KR100451432B1

KR100451432B1 - Ｔ-20 펩타이드의 생물학적 제조방법

Info

Publication number: KR100451432B1
Application number: KR10-2002-0040839A
Authority: KR
Inventors: 강충경; 김정현
Original assignee: 강충경
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2004-10-06
Also published as: WO2004007740A1; AU2003245166A1; KR20040006539A

Abstract

본 발명은 T-20 또는 T-20-유사 펩타이드를 생물학적으로 대량 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 하기 단계를 포함하는 T-20 또는 T-20-유사 펩타이드의 생물학적 제조방법에 관한 것이다:

1) T-20 또는 T-20 유사 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포외 분비 신호 서열 또는 불용성 선도 서열과 융합시키는 단계,

2) 1)에서 얻어진 유전자 구조물을 포함한 발현벡터를 제조하는 단계,

3) 숙주세포를 상기 발현 벡터로 형질 전환시키는 단계,

4) 상기 형질 전환된 세포를 상기 유전자 구조물이 발현되도록 배양하는 단계, 및

5) 발현된 펩타이드를 회수하는 단계.

Description

Ｔ-20 펩타이드의 생물학적 제조방법{BIOLOGICAL METHOD FOR PRODUCING T- 20 PEPTIDE}

본 발명은 재조합 DNA 기술에 관한 것으로, 미생물에서 T-20 펩타이드 또는 T-20-유사 펩타이드를 생물학적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

T-20 펩타이드는 미국 특허 제5,464,933호 및 제5,656,480호에서 공개된 내용과 같이, HIV-1 _LA1 의 막투과 단백질인, gp41의 638 내지 673번 아미노산에 해당하는 펩타이드로서, CD-4⁺세포로의 HIV 감염을 저해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

펩타이드 T-20의 화학적 합성에 관한 기술은 미국특허 6,015,881에서 설명되고 있다.

전통적인 펩타이드의 화학적 합성방법은 동종업계에서 종사하는 전문가가 공통으로 인정하는 바와 같이 매우 복잡하고 고가의 경비가 요구되는 공정이다. 특정 펩타이드는 20 종류의 아미노산이 일정한 성분과 배열로 구성되어 있는데 이를 화학적으로 합성하기 위해서는 목적하는 아미노산을 고형상 혹은 액상에서 목적하는 순서에 맞게 결합하고 정제하는 공정을 반복해야 한다. 즉, 고도로 정제된 아미노산이나 그 유도체를 원료로 해야 하며, 또한 목적하는 펩타이드를 구성하는 잔기 즉 아미노산의 수가 많아질수록 생산 공정이 복잡해지고 회수율이 떨어지며 생산단가가 기하급수적으로 높아지게 된다. 따라서, 산업적으로 유용한 펩타이드가 개발되었다고 하더라도 생산 공정의 복잡성과 경제성의 저하로 산업화의 어려움에당면하게 된다.

대한민국 특허 등록 제263583호, 미국 특허 제6,183,992호 및 대한민국 특허 등록 제319529호에서는 유용한 펩타이드의 유전자와 미생물을 이용한 생물학적 생산방법을 개시하고 있다.

유용한 펩타이드의 생물학적 생산방법은 고도로 정제된 아미노산이나 특정 펩타이드 단편을 원료로 하지 않고 자연계에 존재하는 상대적으로 저렴하고 환경친화적인 배지 성분을 주원료로 하므로 원료에 의한 제조원가에 대한 부담이 적으며 원료수급의 문제점을 야기하지 않는 장점을 갖는다. 또한 주공정인 미생물의 배양에 소요되는 시간이 짧으며(예를 들면, 대장균의 경우 72시간 이내), 목적하는 융합 펩타이드의 분리, 정제공정에 의해 높은 순도의 물질을 큰 어려움 없이 획득할 수 있는 장점이 있다.

펩타이드 T-20의 재조합 DNA 기술을 이용한 생물학적 생산 방법과 관련하여서는 보고된 바가 전무한 바, T-20 펩타이드가 36개의 아미노산으로 구성되는 펩타이드로서 세포내 안정성의 문제로 인하여 일반적인 재조합 DNA 술을 이용한 생물학적 생산 방법에 의하여 생산하기가 용이하지 않은 문제가 있었다.

이에 본 발명자들은 펩타이드를 미생물에서 대량으로 발현 및 생산하기 위해서는 숙주의 프로테아제 또는 펩티다제에 의해 발현된 펩타이드가 분해되는 것을 방지하는 것이 중요하다는 인식을 전제로, T-20 펩타이드 또는 T-20 유사 펩타이드가 융합단백질의 형태로 발현되고 효과적으로 분리 정제되도록 유전자 구조물을 고안하여 T-20 펩타이드또는 T-20 유사 펩타이드를 대량으로 생산하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 미생물에서 T-20 또는 T-20-유사 펩타이드를 대량으로 발현시키고 효과적으로 회수할 수 있는 유전자 구조물, 발현 벡터 및 그 생산 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 T-20 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열이고,

도 2는 G3S-T-20 융합 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열이고(클로닝에 이용한 제한 효소 자리는 밑줄로 표시하였고, 회색 부분은 융합 파트너 G3S, 흰색 부분은 T-20를 표시하고 있다),

도 3은 pET-MBPT20 제조방법의 모식도이고,

도 4는 MBP-T-20 융합 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열이고(클로닝에 이용한 제한 효소 자리는 밑줄로 표시하였고, 회색 부분은 융합 파트너 MBP이며, 흰색 부분은 T-20를 표시하고 있다),

도 5는 대장균에서 G3S에 의해 발현된 T-20 펩타이드를 나타내는 전기영동 사진이다(pET24a: 대조군, C: 세포기질, M: 배지. 발현된 T-20는 화살표로 표시).

도 6은 대장균에서 MBP-T-20 fusion protein의 발현을 나타내는 전기영동 사진이다(pET24a: 대조군, 발현된 MBP-T-20 fusion protein은 화살표로 표시).

상기 목적에 따라, 본 발명은 T-20 펩타이드 또는 T-20-유사 펩타이드를 미생물에서 대량으로 발현시키고 효과적으로 회수할 수 있도록 고안된 유전자 구조물, 발현 벡터 및 그 생산 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 T-20 또는 T-20-유사 펩타이드의 생물학적 제조방법을 제공한다:

3) 숙주세포를 상기 발현 벡터로 형질 전환시키는 단계,

5) 발현된 T-20 또는 T-20 유사 펩타이드를 회수하는 단계.

본 발명은 또한 T-20 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

T-20 펩타이드는 HIV-1 _LA1 의 막투과 단백질인, gp41의 638 내지 673번 아미노산에 해당하는 펩타이드이다.

T-20 유사 펩타이드는 T-20 펩타이드에 70% 이상의 상동성을 갖는 펩타이드를 의미한다.

세포외 분비 신호 서열은 신호 서열에 연결되어 발현되는 단백질 또는 펩타이드를 세포막 또는 세포외로 분비되도록 유도하는 뉴클레오타이드 서열부위를 의미한다.

불용성 유도 서열은 유도 서열에 연결되어 발현되는 단백질 또는 펩타이드가 불용성 봉입체(inclusion body)의 형태로 발현되도록 유도하는 뉴클레오타이드 서열부위를 의미한다.

상기 생산 방법을 단계별로 설명하면, 단계 1)에서 T-20 또는 T-20 유사 유전자는 미생물, 예를 들어 HIV로부터 유래되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 화학적으로 합성되는 경우 폴리뉴클레오티드를 선택된 숙주 미생물에서 효과적으로 발현시키기 위해 숙주 미생물의 코돈 이용도(codon usage)를 고려하여 고안하고 당업계에 공지된 방법에 따라 화학적으로 합성한다. 상기 폴리뉴클레오티드에 융합 파트너와의 융합 및 클로닝을 위하여 필요한 제한 효소 자리를 포함시킬 수 있다.

T-20 펩타이드 또는 T-20-유사 펩타이드를 미생물에서 대량으로 발현시키고 생산하기 위한 필수 요건은 T-20 펩타이드 또는 T-20-유사 펩타이드가 효과적으로 세포내 또는 세포외에 축적되고 분비될 수 있도록 하는 것이다. 이를 위해 T-20 또는 T-20-유사 유전자에 융합 파트너로 유전자, 그것의 일부 또는 이들의 유도체가 연결된 유전자 구조물을 제조한다.

즉, T-20 또는 T-20 유사 유전자에, 발현된 융합 단백질이 세포외로 분비되도록 유도하는 세포외 분비 신호 서열 또는 발현된 융합 단백질이 세포내애서 봉입체(inclusion body)를 형성하도록 유도하는 불용성 유도 서열을 융합시킨 유전자 구조물을 제조한다. 본 발명에서 사용가능한 세포외 분비 신호서열은E. coli파지 M13 gene III 신호 서열(이하 "G3S")을 포함한다. 또한, 본 발명에서 사용가능한 불용성 선도 서열은 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의pyrG유전자(Kim et al., Biochem. Mol. Biol. Int., 43: 925, 1997) 전체 또는 N-말단 단편, 바람직하게는 1 내지 57번 아미노산 서열을 포함하는 단편(이하 "MBP")을 포함한다.

분비 신호 서열을 이용하는 경우, 발현된 융합 펩타이드는 비교적 프로테아제 및 펩티다제가 적은 세포 밖으로 분비되며, 불용성 선도 서열을 이용하는 경우 펩타이드는 불용성 봉입체(inclusion body) 형태로 발현되기 때문에 프로테아제 및 펩티다제에 의해 분해되지 않아 세포내에서 안정적으로 T-20 또는 T-20 유사 펩타이드를 발현 시킬 수 있다.

본 발명의 융합 유전자는 당업계에 공지된 PCR 방법 또는 연결 효소를 이용한 유전자 연결 방법에 의하여 생산할 수 있다.

단계 2)에서 본 발명에 따른 유전자 구조물은 이 분야에서 통상적으로 이용되는 발현벡터, 예를 들어 플라즈미드, 바이러스 또는 그 외에 구조 유전자를 삽입(insertion) 또는 병합(incorporation)할 수 있는 비히클에 삽입하여 숙주 세포에 클로닝될 수 있다.

발현에 이용되는 전사 프로모터의 예로는 tac, trc, trp, T7Φ10, P_L프로모터, 기타 미생물의 유도 프로모터 또는 구성성(constitutive) 프로모터를 사용할 수 있다. 추가로, 벡타의 형질전환 여부를 판별하는 선택 마커 유전자를 포함할 수 있으며, 이러한 선택 마커 유전자로는 앰피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜 등과 같은 항생제 내성 유전자 또는 숙주의 영양 요구성을 보상할 수 있는 유전자가 이용될 수 있다.

또한, 상기 발현 벡터는 a) 개시 코돈 Met을 발생시킬 수 있는 제 1 제한효소 자리 b) 유전자 구조물 c) 라이보솜 결합 자리 및 d) 제1 제한효소 자리와 연결되면서 개시 코돈을 만들 수 있는 제 2 제한효소 자리로 이루어지는 단위가 반복되어 이루어지는 다량체일 수 있다.

단계 3)에서 숙주세포는 특별히 한정되지 않으나, 대장균, 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(streptomyces), 효모 등을 사용할 수 있고, 대장균이 바람직하다.E. coli균주로는 예를 들어 BL21(DE3), BLR(DE3), B834(DE3), AD494(DE3), JM109(DE3), HMS174(DE3), UT400(DE3), UT5600(DE3), TG1등을 사용할 수 있다.

단계 4)에서 배양배지는 각 숙주 또는 얻어진 형질 전환체의 특성에 따라 LB, M9, M9CA, R을 사용할 수 있고, 숙주에 따라 성장인자를 첨가한다.

LB 배지(박토-트립톤 10 g/l, 효모추출물 5 g/l, NaCl 10 g/l)

M9 배지(Na₂PO_4.7H₂O 12.8 g/l, KH₂PO₄3.0 g/l, NaCl 0.5 g/l, NH₄Cl 1 g/l, 글루코오스 4 g/l, MgSO₄2mM, CaCl₂0.1mM)

M9CA 배지(M9배지+ 0.2% 카사미노산)

R 배지(Reisenberg 배지; KH₂PO₄13.3 g/l(NH₄)₂HPO₄4.0 g/l, 시트르산 0.17 g/l, MgSO₄.7H₂O 0.22 g/l, 글루코오스 20 g/l, 미량원소 용액 10ml/l)

미량원소 용액(ferric citrate 7.3 g/l, CoCl₂.6H₂O 0.5 g/l, MnCl₂.4H₂O 3.2 g/l, CuCl₂.2H₂O 0.3 g/l, H₃BO₃0.7 g/l, NaMoO₄.2H₂O 1.68 g/l, 티아민 HCl 0.5g/l, EDTA 1 g/l)

단계 5)에서 분비 신호 서열을 이용하는 경우, 발현된 융합 펩타이드는 세포 밖으로 분비되며, 분비과정에서 융합 파트너가 제거되기 때문에 융합 파트너를 제거하는 별도의 과정이 필요 없다.

불용성 선도 서열을 이용하는 경우 융합 펩타이드로부터 T-20 또는 T-20 유사 펩타이드를 얻기 위해서는 화학물질 또는 단백질 분해효소를 이용하여 융합 단백질으로부터 펩타이드를 절단, 분리할 수 있다. 예를 들어, Factor Xa나 엔테로키나제(enterokinase) 와 같은 단백질 분해 효소, 시안화브롬(CNBr) 또는 하이드록실아민과 같은 화학물질에 의해 절단되는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 융합 파트너와 T-20 또는 T-20 유사 펩타이드 유전자 사이에 삽입할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> T-20 유전자의 합성

T-20 펩타이드를E. coli에서 발현시키기 위해 올리고뉴클레오티드 whole-F(서열번호 : 1)와 whole-R(서열번호 : 2)을 화학적으로 합성하였다. 융합 파트너와의 융합 및 클로닝을 위하여, Whole F에는KpnI 제한 효소 자리, whole-R에는HindIII 제한 효소 자리를 포함시켰다. 이 두개의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 아래와 같은 방법으로 이중가닥 DNA를 합성하였다. 즉, whole-F와 whole-R 5㎍을 50㎕ TE buffer(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA)에 녹인 후 95℃에서 5 분간 변성시킨 후 상온까지 천천히 냉각시켜 복원(annealing)시켰다. 여기에 10X 반응 완충용액(500mM Tris-HCl(pH 7,2), 100mM MgSO₄, 1mM DTT) 20㎕, 10mM dNTP 8㎕, DNA 중합효소 I large fragment(10U/㎕) 3㎕, H₂O 119㎕를 첨가한 후 37℃에서 3 시간동안 반응시켰다. 이 반응 혼합액을 65℃에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화하고 에탄올 침전시켜 50㎕로 농축하였고, 이를HindIII와KpnI으로 절단한 후 아가로스 젤 전기영동하여 절단된 이중가닥 DNA를 정제하였다. 제조된 T-20 유전자 구조물의 구성(서열번호 : 3)은 도 1과 같다.

<실시예 2> E. coli 파지 gene III 신호 서열(G3S)와의 융합 및 벡터의 제조

T-20 펩타이드를 배지로 분비시키기 위해 T-20 유전자를 G3S와 융합시킨 유전자 구조물을 제조하였다. 이를 위해 프라이머 G3-T20(서열번호 : 5)를 합성하였으며 이 프라이머는 M13 유전자 III의 신호 서열과 T-20 gene의 5'말단으로부터 21 뉴클레오티드 및 클로닝을 위한NdeI 제한 효소 자리(도 2 )를 포함한다. PCR 프라이머로 G3-T20 과 Whole R을 사용하고 주형으로서 실시예 1에서 얻은 T-20 유전자(도 1)을 사용하여, 아래와 같이 PCR 반응을 수행하여 G3S-T-20 융합 유전자를 얻었다.

<반응 용액>

주형 DNA(50 ng/㎕) 1㎕

10X Taq reaction buffer 5㎕

dNTP(10mM) 1㎕

primer G3-T20(10 pmol/㎕) 1㎕

primer Whole R(10 pmol/㎕) 1㎕

Taq polymerase 1㎕

H₂O 40㎕

<반응 조건>

95℃ 5분 1 cycle

95℃ 30 초

56℃ 30 초

72℃ 30 초 30 cycle

72℃ 5 분 1 cycle

이와 같이 얻은 PCR 생성물을 페놀/클로로포름 처리하여 Taq 중합효소를 불활성화시키고 에탄올 침천시켜 20㎕로 농축하였다. PCR 반응으로부터 얻은 G3S-T20 융합 유전자를NdeI과HindIII로 절단하여 pET24a(Novagen, USA)의 동일한 제한 효소 자리에 클로닝하였고 제조된 DNA 구조물을 pET-G3ST20로 명명하였다. 이와 같이 제조된 융합 유전자 G3S-T20 및 그 아미노산 서열은 도 2와 같다(서열번호 : 6 및 7).

<실시예 3> 미코박테리움 보비스( M. bovis) pyr G 의 N-말단 서열(MBP)과의 융합 및 벡터의 제조

발현되는 T-20 펩타이드의 세포내 분해를 막기 위해, 불용성으로 발현되는 미코박테리움 보비스(M. bovis) pyrG유전자의 N-말단 1~ 57번까지의 아미노산을 포함하는 단편을 T-20 유전자에 융합시켰다. 미코박테리움 보비스(M. bovis)의pyrG유전자는 GTG로 시작하기 때문에 (Kim et al., Biochem. Mol. Biol. Int., 43: 925, 1997), 아래와 같이 PCR을 이용하여 ATG로 치환하였고, 클로닝을 위하여NdeI 제한 효소 자리를 삽입하였다. 먼저, 도 3에 표시된 바와 같은 프라이머 1 및 2(서열번호: 8 및 9) 및M. bovis염색체로부터 클로닝된 pyrG 유전자를 PCR 주형으로 사용하여 표준조건에서 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을NdeI과KpnI으로절단하고 아가로스 젤 전기영동하여 170 bp의 DNA 단편을 분리하였다. 이 DNA 단편을 실시예 1에서 얻은 DNA를KpnI과HindIII로 처리하여 얻은 120 bp DNA 단편과 연결한 후,NdeI과HindIII로 절단하고 아가로스 젤 전기영동하여 290 bp의 DNA 단편을 분리하였다. 이 DNA 단편을 pET24a(Novagen, USA)의NdeI-HindIII 제한 효소 자리에 클로닝 하였고 이 플라스미드를 pET-MBPT20로 명명하였다(도 3). 이 융합 유전자 MBP-T-20의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 도 4와 같다(서열번호 : 10 및 11).

<실시예 4> pET-G3S-T-20의 발현

상기 실시예 2 에서 얻은 플라스미드 pET-G3ST20를E. coliBE21(DE3)에 형질 전환시킨 후 형질 전환체를 카나마이신 50㎍/ml을 포함하는 LB 배지에서 5 - 18 시간동안 37℃에서 전배양을 하고, 신선한 배지에 1/100(v/v)의 전배양액을 접종한 후 37℃에서 배양한다. 융합 유전자의 발현을 유도하기 위해, 세포 밀도가 OD₆₀₀에서의 흡광도가 0.5일 때 배지에 2mM IPTG를 첨가하고, 2시간 동안 더 배양한 후, 6000rpm에서 원심분리하여 세포와 배지를 분리하였다. 발현된 T-20 펩타이드는 16% Tris-tricine 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 발현을 분석하였다.

발현된 T-20 펩타이드는 세포기질 및 배양 배지로 분비되었고(도 5), 생성된 펩타이드는 아미노산 서열 분석과 MALDI-TOP으로 확인하였다.

<실시예 5> pET-MBPT20의 발현

상기 실시예 2 에서 얻은 플라스미드 pET-MBPT20을 상기 실시예 4와 동일한방법으로 형질 전환하여 배양한 후, OD₆₀₀에서의 흡광도가 0.5일 때 1mM IPTG를 첨가하여 융합 유전자의 발현을 유도하였다. 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 발현된 T-20-MBP 융합 단백질의 발현을 확인하였다(도 6).

본 발명의 생산방법은 T-20 및 T-20-유사 펩타이드를 보다 적은 비용으로 효과적으로 생산할 수 있으며 분리 및 정제 또한 용이하므로, HIV 감염 억제제의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> KANG, CHOONGKYUNG <120> BIOLOGICAL METHOD FOR PRODUCING T-20 PEPTIDE <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WHOLE-F <400> 1 cgcggtacca tgtataccag cctgattcat agcctgattg aagaaagcca gaaccagcag 60 gaaaaaaacg aacag 75 <210> 2 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WHOLE-R <400> 2 cgcaagcttt taaaaccagt tccacaggct cgcccattta tccagttcca gcagttcctg 60 ttcgtttttt tcctgctg 78 <210> 3 <211> 132 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 3 cgcggtacca tgtataccag cctgattcat agcctgattg aagaaagcca gaaccagcag 60 gaaaaaaacg aacaggaact gctggaactg gataaatggg cgagcctgtg gaactggttt 120 taaaagcttg cg 132 <210> 4 <211> 36 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 4 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 10 15 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 20 25 30 Trp Asn Trp Phe 35 <210> 5 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER G3-T20 <400> 5 cgcgcatatg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtg gtgcctttct attctcactc 60 ttataccagc ctgattcata gc 82 <210> 6 <211> 181 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G3S-T-20 <400> 6 cgcgcatatg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtg gtgcctttct attctcactc 60 ttataccagc ctgattcata gcctgattga agaaagccag aaccagcagg aaaaaaacga 120 acaggaactg ctggaactgg ataaatgggc gagcctgtgg aactggtttt aaaagcttgc 180 g 181 <210> 7 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G3S-T-20 <400> 7 Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser 1 5 10 15 His Ser Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn 20 25 30 Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala 35 40 45 Ser Leu Trp Asn Trp Phe 50 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER 1 <400> 8 gcgcatatgc gaaagcaccc gcaaaccg 28 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER 2 <400> 9 gcccaagtac catgggccca gc 22 <210> 10 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP-T-20 <400> 10 gcgcatatgc gaaagcaccc gcaaaccgct accaagcacc tcttcgtcag cggcggcgtt 60 gcttcctcgc tcggcaaggg actgaccgcc agcagcctag gacaattgtt gacggctcgt 120 gggttacacg tcacgatgca aaagctcgac ccgtacctca acgtcgaccc gggtaccatg 180 tataccagcc tgattcatag cctgattgaa gaaagccaga accagcagga aaaaaacgaa 240 caggaactgc tggaactgga taaatgggcg agcctgtgga catggtttta aaagcttgcg 300 300 <210> 11 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP-T-20 <400> 11 Met Arg Lys His Pro Gln Thr Ala Thr Lys His Leu Phe Val Ser Gly 1 5 10 15 Gly Val Ala Ser Ser Leu Gly Lys Gly Leu Thr Ala Ser Ser Leu Gly 20 25 30 Gln Leu Leu Thr Ala Arg Gly Leu His Val Thr Met Gln Lys Leu Asp 35 40 45 Pro Tyr Leu Asn Val Asp Pro Gly Thr Met Tyr Thr Ser Leu Ile His 50 55 60 Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu 65 70 75 80 Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe 85 90

Claims

하기 단계를 포함하는 T-20 또는 T-20-유사 펩타이드의 생물학적 제조방법:

1) T-20 또는 T-20 유사 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포외 분비 신호 서열 또는 불용성 선도 서열과 융합시키는 단계,

2) 1)에서 얻어진 유전자 구조물을 포함한 발현벡터를 제조하는 단계,

3) 숙주세포를 상기 발현 벡터로 형질 전환시키는 단계,

4) 상기 형질 전환된 세포를 상기 유전자 구조물이 발현되도록 배양하는 단계, 및

5) 발현된 T-20 또는 T-20 유사 펩타이드를 회수하는 단계.
제1항에 있어서, 단계 1)의 세포외 분비 신호 서열이E. coli파지 M13 gene III 신호 서열(G3S)인 방법.
제1항에 있어서, 단계 1)의 불용성 유도 서열이 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의pyrG유전자의 N-말단 단편(MBP)인 방법.
제1항에 있어서, T-20 또는 T-20 유사 유전자가 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드인 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 벡터가 a) 개시 코돈 Met을 발생시킬 수 있는 제 1 제한효소 자리 b) 유전자 구조물 c) 라이보솜 결합 자리 및 d) 제1 제한효소 자리와 연결되면서 개시 코돈을 만들 수 있는 제 2 제한효소 자리로 이루어지는 단위가 반복되어 이루어지는 다량체인 방법.
제1항에 있어서, 단계 5)에서 펩타이드 분해 화학물질 또는 단백질 분해효소를 이용하여 융합 펩타이드로부터 T-20 또는 T-20 유사 펩타이드를 절단 및 분리하는 방법.
제6항에 있어서, 단백질 분해 효소가 Factor Xa 또는 엔테로키나제(enterokinase)인 방법.
제6항에 있어서, 펩타이드 분해 화학물질이 시안화브롬(CNBr) 또는 하이드록실아민인 방법.
서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.