用いて精製される。多量
体の発現の後に得られた融合ペプチドの多量体が酵素又
は化学物質、例えばCNBrで処理されるなら、多量体の端
に存在する抗微生物ペプチドは、ネイティブ形態のモノ
マーにおいて得ることができる。
させるために、適切な発現ベクターにクローニングし、
微生物、例えば大腸菌内で発現させることができる。融
合ペプチドの多量体は、酸性ペプチドを除去し、抗微生
物ペプチドを単量体に分離するために、酵素又は化学物
質、例えばCNBrで処理され、抗微生物ペプチドは陽イオ
ン交換クロマトグラフィー等を用いて精製される。多量
体の発現の後に得られた融合ペプチドの多量体が酵素又
は化学物質、例えばCNBrで処理されるなら、多量体の端
に存在する抗微生物ペプチドは、ネイティブ形態のモノ
マーにおいて得ることができる。
本発明は、以下の例に更に詳述されるが、本発明の範
囲を限定するものではない。特に、実施例に用いられる
抗微生物ペプチド、酸性ペプチド及びそれらの多量体の
遺伝子は本発明の好ましい実施形態であるだけであるの
で、本発明は、種々の塩基性抗微生物ペプチドの大量生
産の目的のために少くとも２つのシステイン残基を含む
酸性ペプチドを用いる本発明の全てをカバーする。
囲を限定するものではない。特に、実施例に用いられる
抗微生物ペプチド、酸性ペプチド及びそれらの多量体の
遺伝子は本発明の好ましい実施形態であるだけであるの
で、本発明は、種々の塩基性抗微生物ペプチドの大量生
産の目的のために少くとも２つのシステイン残基を含む
酸性ペプチドを用いる本発明の全てをカバーする。
実施例1:酸性ペプチドの選択
ネイティブグアメリン（以後、“G"で示す;Jung,H.I.
ら（1995）J.Biol.Chem.,270:13879−13884）及び多数
のシステイン残基を有する改変MIS（以後、“M"で示す;
Zasloff,M.（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84:5449
−5453）を酸性ペプチドとして用いた。図１（Ａ）及び
１（Ｂ）に見ることができるように（ここではセンス配
列のみを示す）、酸性ペプチドをコードする一本鎖オリ
ゴヌクレオチド（配列番号:1及び配列番号:3）を合成し
た。
ら（1995）J.Biol.Chem.,270:13879−13884）及び多数
のシステイン残基を有する改変MIS（以後、“M"で示す;
Zasloff,M.（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84:5449
−5453）を酸性ペプチドとして用いた。図１（Ａ）及び
１（Ｂ）に見ることができるように（ここではセンス配
列のみを示す）、酸性ペプチドをコードする一本鎖オリ
ゴヌクレオチド（配列番号:1及び配列番号:3）を合成し
た。
これにより合成したオリゴヌクレオチドを同じモル比
でTE緩衝液に溶かし、70℃で10分、加熱し、そして30
分、０℃で放置した。20％（w/v）ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動の後、２本鎖DNAフラグメントを単離し、B
bs Iで消化したpBBS1ベクター（Lee,J.Hら、Genetic An
alysis:Biomolecular Engineering,13:139−145（199
6）にクローニングし、pBBS1−Gl（グアメリン）又はpB
BS1−Ml（MIS）ベクターを作製した。酸性ペプチド遺伝
子の多量体（pBBSl−Gn）又はpBBS1−Mn,n＝1,2,3,…）
は、これにより作製されたpBBS1−Gl又はpBBS1−Mlベク
ターを用いて調製することができるので、抗微生物ペプ
チドを中和するために最も適した長さを有する酸性ペプ
チドを選択した。
でTE緩衝液に溶かし、70℃で10分、加熱し、そして30
分、０℃で放置した。20％（w/v）ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動の後、２本鎖DNAフラグメントを単離し、B
bs Iで消化したpBBS1ベクター（Lee,J.Hら、Genetic An
alysis:Biomolecular Engineering,13:139−145（199
6）にクローニングし、pBBS1−Gl（グアメリン）又はpB
BS1−Ml（MIS）ベクターを作製した。酸性ペプチド遺伝
子の多量体（pBBSl−Gn）又はpBBS1−Mn,n＝1,2,3,…）
は、これにより作製されたpBBS1−Gl又はpBBS1−Mlベク
ターを用いて調製することができるので、抗微生物ペプ
チドを中和するために最も適した長さを有する酸性ペプ
チドを選択した。
実施例2:抗微生物ペプチド遺伝子の調製
融合ペプチドの多量体形態において抗微生物ペプチド
を発現し、それをCNBrで処理することにより抗微生物ペ
プチドを調製するために、メチオニンコドンを、抗微生
物ペプチドであるブホリンII（TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK
（配列番号:9））の両端に導入した（Park,C.B.ら，（1
996）Biochem.Biophys.Rse.Comm.,218,408−413）。
を発現し、それをCNBrで処理することにより抗微生物ペ
プチドを調製するために、メチオニンコドンを、抗微生
物ペプチドであるブホリンII（TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK
（配列番号:9））の両端に導入した（Park,C.B.ら，（1
996）Biochem.Biophys.Rse.Comm.,218,408−413）。
ブホリンII（以後、“B"と呼ぶ）をコードするDNA配
列を合成し、Bbs Iで消化したpBBS1ベクターにクローン
化してpBBS1−B1ベクターを作製した。生じたpBBS1−B1
ベクターは完全なブホリンII遺伝子及びそのブホリンII
遺伝子の両端に２つのメチオニンコドンを含む。
列を合成し、Bbs Iで消化したpBBS1ベクターにクローン
化してpBBS1−B1ベクターを作製した。生じたpBBS1−B1
ベクターは完全なブホリンII遺伝子及びそのブホリンII
遺伝子の両端に２つのメチオニンコドンを含む。
実施例3:酸性ペプチド遺伝子及び抗微生物ペプチド遺伝
子を含む融合遺伝子の調製 実施例１及び２で得られた酸性ペプチド遺伝子及び抗
微生物ペプチド遺伝子を含む融合遺伝子を、以下の通り
行った（図２（Ａ）及び２（Ｂ）を参照のこと）：酸性
ペプチド（即ちグアメリン）遺伝子の５′端及び３′端
に対応する一対のプライマー（プライマー1:5′−AAAGA
AGACGGCCCCCGGTCGACGAGAATGCG−３′（配列番号:10）及
びプライマー2:5′−GCTGCTACGGGTCATGATCCCCGCGCAGGT
−３′（配列番号11））各々を用いて、グアメリン遺伝
子をPCR技術により増幅した。他方、抗微生物ペプチド
（ブホリンII））プライマー3:5′−ACCTGCGCGGGGATCAT
GACCCGTAGCAGC−３′（配列番号:12）及びプライマー4:
5′−TGCATGCCTGCAGGTCGA−３′（配列番号:13）各々を
用いて、ブホリンII遺伝子をPCRにより増幅した。
子を含む融合遺伝子の調製 実施例１及び２で得られた酸性ペプチド遺伝子及び抗
微生物ペプチド遺伝子を含む融合遺伝子を、以下の通り
行った（図２（Ａ）及び２（Ｂ）を参照のこと）：酸性
ペプチド（即ちグアメリン）遺伝子の５′端及び３′端
に対応する一対のプライマー（プライマー1:5′−AAAGA
AGACGGCCCCCGGTCGACGAGAATGCG−３′（配列番号:10）及
びプライマー2:5′−GCTGCTACGGGTCATGATCCCCGCGCAGGT
−３′（配列番号11））各々を用いて、グアメリン遺伝
子をPCR技術により増幅した。他方、抗微生物ペプチド
（ブホリンII））プライマー3:5′−ACCTGCGCGGGGATCAT
GACCCGTAGCAGC−３′（配列番号:12）及びプライマー4:
5′−TGCATGCCTGCAGGTCGA−３′（配列番号:13）各々を
用いて、ブホリンII遺伝子をPCRにより増幅した。
これにより増幅したPCR産物を同じモル比で混合し、
再びプライマー１（配列番号:10）及びプライマー４
（配列番号:13）を用いてPCRにより増幅した。これによ
り得られたPCR産物をBbs Iで消化した。次に、グアメリ
ン遺伝子及びブホリンII遺伝子を含む融合遺伝子のフラ
グメントを単離し、Bbs Iで消化したpBBS1ベクターにク
ローン化してpBBS1−（GB）１ベクターを作製した（図
２（Ａ）を参照のこと）。
再びプライマー１（配列番号:10）及びプライマー４
（配列番号:13）を用いてPCRにより増幅した。これによ
り得られたPCR産物をBbs Iで消化した。次に、グアメリ
ン遺伝子及びブホリンII遺伝子を含む融合遺伝子のフラ
グメントを単離し、Bbs Iで消化したpBBS1ベクターにク
ローン化してpBBS1−（GB）１ベクターを作製した（図
２（Ａ）を参照のこと）。
そして次に、遺伝子増幅システムを用いて融合遺伝子
の多量体を調製するために、pBBS1−（GB）１ベクター
をBbs Iで消化し、その融合遺伝子を含むフラグメント
を単離した。その単離したDNAフラグメントを自己連結
して多量体を調製し、そして種々の多量体をBbs Iで消
化したpBBS1ベクターにクローニングして、pBBS1−（G
B）ｎ（ｎ＝1,2,3,4,…）で示す融合遺伝子の多量体を
含むベクターを作製した（図３を参照のこと）。
の多量体を調製するために、pBBS1−（GB）１ベクター
をBbs Iで消化し、その融合遺伝子を含むフラグメント
を単離した。その単離したDNAフラグメントを自己連結
して多量体を調製し、そして種々の多量体をBbs Iで消
化したpBBS1ベクターにクローニングして、pBBS1−（G
B）ｎ（ｎ＝1,2,3,4,…）で示す融合遺伝子の多量体を
含むベクターを作製した（図３を参照のこと）。
他方、pBBS1−（MB）１ベクター及び融合遺伝子pBBS1
−（MB）ｎ（ｎ＝1,2,3,4,…）の多量体を含むベクター
を、グアメリンのかわりに酸性ペプチドとして（Ｓ−Ｓ
結合を含む）MISを用いたことを除いて上述と同様に作
製した（図2Bを参照のこと）。
−（MB）ｎ（ｎ＝1,2,3,4,…）の多量体を含むベクター
を、グアメリンのかわりに酸性ペプチドとして（Ｓ−Ｓ
結合を含む）MISを用いたことを除いて上述と同様に作
製した（図2Bを参照のこと）。
実施例4:ネイティブ抗微生物ペプチド及びその多量体の
発現のための融合遺伝子の調製 実施例３で調製した融合遺伝子の多量体から得た抗微
生物ペプチドは、それらのＣ末端にホモセリン残基を有
する。ホモセリン残基を含まないネイティブ抗微生物ペ
プチドを調製するために、実施例３で調製した融合遺伝
子のものからその配列を少し改変した融合遺伝子及びそ
の多量体を次のように調製した：この目的のため、グア
メリンを酸性ペプチドとして用い、MSI−78（GIGKFLKKA
KKFGKAFVKILKK−NH2:配列番号:14）を抗微生物ペプチド
として各々用いた。
発現のための融合遺伝子の調製 実施例３で調製した融合遺伝子の多量体から得た抗微
生物ペプチドは、それらのＣ末端にホモセリン残基を有
する。ホモセリン残基を含まないネイティブ抗微生物ペ
プチドを調製するために、実施例３で調製した融合遺伝
子のものからその配列を少し改変した融合遺伝子及びそ
の多量体を次のように調製した：この目的のため、グア
メリンを酸性ペプチドとして用い、MSI−78（GIGKFLKKA
KKFGKAFVKILKK−NH2:配列番号:14）を抗微生物ペプチド
として各々用いた。
その目的に適した２種類の抗微生物ペプチド遺伝子
（以後、各々“B I"及び“B II"と呼ぶ）を調製し、こ
こで抗微生物ペプチド遺伝子Ｉは、この遺伝子によりコ
ードされるペプチドはＮ末端にメチオニン残基を有し得
ず、そのＣ末端は正確な読み枠内で続く酸性ペプチド遺
伝子に枠内で融合し得るように調製し、そして抗微生物
ペプチド遺伝子IIは、この遺伝子によりコードされるペ
プチドがＮ末端に１つのメチオニン残基を有し得そして
ペプチド合成がＣ末端で終了し得るように調製した。
（以後、各々“B I"及び“B II"と呼ぶ）を調製し、こ
こで抗微生物ペプチド遺伝子Ｉは、この遺伝子によりコ
ードされるペプチドはＮ末端にメチオニン残基を有し得
ず、そのＣ末端は正確な読み枠内で続く酸性ペプチド遺
伝子に枠内で融合し得るように調製し、そして抗微生物
ペプチド遺伝子IIは、この遺伝子によりコードされるペ
プチドがＮ末端に１つのメチオニン残基を有し得そして
ペプチド合成がＣ末端で終了し得るように調製した。
これにより調製した抗微生物ペプチド遺伝子Ｉ及びII
を、実施例３と同様に各々酸性ペプチド遺伝子に連結し
て融合遺伝子を調製し、そしてBbs Iで消化したpBBS1ベ
クターにローン化して各々pBBS1−（GB I）ｌ及びpBBS1
−（GB II）ｌベクターを作製した。GB I融合遺伝子の
多量体を遺伝子増幅システムを用いてpBBS1−（GB I）
１ベクターから調製し、そしてGB II融合遺伝子のモノ
マーをその多量体の端に連結してpBBS1−〔（GB I）ｎ
（GB II）〕（ｎ＝0,1,2,3,4,…）で示すベクターを作
製した。
を、実施例３と同様に各々酸性ペプチド遺伝子に連結し
て融合遺伝子を調製し、そしてBbs Iで消化したpBBS1ベ
クターにローン化して各々pBBS1−（GB I）ｌ及びpBBS1
−（GB II）ｌベクターを作製した。GB I融合遺伝子の
多量体を遺伝子増幅システムを用いてpBBS1−（GB I）
１ベクターから調製し、そしてGB II融合遺伝子のモノ
マーをその多量体の端に連結してpBBS1−〔（GB I）ｎ
（GB II）〕（ｎ＝0,1,2,3,4,…）で示すベクターを作
製した。
実施例5:抗微生物ペプチドの発現及び調製
大腸菌内で実施例３及び４で調製したベクター内のク
ローン化された融合遺伝子の多量体を発現するために、
その多量体を、BamH I/Hind IIIで消化した発現ベクタ
ーpET21c（Novagen,USA）にクローナングし、大腸菌BL2
1（DE3）内に形質転換して融合ペプチドの多量体を発現
した。多量体の発現の誘導の後、その培養した培地から
細胞を収集した。これにより得られたライゼートをSDS
−PAGEにより分析した（図５（Ａ）を参照のこと）。図
５（Ａ）において、レーンＭは分子量マーカーを示し、
レーン１は発現ベクターを含まない大腸菌の細胞ライゼ
ートを示し；そしてレーン２〜14は、各々pET21c,pET21
c−B1,pET21c−B2,pET21c−B4,pET21c−B6,pET21c−（G
B）1,pET21c−（GB）2,pET21c−（GB）4,pET21c−（G
B）6,pET21c−（MB）1,pET21c−（MB）2,pET21c−（M
B）４、及びpET21c−（MB）６で形質転換した大腸菌の
細胞ライゼートを示す。図５（Ａ）に示すように、多量
体の発現は、ブホリンII単独の多量体の発現と比べて著
しく増加したことを見い出した。発現ベクターを含む組
換え大腸菌の中で、最大発現を示す一つの組換え体を最
後に選択した。
ローン化された融合遺伝子の多量体を発現するために、
その多量体を、BamH I/Hind IIIで消化した発現ベクタ
ーpET21c（Novagen,USA）にクローナングし、大腸菌BL2
1（DE3）内に形質転換して融合ペプチドの多量体を発現
した。多量体の発現の誘導の後、その培養した培地から
細胞を収集した。これにより得られたライゼートをSDS
−PAGEにより分析した（図５（Ａ）を参照のこと）。図
５（Ａ）において、レーンＭは分子量マーカーを示し、
レーン１は発現ベクターを含まない大腸菌の細胞ライゼ
ートを示し；そしてレーン２〜14は、各々pET21c,pET21
c−B1,pET21c−B2,pET21c−B4,pET21c−B6,pET21c−（G
B）1,pET21c−（GB）2,pET21c−（GB）4,pET21c−（G
B）6,pET21c−（MB）1,pET21c−（MB）2,pET21c−（M
B）４、及びpET21c−（MB）６で形質転換した大腸菌の
細胞ライゼートを示す。図５（Ａ）に示すように、多量
体の発現は、ブホリンII単独の多量体の発現と比べて著
しく増加したことを見い出した。発現ベクターを含む組
換え大腸菌の中で、最大発現を示す一つの組換え体を最
後に選択した。
その発現を先の通り確認した融合ペプチドの多量体の
封入体を、1NのHCl及び6Mのグアニジウムクロライドを
含む溶液中に懸濁し、1MのCNBrで処理した。次に、その
ペプチドをSep−Pakを用いて逆相濃縮により収集し、正
電荷を有する抗微生物ペプチドをQAE−Sephadex（Sigma
Chemical Co.,USA）陰イオン交換クロマトグラフィー
により精製した。これにより単離した抗微生物ペプチド
を、逆相HPLCにより更に精製して純粋な組換え抗微生物
ペプチドを得た。精製した組換え抗微生物ペプチドの生
物活性の分析は、それがネイティブのものと同一の抗微
生物活性を有することを示した。
封入体を、1NのHCl及び6Mのグアニジウムクロライドを
含む溶液中に懸濁し、1MのCNBrで処理した。次に、その
ペプチドをSep−Pakを用いて逆相濃縮により収集し、正
電荷を有する抗微生物ペプチドをQAE−Sephadex（Sigma
Chemical Co.,USA）陰イオン交換クロマトグラフィー
により精製した。これにより単離した抗微生物ペプチド
を、逆相HPLCにより更に精製して純粋な組換え抗微生物
ペプチドを得た。精製した組換え抗微生物ペプチドの生
物活性の分析は、それがネイティブのものと同一の抗微
生物活性を有することを示した。
比較例1:
（MB）６に似た構造を有するがシステイン残基を含ま
ないプレプロマガイニン（配列番号:15）をpET21b（Nov
agen,USA）ベクター1:クローニングし大腸菌BL21（DE
3）に形質転換した。そのヌクレオチド配列及びそれか
ら翻訳されたアミノ酸配列は以下の通りである（ここ
で、下線の配列はマガイニン１又はマガイニン２であ
る）： 培養した形質転換体を収集し、溶解した。これにより
得られたライゼートを、SDS−PAGEにより分析した（図
５（Ｂ）を参照のこと）。図５（Ｂ）において、レーン
Ｍは分子量マーカー（97.4,66.2,45,31,21.5,14.4kd）
を示し；レーン１及び２は、IPTG誘導の前及び後にpET2
1bで形質転換した大腸菌の細胞ライゼートを示し；レー
ン３及び４は、IPTG誘導の前及び後のpET21b−（プレプ
ロマガイニン）で形質転換した大腸菌の細胞ライゼート
を示す。図５（Ｂ）に示すように、プレプロマガイニン
の発現は、システイン残基のないプレプロマガイニンを
同じ発現系を用いて発現させた場合、観察されなかっ
た。
ないプレプロマガイニン（配列番号:15）をpET21b（Nov
agen,USA）ベクター1:クローニングし大腸菌BL21（DE
3）に形質転換した。そのヌクレオチド配列及びそれか
ら翻訳されたアミノ酸配列は以下の通りである（ここ
で、下線の配列はマガイニン１又はマガイニン２であ
る）： 培養した形質転換体を収集し、溶解した。これにより
得られたライゼートを、SDS−PAGEにより分析した（図
５（Ｂ）を参照のこと）。図５（Ｂ）において、レーン
Ｍは分子量マーカー（97.4,66.2,45,31,21.5,14.4kd）
を示し；レーン１及び２は、IPTG誘導の前及び後にpET2
1bで形質転換した大腸菌の細胞ライゼートを示し；レー
ン３及び４は、IPTG誘導の前及び後のpET21b−（プレプ
ロマガイニン）で形質転換した大腸菌の細胞ライゼート
を示す。図５（Ｂ）に示すように、プレプロマガイニン
の発現は、システイン残基のないプレプロマガイニンを
同じ発現系を用いて発現させた場合、観察されなかっ
た。
比較例2:
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）配列
並びに酸性ペプチド遺伝子としてのHNP−Ｉ及び抗微生
物ペプチド遺伝子としてのPGQからのプレプロデフェン
シン配列で、融合遺伝子を作製した。
並びに酸性ペプチド遺伝子としてのHNP−Ｉ及び抗微生
物ペプチド遺伝子としてのPGQからのプレプロデフェン
シン配列で、融合遺伝子を作製した。
プレプロデフェンシン配列及びGST遺伝子を各々BspLV
11 I及びNco Iで処理し、Nco Iで消化したPGQ遺伝子に
連結した。CNBrでの更なる開裂のために酸性ペプチドと
抗微生物ペプチドとの間に１つのメチオニン残基を組み
込んだ。得られた融合遺伝子をpRSET（Invitrogen,US
A）にクローニングし、大腸菌HMS174（DE3）に形質転換
した。融合ペプチドの発現をSDS−PAGEにより分析した
（図６を参照のこと）。図６において、レーンＭは分子
量マーカー（97.4,66.2,45,31,21.5,14.4kd）を示し；
レーン１は大腸菌HMS174（DM3）の細胞ライゼートを示
し；レーン２及び３は、プレプロデフェンシン−PGQ及
びGST−PGQの融合遺伝子を有するベクターを有する大腸
菌の細胞ライゼートを示す。
11 I及びNco Iで処理し、Nco Iで消化したPGQ遺伝子に
連結した。CNBrでの更なる開裂のために酸性ペプチドと
抗微生物ペプチドとの間に１つのメチオニン残基を組み
込んだ。得られた融合遺伝子をpRSET（Invitrogen,US
A）にクローニングし、大腸菌HMS174（DE3）に形質転換
した。融合ペプチドの発現をSDS−PAGEにより分析した
（図６を参照のこと）。図６において、レーンＭは分子
量マーカー（97.4,66.2,45,31,21.5,14.4kd）を示し；
レーン１は大腸菌HMS174（DM3）の細胞ライゼートを示
し；レーン２及び３は、プレプロデフェンシン−PGQ及
びGST−PGQの融合遺伝子を有するベクターを有する大腸
菌の細胞ライゼートを示す。
上述の融合遺伝子を有するベクターを有する大腸菌細
胞の増殖は激しく阻害された。図６に示すように、融合
ペプチドの発現は、酸性ペプチドとしてプレプロデフェ
ンシンを用いては観察されなかったが、酸性ペプチドと
してGSTを用いた時には極めて低い発現が観察された。
胞の増殖は激しく阻害された。図６に示すように、融合
ペプチドの発現は、酸性ペプチドとしてプレプロデフェ
ンシンを用いては観察されなかったが、酸性ペプチドと
してGSTを用いた時には極めて低い発現が観察された。
実施例6:酸性ペプチド遺伝子としてグアメリン遺伝子を
含む融合遺伝子の調製 グアメリンをコードするヌクレオチド配列（配列番
号:1）を、そのＣ末端をBspH Iで消化することができ、
グアメリン遺伝子が融合ペプチドのCNBr開裂により純粋
な抗微生物ペプチドのみを単離するために、抗微生物ペ
プチド遺伝子に融合される時に、抗微生物ペプチド遺伝
子の前に挿入することができるように少し改変した。
含む融合遺伝子の調製 グアメリンをコードするヌクレオチド配列（配列番
号:1）を、そのＣ末端をBspH Iで消化することができ、
グアメリン遺伝子が融合ペプチドのCNBr開裂により純粋
な抗微生物ペプチドのみを単離するために、抗微生物ペ
プチド遺伝子に融合される時に、抗微生物ペプチド遺伝
子の前に挿入することができるように少し改変した。
まず最初に、BamH I及びNde I制限酵素部位を含むＮ
末端オリゴヌクレオチド及びBamH I及びBspH I制限酵素
部位を含むＣ末端オリゴヌクレオチドを次の通り合成し
た。
末端オリゴヌクレオチド及びBamH I及びBspH I制限酵素
部位を含むＣ末端オリゴヌクレオチドを次の通り合成し
た。
（配列番号:18）
これにより合成されたＮ−及びＣ−末端オリゴヌクレ
オチドプライマー及びテンプレートとしてグアメリン遺
伝子（図１）を用いることによりPCRを行い新規グアメ
リン遺伝子を合成した。
オチドプライマー及びテンプレートとしてグアメリン遺
伝子（図１）を用いることによりPCRを行い新規グアメ
リン遺伝子を合成した。
当該技術で周知の８つの抗微生物ペプチド（Peptide
Science,Vol.37,105〜122（1995））を、融合ペプチド
の形態でそれらを発現するように選択し、ここでその生
化学的特徴を表１に示す。次のDNA配列（配列番号:19;
配列番号:21;配列番号:23;配列番号:25;配列番号:27;配
列番号:29;配列番号:31;配列番号:33;配列番号:35）
を、大腸菌のコドン用法に基づいて、各々のペプチド配
列（配列番号:20;配列番号:22;配列番号:24;配列番号:2
6;配列番号:28;配列番号:30;配列番号:32;配列番号:34;
配列番号:36）から予測し、後の使用のために合成し
た。
Science,Vol.37,105〜122（1995））を、融合ペプチド
の形態でそれらを発現するように選択し、ここでその生
化学的特徴を表１に示す。次のDNA配列（配列番号:19;
配列番号:21;配列番号:23;配列番号:25;配列番号:27;配
列番号:29;配列番号:31;配列番号:33;配列番号:35）
を、大腸菌のコドン用法に基づいて、各々のペプチド配
列（配列番号:20;配列番号:22;配列番号:24;配列番号:2
6;配列番号:28;配列番号:30;配列番号:32;配列番号:34;
配列番号:36）から予測し、後の使用のために合成し
た。
種々のグアメニン−抗微生物ペプチド融合遺伝子を、
合成したグアメリン遺伝子を、各々表１に示す種々の抗
微生物ペプチド遺伝子に融合することにより調製した。
即ち、合成したグアメリン遺伝子をBspH Iで消化してBs
pH I又はNco I開裂部位に相補的な末端を供し、そしてN
co Iで消化した合成した抗微生物ペプチド遺伝子に融合
して融合遺伝子を調製した。
合成したグアメリン遺伝子を、各々表１に示す種々の抗
微生物ペプチド遺伝子に融合することにより調製した。
即ち、合成したグアメリン遺伝子をBspH Iで消化してBs
pH I又はNco I開裂部位に相補的な末端を供し、そしてN
co Iで消化した合成した抗微生物ペプチド遺伝子に融合
して融合遺伝子を調製した。
実施例7:抗微生物ペプチドの発現
実施例６で調製した融合遺伝子を大腸菌内で発現させ
るために、pRSET（Invitrogen,USA）発現ベクターを用
いた。その発現ベクターをBamH I及びEcoR Iで消化し、
脱リン酸化し、そして実施例６で合成したグアメリン−
抗微生物ペプチド融合遺伝子をクローン化した。大腸菌
BL21（DE3）pLysSを、CaCl2法により融合遺伝子を有す
るベクターで形質転換した（Sambrookら、Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual,2nd ed.（1989））。
るために、pRSET（Invitrogen,USA）発現ベクターを用
いた。その発現ベクターをBamH I及びEcoR Iで消化し、
脱リン酸化し、そして実施例６で合成したグアメリン−
抗微生物ペプチド融合遺伝子をクローン化した。大腸菌
BL21（DE3）pLysSを、CaCl2法により融合遺伝子を有す
るベクターで形質転換した（Sambrookら、Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual,2nd ed.（1989））。
その形質転換体を、アンピシリンを補給した5mlのLB
培地で37℃で一晩、培養した。その培養した細胞を１％
（v/v）の最終濃度で5mlの新鮮なLB培地に希釈し、37℃
で２時間、インキュベートした。次に、その培養した培
地に、２％の最終濃度でラクトースを加えて、４時間、
37℃で融合ペプチドの発現を誘導した。融合遺伝子の発
現をSDS−PAGEにより分析した（図７を参照のこと）。
図７においてレーンＭは分子量マーカー（97.4,66.2,4
5,31,21.5,14.4kd）を示し；レーン１〜８は、アピダエ
シンＩ、ボンビニン、セクロピンＡ、ドロソシン、HNP
1、インドリシジン、メリトチン及びタキプレシンＩを
コードする遺伝子を各々抗微生物ペプチド遺伝子として
用いた融合遺伝子で形質転換した大腸菌の細胞ライゼー
トを示す。
培地で37℃で一晩、培養した。その培養した細胞を１％
（v/v）の最終濃度で5mlの新鮮なLB培地に希釈し、37℃
で２時間、インキュベートした。次に、その培養した培
地に、２％の最終濃度でラクトースを加えて、４時間、
37℃で融合ペプチドの発現を誘導した。融合遺伝子の発
現をSDS−PAGEにより分析した（図７を参照のこと）。
図７においてレーンＭは分子量マーカー（97.4,66.2,4
5,31,21.5,14.4kd）を示し；レーン１〜８は、アピダエ
シンＩ、ボンビニン、セクロピンＡ、ドロソシン、HNP
1、インドリシジン、メリトチン及びタキプレシンＩを
コードする遺伝子を各々抗微生物ペプチド遺伝子として
用いた融合遺伝子で形質転換した大腸菌の細胞ライゼー
トを示す。
先に明確に示され、照明されるように、本発明は、抗
微生物ペプチドを大量生産するための方法であって、外
来ペプチドとの融合ペプチドとして抗微生物ペプチドを
調製するステップを含む方法を供する。本発明によれ
ば、発現した抗微生物ペプチドの、宿主微生物の増殖へ
の阻害効果は、それを酸性ペプチドに融合することによ
り劇的に最小化することができる。従って、抗微生物ペ
プチドは、その抗微生物ペプチドの種類にかかわらず、
組換え微生物から大量生産することができる。
微生物ペプチドを大量生産するための方法であって、外
来ペプチドとの融合ペプチドとして抗微生物ペプチドを
調製するステップを含む方法を供する。本発明によれ
ば、発現した抗微生物ペプチドの、宿主微生物の増殖へ
の阻害効果は、それを酸性ペプチドに融合することによ
り劇的に最小化することができる。従って、抗微生物ペ
プチドは、その抗微生物ペプチドの種類にかかわらず、
組換え微生物から大量生産することができる。
配列表
（２）配列番号:1の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:183塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（iv）アンチセンス:NO
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン名:Guamerin gene
（xi）配列の記載：配列番号:1:
（２）配列番号:2の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:61アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン名:Guamerin
（xi）配列の記載：配列番号:2:
（２）配列番号:3の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:81塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（iv）アンチセンス:NO
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン名:MIS（magainin intervening seg
ment）gene （xi）配列の記載：配列番号:3: （２）配列番号:4の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:MIS （xi）配列の記載：配列番号:4: （２）配列番号:5の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:84アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Guamerin/Buforin II fusion pr
otein （xi）配列の記載：配列番号:5: （２）配列番号:6の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:46アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:MIS/Buforin II fusion protein （xi）配列の記載：配列番号:6: （２）配列番号:7の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:84アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Guamerin/MS I−78 fusion prot
ein （xi）配列の記載：配列番号:7: （２）配列番号:8の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:84アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Guamerin/MS I−78 fusion prot
ein （xi）配列の記載：配列番号:8: （２）配列番号:9の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:21アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Buforin II （xi）配列の記載：配列番号:9: （２）配列番号:10の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:32塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名：プライマー （xi）配列の記載：配列番号:10: （２）配列番号:11の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名：プライマー （xi）配列の記載：配列番号:11: （２）配列番号:12の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名：プライマー （xi）配列の記載：配列番号:12: （２）配列番号:13の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名：プライマー （xi）配列の記載：配列番号:13: （２）配列番号:14の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:22アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:MS I−78 （xi）配列の記載：配列番号:14: （２）配列番号:15の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:825塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:prepromagainin gene （xi）配列の記載：配列番号:15: （２）配列番号:16の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:275アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:prepromagainin （xi）配列の記載：配列番号:16: （２）配列番号:17の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名：プライマー （xi）配列の記載：配列番号:17: （２）配列番号:18の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名：プライマー （xi）配列の記載：配列番号:18: （２）配列番号:19の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:54塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （xi）配列の記載：配列番号:19: （２）配列番号:20の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Apidaecin I （xi）配列の記載：配列番号:20: （２）配列番号:21の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:72塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （xi）配列の記載：配列番号:21: （２）配列番号:22の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:24アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Bombinin （xi）配列の記載：配列番号:22: （２）配列番号:23の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:108塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （xi）配列の記載：配列番号:23: （２）配列番号:24の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:36アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Cecropin A （xi）配列の記載：配列番号:24: （２）配列番号:25の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:57塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （xi）配列の記載：配列番号:25: （２）配列番号:26の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:19アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Drosocin （xi）配列の記載：配列番号:26: （２）配列番号:27の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:90塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （xi）配列の記載：配列番号:27: （２）配列番号:28の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:HNP−Ｉ （xi）配列の記載：配列番号:28: （２）配列番号:29の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:39塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （xi）配列の記載：配列番号:29: （２）配列番号:30の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:13アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Indolicidin （xi）配列の記載：配列番号:30: （２）配列番号:31の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:66塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （xi）配列の記載：配列番号:31: （２）配列番号:32の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:22アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Magainin （xi）配列の記載：配列番号:32: （２）配列番号:33の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:78塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （xi）配列の記載：配列番号:33: （２）配列番号:34の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:26アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Melittin （xi）配列の記載：配列番号:34: （２）配列番号:35の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:51塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA （iv）アンチセンス:NO （xi）配列の記載：配列番号:35: （２）配列番号:36の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:17アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Tachyplesin I （xi）配列の記載：配列番号:36:
ment）gene （xi）配列の記載：配列番号:3: （２）配列番号:4の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:MIS （xi）配列の記載：配列番号:4: （２）配列番号:5の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:84アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Guamerin/Buforin II fusion pr
otein （xi）配列の記載：配列番号:5: （２）配列番号:6の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:46アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:MIS/Buforin II fusion protein （xi）配列の記載：配列番号:6: （２）配列番号:7の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:84アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Guamerin/MS I−78 fusion prot
ein （xi）配列の記載：配列番号:7: （２）配列番号:8の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:84アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:Guamerin/MS I−78 fusion prot
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(72)発明者 キム，サン チャン
大韓民国，テジョン 305―335，ユソン
―ク，コーン―ドン，ダソル アパート
メント 103―702
(72)発明者 リー，イェ フュン
大韓民国，テジョン 305―590，ユソン
―ク，ジュミン―ドン 292―５
(72)発明者 カン，ミン ヒュン
大韓民国，ソウル 137―064，ソチョー
―ク，バンベ ４―ドン 858―17，ウ
リム アパートメント 103
(72)発明者 キム，ジョン ヒュン
大韓民国，テジョン 305―348，ユソン
―ク，ファーム―ドン 63―２
(72)発明者 ホン，スン―ス
大韓民国，テジョン 305―390，ユソン
―ク，ジュミン―ドン 462―４，チェ
オング―ナラエ アパートメント 109
―404
(72)発明者 ヒュン―スー，リー
大韓民国，ソウル，137―040，セオチョ
ー―ク，バンポ―ドン 550―18，イェ
ウー ハウス 101
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12P 21/00 - 21/02
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (6)
- 【請求項１】抗微生物ペプチドを大量生産するための方
法であって、 （ｉ）少くとも２のシステイン残基を有する負に荷電し
た酸性ペプチドをコードする第１の遺伝子と、正に荷電
した塩基性抗微生物ペプチドをコードする第２の遺伝子
と、を含む融合遺伝子を作製するステップと、 （ii）該融合遺伝子を含む発現ベクターで宿主微生物を
形質転換するステップと、 （iii）該形質転換された微生物を培養して前記酸性ペ
プチド及び前記抗微生物ペプチドを含む融合ペプチドを
発現させるステップと、 （iv）該発現された抗微生物ペプチドを回収するステッ
プと、 を含む方法。 - 【請求項２】前記融合遺伝子が、前記酸性ペプチドと前
記抗微生物ペプチドとの間に、プロテアーゼ又は化学物
質のための少くとも１の開裂部位を含むことを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記酸性ペプチドの負の電荷が前記抗微生
物ペプチドの正の電荷を中和することを特徴とする請求
項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記発現ベクターが前記融合遺伝子の多量
体を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記発現ベクターが、抗微生物ペプチドの
正の電荷を中和し少くとも２のシステイン酸基を有する
酸性ペプチド、及び抗微生物ペプチドを含む融合ペプチ
ドをコードする遺伝子に作用可能に連結したプロモータ
ーを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記遺伝子が、抗微生物ペプチドの正の電
荷を中和し少くとも２のシステイン残基を有する酸性ペ
プチドをコードする第１の遺伝子、及び該第１の遺伝子
に融合した正に荷電した抗微生物ペプチドをコードする
第２の遺伝子の多量体形態であることを特徴とする請求
項５に記載の方法。
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