JP2887060B2 - グリセンチンの生産方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は糖尿病治療薬などの医薬
用途に有用なヒト型グリセンチンの製法に関する。
用途に有用なヒト型グリセンチンの製法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び問題点】グリセンチンは６９アミノ酸
よりなる消化管ペプチドホルモンで、消化管の生理作用
に重要な役割を演じており、例えば特願平６−８０５８
４号に示されている様に糖尿病治療薬等の医薬品として
期待される。グリセンチンは１９７６年にF. Sandbyら
によってブタの小腸より初めて単離精製され〔F. Sandb
y, et. al.,Horm. Metab. Res. vol 18, 366〜371(197
6)〕、ついでA.J. Moodyにより構造決定がなされた〔A.
Thim and A.J. Moody Regul. Pept. vol 2, 139-150(1
981)〕。その後数種の動物のグリセンチン遺伝子の構造
が解明され、遺伝子の構造から各々のアミノ酸配列が明
らかにされた。そのアミノ酸配列には動物種特異性があ
る。しかしヒト型グリセンチンはヒト臓器の入手が困難
であることから単離精製されたことはない。
よりなる消化管ペプチドホルモンで、消化管の生理作用
に重要な役割を演じており、例えば特願平６−８０５８
４号に示されている様に糖尿病治療薬等の医薬品として
期待される。グリセンチンは１９７６年にF. Sandbyら
によってブタの小腸より初めて単離精製され〔F. Sandb
y, et. al.,Horm. Metab. Res. vol 18, 366〜371(197
6)〕、ついでA.J. Moodyにより構造決定がなされた〔A.
Thim and A.J. Moody Regul. Pept. vol 2, 139-150(1
981)〕。その後数種の動物のグリセンチン遺伝子の構造
が解明され、遺伝子の構造から各々のアミノ酸配列が明
らかにされた。そのアミノ酸配列には動物種特異性があ
る。しかしヒト型グリセンチンはヒト臓器の入手が困難
であることから単離精製されたことはない。
【０００３】グリセンチンの生産法としては動物臓器か
らの抽出、化学合成などが考えられる。しかし動物臓器
からの抽出法は臓器中のグリセンチンの含有量が微量で
あるため多量の臓器を必要とし、しかも上述のように動
物種によりアミノ酸配列に差異があるためブタなど多量
に入手できる動物臓器からのものは単離、精製が可能で
あるものの、このように精製して得られるグリセンチン
は動物種に固有のものでヒト型と異なる。そしてヒト臓
器からの抽出精製は臓器入手が不可能に近いのでこれを
抽出源とすることはできない。化学合成法はアミノ酸配
列が長いため反応収率が低くしかも試薬が高価であるた
め安価に多量のグリセンチンを供給することはできな
い。
らの抽出、化学合成などが考えられる。しかし動物臓器
からの抽出法は臓器中のグリセンチンの含有量が微量で
あるため多量の臓器を必要とし、しかも上述のように動
物種によりアミノ酸配列に差異があるためブタなど多量
に入手できる動物臓器からのものは単離、精製が可能で
あるものの、このように精製して得られるグリセンチン
は動物種に固有のものでヒト型と異なる。そしてヒト臓
器からの抽出精製は臓器入手が不可能に近いのでこれを
抽出源とすることはできない。化学合成法はアミノ酸配
列が長いため反応収率が低くしかも試薬が高価であるた
め安価に多量のグリセンチンを供給することはできな
い。
【０００４】これに対し本発明者等は既にヒト型グリセ
ンチンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成しこれ
をベクターにつなぎこれにより形質転換された微生物を
培養することによってヒト型グリセンチンを製造する技
術を開発した（消化管ホルモン(XI)、３９４〜４０１、
（１９９２）；消化管ホルモン研究会編三好秋馬等編、
医学図書出版参照）。そしてこの遺伝子発現のためにla
c. trc, trp, λPL等一般に使用されるプロモーターを
用い種々の大腸菌宿主でのヒト型グリセンチンの生産を
検討したが得られたグリセンチンはアミノ末端にメチオ
ニンが付加しており天然型とは異なっていた。
ンチンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成しこれ
をベクターにつなぎこれにより形質転換された微生物を
培養することによってヒト型グリセンチンを製造する技
術を開発した（消化管ホルモン(XI)、３９４〜４０１、
（１９９２）；消化管ホルモン研究会編三好秋馬等編、
医学図書出版参照）。そしてこの遺伝子発現のためにla
c. trc, trp, λPL等一般に使用されるプロモーターを
用い種々の大腸菌宿主でのヒト型グリセンチンの生産を
検討したが得られたグリセンチンはアミノ末端にメチオ
ニンが付加しており天然型とは異なっていた。
【０００５】すなわち、一般に遺伝子組換えにより蛋白
質を製造する際は、アミノ末端に遺伝子翻訳開始コドン
ＡＴＧによりコードされるメチオニンが付加したペプチ
ドが得られる。ところが組換えＤＮＡ技術により製造し
た有用蛋白質を、医薬品、又は食品等として使用する場
合には、メチオニン残基の付加した有用蛋白質は、抗原
性をもたらす可能性があるためできる限り除去しておく
必要がある。そこで、メチオニンを切断して天然型蛋白
質を得る方法としては、ブロムシアンを用いてメチオニ
ンの部位で部位特異的に分解する化学的方法や、適当な
ペプチドと目的の天然型蛋白質の間に特定の部位特異的
蛋白質分解酵素の認識配列を挿入した融合蛋白質を作り
その酵素で部位特異的に加水分解する酵素的方法などが
ある。しかしながら、グリセンチンにこれらの方法を適
用する場合は前者の方法ではグリセンチン配列内にもメ
チオニンが存在するためこのメチオニン部位でグリセン
チンが分解されてしまうことになる。又後者の方法では
グリセンチン配列内の蛋白分解酵素により分解され易い
部位が存在するため副生成物が多く、目的とするグリセ
ンチンの収率が悪い。更に目的ペプチドと他のペプチド
との融合蛋白質をアミノ末端から１アミノ酸ずつ加水分
解するアミノペプチダーゼや、カルボキシ末端から加水
分解するカルボキシペプチダーゼで処理して付加したペ
プチドを除き目的蛋白質を生産する方法も考えられる。
しかしこれらの酵素は基質特異性が低いので必要とする
部位で反応を停止するためには微妙な反応条件の調節を
行わねばならずしかも条件の調節が非常に困難であるた
めおよそ工業的な製法とはなり得ない。この様に従来知
られた方法では天然型グリセンチンを十分生産すること
が出来なかった。
質を製造する際は、アミノ末端に遺伝子翻訳開始コドン
ＡＴＧによりコードされるメチオニンが付加したペプチ
ドが得られる。ところが組換えＤＮＡ技術により製造し
た有用蛋白質を、医薬品、又は食品等として使用する場
合には、メチオニン残基の付加した有用蛋白質は、抗原
性をもたらす可能性があるためできる限り除去しておく
必要がある。そこで、メチオニンを切断して天然型蛋白
質を得る方法としては、ブロムシアンを用いてメチオニ
ンの部位で部位特異的に分解する化学的方法や、適当な
ペプチドと目的の天然型蛋白質の間に特定の部位特異的
蛋白質分解酵素の認識配列を挿入した融合蛋白質を作り
その酵素で部位特異的に加水分解する酵素的方法などが
ある。しかしながら、グリセンチンにこれらの方法を適
用する場合は前者の方法ではグリセンチン配列内にもメ
チオニンが存在するためこのメチオニン部位でグリセン
チンが分解されてしまうことになる。又後者の方法では
グリセンチン配列内の蛋白分解酵素により分解され易い
部位が存在するため副生成物が多く、目的とするグリセ
ンチンの収率が悪い。更に目的ペプチドと他のペプチド
との融合蛋白質をアミノ末端から１アミノ酸ずつ加水分
解するアミノペプチダーゼや、カルボキシ末端から加水
分解するカルボキシペプチダーゼで処理して付加したペ
プチドを除き目的蛋白質を生産する方法も考えられる。
しかしこれらの酵素は基質特異性が低いので必要とする
部位で反応を停止するためには微妙な反応条件の調節を
行わねばならずしかも条件の調節が非常に困難であるた
めおよそ工業的な製法とはなり得ない。この様に従来知
られた方法では天然型グリセンチンを十分生産すること
が出来なかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】これらの背景の基に本発
明者らはグリセンチンの生産方法につき研究を続けグリ
センチンのアミノ末端がアルギニンであることに着目
し、カテプシンＣが蛋白質のアミノ末端から２アミノ酸
ずつ加水分解するがアミノ末端に塩基性アミノ酸が現れ
るとそこで反応が停止しそれ以上の加水分解が起こらな
いことを利用して遺伝子組換え法により、カテプシンＣ
による加水分解時において偶数個のアミノ酸よりなる様
にペプチドをグリセンチンのアミノ末端側に付加した融
合蛋白質を生産し、かくして得られた融合グリセンチン
をカテプシンＣで加水分解して除去することにより効果
的に天然型グリセンチンを生産する方法を開発した。
明者らはグリセンチンの生産方法につき研究を続けグリ
センチンのアミノ末端がアルギニンであることに着目
し、カテプシンＣが蛋白質のアミノ末端から２アミノ酸
ずつ加水分解するがアミノ末端に塩基性アミノ酸が現れ
るとそこで反応が停止しそれ以上の加水分解が起こらな
いことを利用して遺伝子組換え法により、カテプシンＣ
による加水分解時において偶数個のアミノ酸よりなる様
にペプチドをグリセンチンのアミノ末端側に付加した融
合蛋白質を生産し、かくして得られた融合グリセンチン
をカテプシンＣで加水分解して除去することにより効果
的に天然型グリセンチンを生産する方法を開発した。
【０００７】更に詳細にその方法を説明するとグリセン
チンのアミノ末端側にペプチドを付加した融合グリセン
チンの遺伝子を宿主細胞で発現可能なプロモーターの下
流につないで作成したベクターで、この遺伝子を発現出
来る細胞を形質転換し、かくして得られた細胞を培養
し、必要に応じて遺伝子の誘導発現を行い、融合グリセ
ンチンを生産せしめ、更にグリセンチンのアミノ末端が
アルギニンであることに着目し、カテプシンＣがペプチ
ドをアミノ末端から２アミノ酸ずつ加水分解するがアミ
ノ末端に塩基性アミノ酸またはプロリンが現れるとそこ
で反応が停止しそれ以上の加水分解が起こらないことを
利用して、カテプシンＣによる加水分解時において偶数
個のアミノ酸よりなるペプチドをグリセンチンのアミノ
末端側に付加した融合蛋白質をカテプシンＣで加水分解
して除去することにより効果的に天然型グリセンチンを
生産するものである。
チンのアミノ末端側にペプチドを付加した融合グリセン
チンの遺伝子を宿主細胞で発現可能なプロモーターの下
流につないで作成したベクターで、この遺伝子を発現出
来る細胞を形質転換し、かくして得られた細胞を培養
し、必要に応じて遺伝子の誘導発現を行い、融合グリセ
ンチンを生産せしめ、更にグリセンチンのアミノ末端が
アルギニンであることに着目し、カテプシンＣがペプチ
ドをアミノ末端から２アミノ酸ずつ加水分解するがアミ
ノ末端に塩基性アミノ酸またはプロリンが現れるとそこ
で反応が停止しそれ以上の加水分解が起こらないことを
利用して、カテプシンＣによる加水分解時において偶数
個のアミノ酸よりなるペプチドをグリセンチンのアミノ
末端側に付加した融合蛋白質をカテプシンＣで加水分解
して除去することにより効果的に天然型グリセンチンを
生産するものである。
【０００８】遺伝子発現の為のプロモーターとしては、
バクテリオファージＴ７のφ１０プロモーターが用いら
れ、又、宿主細胞としてはプロモーターＴ７のφ１０が
発現するものであればどの様な細胞でも使用できるが大
腸菌が望ましい。
バクテリオファージＴ７のφ１０プロモーターが用いら
れ、又、宿主細胞としてはプロモーターＴ７のφ１０が
発現するものであればどの様な細胞でも使用できるが大
腸菌が望ましい。
【０００９】本発明のヒトグリセンチンの生産方法とし
ては、融合蛋白質が下記の配列Ｍｅｔ−Ａ−グリセンチ
ン（式中Ｍｅｔは翻訳開始コドンＡＴＧによりコードさ
れるメチオニンであり、ＡはＴ７ｓ１０ペプチドであ
る）で示されるアミノ酸配列をコードするように遺伝子
を構築し、融合蛋白質を生産する。この場合、融合蛋白
質のアミノ末端メチオニンが生産菌によりプロセッシン
グされて除かれるために、生成した融合蛋白質の付加さ
れたペプチド部分のアミノ酸数は偶数個となる。融合蛋
白質の付加されたペプチド、すなわちグリセンチンのア
ミノ末端に融合させるペプチドはグリセンチン生産を増
すものであって、Ｔ７ｓ１０ペプチドが用いられる。
ては、融合蛋白質が下記の配列Ｍｅｔ−Ａ−グリセンチ
ン（式中Ｍｅｔは翻訳開始コドンＡＴＧによりコードさ
れるメチオニンであり、ＡはＴ７ｓ１０ペプチドであ
る）で示されるアミノ酸配列をコードするように遺伝子
を構築し、融合蛋白質を生産する。この場合、融合蛋白
質のアミノ末端メチオニンが生産菌によりプロセッシン
グされて除かれるために、生成した融合蛋白質の付加さ
れたペプチド部分のアミノ酸数は偶数個となる。融合蛋
白質の付加されたペプチド、すなわちグリセンチンのア
ミノ末端に融合させるペプチドはグリセンチン生産を増
すものであって、Ｔ７ｓ１０ペプチドが用いられる。
【００１０】この融合グリセンチンの生産は、組換え遺
伝子技術の分野で周知の微生物、細胞を用いて行うこと
が出来、その典型例として大腸菌を宿主とし、これをグ
リセンチン遺伝子を挿入したプラスミドで形質変換した
形質変換体を用いて行われる。そしてこの大腸菌を用い
る場合には、φ１０プロモーターからグリセンチン遺伝
子を発現するためには大腸菌でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
が生産されることが必要である。Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼを大腸菌で生産させるためには大腸菌にＴ７バクテリ
オファージを感染させる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を有するプラスミドを保有する大腸菌を用いる、また
は染色体にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ
大腸菌を用いるなどによりこの要件を満たすことが出来
る。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現の制御のためには大腸
菌で発現制御できるよう構築したＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を染色体に組み込んだ大腸菌を用いるのが好ま
しい。この様な菌株としてEscherichia coli HMS174(DE
3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS、 Escherichia
coli HMS174(DE3)pLysE、 Escherichia coli BL21(DE
3)、 Escherichia coli BL21(DE3)pLysS、 Escherichia c
oli BL21(DE3)pLysE等が好ましく使用されるがこれらの
菌株は市販されており当業者は自由に入手することが出
来る。
伝子技術の分野で周知の微生物、細胞を用いて行うこと
が出来、その典型例として大腸菌を宿主とし、これをグ
リセンチン遺伝子を挿入したプラスミドで形質変換した
形質変換体を用いて行われる。そしてこの大腸菌を用い
る場合には、φ１０プロモーターからグリセンチン遺伝
子を発現するためには大腸菌でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
が生産されることが必要である。Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼを大腸菌で生産させるためには大腸菌にＴ７バクテリ
オファージを感染させる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を有するプラスミドを保有する大腸菌を用いる、また
は染色体にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ
大腸菌を用いるなどによりこの要件を満たすことが出来
る。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現の制御のためには大腸
菌で発現制御できるよう構築したＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を染色体に組み込んだ大腸菌を用いるのが好ま
しい。この様な菌株としてEscherichia coli HMS174(DE
3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS、 Escherichia
coli HMS174(DE3)pLysE、 Escherichia coli BL21(DE
3)、 Escherichia coli BL21(DE3)pLysS、 Escherichia c
oli BL21(DE3)pLysE等が好ましく使用されるがこれらの
菌株は市販されており当業者は自由に入手することが出
来る。
【００１１】グリセンチンの生産に用いる形質転換体を
炭素源、窒素源、微量栄養素、微量金属イオンなどを含
む培地で好気的に培養し、融合グリセンチンの生産を行
う。必要に応じてＴ７ＲＮＡポリメラーゼの誘導発現を
行って融合蛋白質を得る。培養培地は例えば大腸菌を使
用する場合に、この大腸菌がグリセンチンを生産するも
のならどのような培地でも良いがＭ９ＺＢ培地などが好
ましく、必要に応じ添加物などを加えても良い。菌体に
蓄積した融合グリセンチンは通常用いられるペプチドの
精製法を組み合わせて精製すれば良いが、その１方法と
して消化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI、３
９４〜４０１ページ（１９９２）に示される方法が好ま
しい。
炭素源、窒素源、微量栄養素、微量金属イオンなどを含
む培地で好気的に培養し、融合グリセンチンの生産を行
う。必要に応じてＴ７ＲＮＡポリメラーゼの誘導発現を
行って融合蛋白質を得る。培養培地は例えば大腸菌を使
用する場合に、この大腸菌がグリセンチンを生産するも
のならどのような培地でも良いがＭ９ＺＢ培地などが好
ましく、必要に応じ添加物などを加えても良い。菌体に
蓄積した融合グリセンチンは通常用いられるペプチドの
精製法を組み合わせて精製すれば良いが、その１方法と
して消化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI、３
９４〜４０１ページ（１９９２）に示される方法が好ま
しい。
【００１２】カテプシンＣを用いた融合型グリセンチン
の加水分解反応はこの酵素の反応に用いられる一般的な
反応条件で行えば良い。反応液には必要に応じ混入して
いる蛋白加水分解酵素活性を阻害するためにロイペプチ
ン、アンチパイン、キモスタチン、Ｅ−６４などのプロ
テアーゼインヒビターを加えても良い。
の加水分解反応はこの酵素の反応に用いられる一般的な
反応条件で行えば良い。反応液には必要に応じ混入して
いる蛋白加水分解酵素活性を阻害するためにロイペプチ
ン、アンチパイン、キモスタチン、Ｅ−６４などのプロ
テアーゼインヒビターを加えても良い。
【００１３】実施例１ 発現ベクターの構築 Ｔ７φ１０プロモーターの下流に融合グリセンチン遺伝
子を結合した発現ベクターの構築を行った。一連の実験
操作は一般的な遺伝子組換えの実験法（T. Maniatis,
E. F. Fritsch, J. Sambrook編Molecular Cloning A La
boratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor La
boratory Press社(1989）等参照）により行った。
子を結合した発現ベクターの構築を行った。一連の実験
操作は一般的な遺伝子組換えの実験法（T. Maniatis,
E. F. Fritsch, J. Sambrook編Molecular Cloning A La
boratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor La
boratory Press社(1989）等参照）により行った。
【００１４】グリセンチン遺伝子ＤＮＡを連結するため
Novagen社より入手したベクタープラスミドpET-3aのBam
HI認識配列の下流にStuＩ認識配列を挿入した。 ５′−ＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＴＡＧＧＣＣＴＴ−３′
(配列表・配列番号１)および ５′−ＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＣＴＡＡＧ−３′
(配列表・配列番号２) の配列の２種のオリゴヌクレオチドをMilliGen／Biosea
rch社製Cyclone Plus ＤＮＡ合成機で及び同社から供給
される合成試薬を用いて、付属の操作説明書により合成
した。オリゴヌクレオチドの精製はMilligen／Biosearc
h社製のOligo-PaKTMと付属のオリゴヌクレオチド精製マ
ニュアルに従い精製した。これ以下の実験に用いるオリ
ゴヌクレオチドの合成及び精製も全てのこの方法によっ
て行った。各々のオリゴヌクレオチド５μｇを宝酒造製
Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼで同社の反応条件によ
りリン酸化した。次いで両反応液を合わせて９０℃で５
分保温した後３時間かけて３０℃まで温度を下げてオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングを行った。プラスミドpE
T-3a（F. W. Studier et. al., Methods in Enzymology
１８５巻６０ページ〜８９ページ（１９９０)参照）を
Bam HIで加水分解し、次いで宝酒造製E. coliアルカリ
フォスターゼで同社の示す反応条件で脱リン酸化した。
得られた線状プラスミドとアニーリングしたオリゴヌク
レオチドを宝酒造製ＤＮＡライゲーションキットを用い
て同社のプロトコールに従ってライゲーションした。こ
のライゲーションしたＤＮＡを用いて塩化カルシウム法
によりE.coli JM109の形質転換を行い、アンピシリンを
５０μｇ/mlの濃度で含むＬＢ寒天培地で生育する形質
転換株を選択した。得られた形質転換株を５０μｇ／ml
のアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養を行い培養菌
体よりプラスミドを抽出精製した。得られたプラスミド
をStuＩで加水分解してアガロースゲル電気泳動を行う
ことにより本酵素による切断部位が存在するプラスミド
を選択した。これらのプラスミドの塩基配列をUnited S
tates Biochemical Corporation社製Sequenase version
２.０キットを用いて同社のプロトコールに従ってダイ
デオキシ法によって決定した。新たに得られたプラスミ
ドをpET110と命名した。pET110はBamHI認識配列の下流
に新たにStuＩ認識配列が存在することを確認した。pET
110のBam HI及びStuＩ認識配列間の塩基配列は配列表・
配列番号３に示す通りである。
Novagen社より入手したベクタープラスミドpET-3aのBam
HI認識配列の下流にStuＩ認識配列を挿入した。 ５′−ＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＴＡＧＧＣＣＴＴ−３′
(配列表・配列番号１)および ５′−ＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＣＴＡＡＧ−３′
(配列表・配列番号２) の配列の２種のオリゴヌクレオチドをMilliGen／Biosea
rch社製Cyclone Plus ＤＮＡ合成機で及び同社から供給
される合成試薬を用いて、付属の操作説明書により合成
した。オリゴヌクレオチドの精製はMilligen／Biosearc
h社製のOligo-PaKTMと付属のオリゴヌクレオチド精製マ
ニュアルに従い精製した。これ以下の実験に用いるオリ
ゴヌクレオチドの合成及び精製も全てのこの方法によっ
て行った。各々のオリゴヌクレオチド５μｇを宝酒造製
Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼで同社の反応条件によ
りリン酸化した。次いで両反応液を合わせて９０℃で５
分保温した後３時間かけて３０℃まで温度を下げてオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングを行った。プラスミドpE
T-3a（F. W. Studier et. al., Methods in Enzymology
１８５巻６０ページ〜８９ページ（１９９０)参照）を
Bam HIで加水分解し、次いで宝酒造製E. coliアルカリ
フォスターゼで同社の示す反応条件で脱リン酸化した。
得られた線状プラスミドとアニーリングしたオリゴヌク
レオチドを宝酒造製ＤＮＡライゲーションキットを用い
て同社のプロトコールに従ってライゲーションした。こ
のライゲーションしたＤＮＡを用いて塩化カルシウム法
によりE.coli JM109の形質転換を行い、アンピシリンを
５０μｇ/mlの濃度で含むＬＢ寒天培地で生育する形質
転換株を選択した。得られた形質転換株を５０μｇ／ml
のアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養を行い培養菌
体よりプラスミドを抽出精製した。得られたプラスミド
をStuＩで加水分解してアガロースゲル電気泳動を行う
ことにより本酵素による切断部位が存在するプラスミド
を選択した。これらのプラスミドの塩基配列をUnited S
tates Biochemical Corporation社製Sequenase version
２.０キットを用いて同社のプロトコールに従ってダイ
デオキシ法によって決定した。新たに得られたプラスミ
ドをpET110と命名した。pET110はBamHI認識配列の下流
に新たにStuＩ認識配列が存在することを確認した。pET
110のBam HI及びStuＩ認識配列間の塩基配列は配列表・
配列番号３に示す通りである。
【００１５】pGL5（消化管ホルモン研究会編集、消化管
ホルモンXI３９４ページ〜４０１ページ（１９９２）参
照）のグリセンチン遺伝子下流のPstＩ認識配列をSmaＩ
認識配列に変換した。 ５′−ＣＡＴＧＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＣＡ−３′
(配列表・配列番号４)及び ５′−ＡＧＣＴＴＧＴＧＣＴＧＴＣＣＣＧＧＧＣ−３′
(配列表・配列番号５) の配列の２種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記
と同様の方法で精製、リン酸化、及びアニーリングを行
った。pGL5をNcoＩ及びHind IIIで加水分解し、反応物
をアガロースゲル電気泳動で展開し、約４kbのバンドを
ゲルより抽出することにより目的断片を精製した。次い
でアニーリングしたオリゴヌクレオチドと精製した直鎖
状プラスミドをライゲーションした。ライゲーションし
たＤＮＡを用いてpET110作製の際と同様にE. coli JM10
9を形質転換した。pET110の際と同様に形質転換株より
プラスミドを抽出し精製した。得られたプラスミドをSm
aＩで加水分解し、本酵素による切断部位が存在するプ
ラスミドを選択した。これらのプラスミドの塩基配列の
決定を行い、目的の配列の存在するプラスミドを選択し
pGL44と命名した。新たに得られたプラスミドpGL44はグ
リセンチン遺伝子下流のPstＩの認識配列が失われ新た
にSmaＩ認識配列サイトが付加されていた。pGL44のグリ
センチン遺伝子下流の新たなSmaＩサイトを含むNcoＩ−
Hind III 間の塩基配列は配列表・配列番号６に示す通
りである。
ホルモンXI３９４ページ〜４０１ページ（１９９２）参
照）のグリセンチン遺伝子下流のPstＩ認識配列をSmaＩ
認識配列に変換した。 ５′−ＣＡＴＧＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＣＡ−３′
(配列表・配列番号４)及び ５′−ＡＧＣＴＴＧＴＧＣＴＧＴＣＣＣＧＧＧＣ−３′
(配列表・配列番号５) の配列の２種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記
と同様の方法で精製、リン酸化、及びアニーリングを行
った。pGL5をNcoＩ及びHind IIIで加水分解し、反応物
をアガロースゲル電気泳動で展開し、約４kbのバンドを
ゲルより抽出することにより目的断片を精製した。次い
でアニーリングしたオリゴヌクレオチドと精製した直鎖
状プラスミドをライゲーションした。ライゲーションし
たＤＮＡを用いてpET110作製の際と同様にE. coli JM10
9を形質転換した。pET110の際と同様に形質転換株より
プラスミドを抽出し精製した。得られたプラスミドをSm
aＩで加水分解し、本酵素による切断部位が存在するプ
ラスミドを選択した。これらのプラスミドの塩基配列の
決定を行い、目的の配列の存在するプラスミドを選択し
pGL44と命名した。新たに得られたプラスミドpGL44はグ
リセンチン遺伝子下流のPstＩの認識配列が失われ新た
にSmaＩ認識配列サイトが付加されていた。pGL44のグリ
センチン遺伝子下流の新たなSmaＩサイトを含むNcoＩ−
Hind III 間の塩基配列は配列表・配列番号６に示す通
りである。
【００１６】pGL44のグリセンチン遺伝子５′末端領域
の改変を行った。 5′-AATTCAGATCTATCGAAGGTCGACGTTCTCTGCA-3′(配列表
・配列番号７) 及び5′-GAGAACGTCGACCTTCGATAGACTG-3′(配列表・配列
番号８) の２種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記と同様
な方法で精製、リン酸化、及びアニーリングした。pGL4
4をEco RI及びPstＩで加水分解した後上記と同様に脱リ
ン酸化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドとライ
ゲーションした。アニーリングしたＤＮＡを用いてE. c
oli JM109を形質転換した。形質転換株よりプラスミド
を抽出しBgl IIで処理し新たに本酵素により切断される
プラスミドを選択した。これらのプラスミドの塩基配列
の決定を行い、目的の塩基配列を持つプラスミドをpGL1
22と命名した。pGL122はpGL44のEco RI〜PstＩサイトに
合成オリゴヌクレオチドが挿入されたものであることを
確認した。pGL122の改変された部位の塩基配列を配列表
・配列番号９に示す。
の改変を行った。 5′-AATTCAGATCTATCGAAGGTCGACGTTCTCTGCA-3′(配列表
・配列番号７) 及び5′-GAGAACGTCGACCTTCGATAGACTG-3′(配列表・配列
番号８) の２種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記と同様
な方法で精製、リン酸化、及びアニーリングした。pGL4
4をEco RI及びPstＩで加水分解した後上記と同様に脱リ
ン酸化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドとライ
ゲーションした。アニーリングしたＤＮＡを用いてE. c
oli JM109を形質転換した。形質転換株よりプラスミド
を抽出しBgl IIで処理し新たに本酵素により切断される
プラスミドを選択した。これらのプラスミドの塩基配列
の決定を行い、目的の塩基配列を持つプラスミドをpGL1
22と命名した。pGL122はpGL44のEco RI〜PstＩサイトに
合成オリゴヌクレオチドが挿入されたものであることを
確認した。pGL122の改変された部位の塩基配列を配列表
・配列番号９に示す。
【００１７】pGL122をBgl II及びSmaＩで加水分解し、
グリセンチン遺伝子を含むＤＮＡ断片の精製を行った。
pET110をBam HI及びStuＩで加水分解した後脱リン酸化
した。これをグリセンチン遺伝子を含むＤＮＡ断片と混
合しＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。反応
物をE. coli JM109と混合し形質転換を行い新たにプラ
スミドpGL125を得た。pGL125はＴ７φ１０プロモーター
の下流にＴ７ ｓ１０ペプチド、挿入アミノ酸配列及び
グリセンチンの融合蛋白質遺伝子が連結した発現ベクタ
ーである。pGL125構築の過程を簡単に図１に示した。
グリセンチン遺伝子を含むＤＮＡ断片の精製を行った。
pET110をBam HI及びStuＩで加水分解した後脱リン酸化
した。これをグリセンチン遺伝子を含むＤＮＡ断片と混
合しＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。反応
物をE. coli JM109と混合し形質転換を行い新たにプラ
スミドpGL125を得た。pGL125はＴ７φ１０プロモーター
の下流にＴ７ ｓ１０ペプチド、挿入アミノ酸配列及び
グリセンチンの融合蛋白質遺伝子が連結した発現ベクタ
ーである。pGL125構築の過程を簡単に図１に示した。
【００１８】参考例１ Met-Arg付加グリセンチン遺伝子の構築 Ａ） pGL144の構築 pUC18を制限酵素DraＩで切断しアガロース電気泳動を行
って、アンピシリン耐性遺伝子を含む断片を精製した。
pGL125を制限酵素DraＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動を行ってアンピシリン耐性遺伝子を含まない断片を
精製した。それぞれの断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
用いてライゲーション反応を行った。反応産物を大腸菌
JM109株のコンピテントセルに導入し、アンピシリンを
含む選択培地上で形質転換体を選択した。
って、アンピシリン耐性遺伝子を含む断片を精製した。
pGL125を制限酵素DraＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動を行ってアンピシリン耐性遺伝子を含まない断片を
精製した。それぞれの断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
用いてライゲーション反応を行った。反応産物を大腸菌
JM109株のコンピテントセルに導入し、アンピシリンを
含む選択培地上で形質転換体を選択した。
【００１９】得られた形質転換体より定法に従ってプラ
スミドを抽出し、制限酵素切断地図を作成し目的のプラ
スミドが構築されていることを確認し、このプラスミド
をpGL144とした。pGL144構築過程を簡単に図２に示し
た。
スミドを抽出し、制限酵素切断地図を作成し目的のプラ
スミドが構築されていることを確認し、このプラスミド
をpGL144とした。pGL144構築過程を簡単に図２に示し
た。
【００２０】Ｂ） pGL146の構築 Ａ）で構築したpGL144を制限酵素NdeＩとPstＩで切断
し、ここに合成ＤＮＡリンカーを挿入した。合成ＤＮＡ
リンカーの配列を以下に示す。 ５′−ＴＡＴＧＣＧＴＣＧＴＴＣＣＣＴＧＣＡ−３′
(配列表・配列番号１０)および ５′−ＧＧＧＡＡＣＧＡＣＧＣＡ−３′(配列表・配列
番号１１)
し、ここに合成ＤＮＡリンカーを挿入した。合成ＤＮＡ
リンカーの配列を以下に示す。 ５′−ＴＡＴＧＣＧＴＣＧＴＴＣＣＣＴＧＣＡ−３′
(配列表・配列番号１０)および ５′−ＧＧＧＡＡＣＧＡＣＧＣＡ−３′(配列表・配列
番号１１)
【００２１】それぞれの合成ＤＮＡ２μｇをＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで両反応液を
合わせて９４℃で５分加熱した後１時間で室温まで温度
を下げてアニーリングを行った。このようにして作成し
た合成ＤＮＡリンカーと、制限酵素NdeＩとPstＩで切断
しアガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状のpGL1
44を宝酒造のＤＮＡライゲーションキットを用いて、結
合した。この結合したＤＮＡを大腸菌JM109株のコンピ
テントセルに導入し、アンピシリンを含む選択培地上で
形質転換体を選択した。得られた形質転換体より定法に
従ってプラスミドを抽出し、サンガーらのダイデオキシ
法により目的の塩基配列を有していることを確認し、こ
のプラスミドをpGL146とした。pGL146構築過程を簡単に
図３に示した。
クレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで両反応液を
合わせて９４℃で５分加熱した後１時間で室温まで温度
を下げてアニーリングを行った。このようにして作成し
た合成ＤＮＡリンカーと、制限酵素NdeＩとPstＩで切断
しアガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状のpGL1
44を宝酒造のＤＮＡライゲーションキットを用いて、結
合した。この結合したＤＮＡを大腸菌JM109株のコンピ
テントセルに導入し、アンピシリンを含む選択培地上で
形質転換体を選択した。得られた形質転換体より定法に
従ってプラスミドを抽出し、サンガーらのダイデオキシ
法により目的の塩基配列を有していることを確認し、こ
のプラスミドをpGL146とした。pGL146構築過程を簡単に
図３に示した。
【００２２】実施例２ ｓ１０−ペプチド付加グリセン
チン遺伝子の構築 F. W. Studier, et.al., Methods in Enzymology, 185,
74頁(1990)に示されたｓ１０ペプチドのＮ末端側の翻
訳開始コドンＡＴＧに対応するメチオニンを含み１１ア
ミノ酸よりなるペプチドとグリセンチンとの融合蛋白質
の遺伝子の構築を行った。参考例１−Ａ）で構築したpG
L144を制限酵素NdeＩとPstＩで切断し、ここに合成ＤＮ
Ａリンカーを挿入した。合成ＤＮＡリンカーの配列を以
下に示す。 5′-TATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGTTCCCTGCA-
3′(配列表・配列番号12) および 5′-GGGAACGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCA-3′(配
列表・配列番号13)
チン遺伝子の構築 F. W. Studier, et.al., Methods in Enzymology, 185,
74頁(1990)に示されたｓ１０ペプチドのＮ末端側の翻
訳開始コドンＡＴＧに対応するメチオニンを含み１１ア
ミノ酸よりなるペプチドとグリセンチンとの融合蛋白質
の遺伝子の構築を行った。参考例１−Ａ）で構築したpG
L144を制限酵素NdeＩとPstＩで切断し、ここに合成ＤＮ
Ａリンカーを挿入した。合成ＤＮＡリンカーの配列を以
下に示す。 5′-TATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGTTCCCTGCA-
3′(配列表・配列番号12) および 5′-GGGAACGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCA-3′(配
列表・配列番号13)
【００２３】それぞれの合成ＤＮＡ２μｇをＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで両反応液を
合わせて９５℃で５分加熱した後、１時間で室温まで温
度を下げてアニーリングを行った。このようにして作成
した合成ＤＮＡリンカーと、制限酵素NdeＩとPstＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状の
pGL144を宝酒造のＤＮＡライゲーションキットを用い
て、結合した。この結合したＤＮＡを大腸菌JM109株の
コンピテントセルに導入し、アンピシリンを含む選択培
地上で形質転換体を選択した。得られた形質転換体より
定法に従ってプラスミドを抽出し、サンガーらのダイデ
オキシ法により目的の塩基配列を有していることを確認
し、このプラスミドをpGL145とした。pGL145構築過程を
図４に示す。
クレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで両反応液を
合わせて９５℃で５分加熱した後、１時間で室温まで温
度を下げてアニーリングを行った。このようにして作成
した合成ＤＮＡリンカーと、制限酵素NdeＩとPstＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状の
pGL144を宝酒造のＤＮＡライゲーションキットを用い
て、結合した。この結合したＤＮＡを大腸菌JM109株の
コンピテントセルに導入し、アンピシリンを含む選択培
地上で形質転換体を選択した。得られた形質転換体より
定法に従ってプラスミドを抽出し、サンガーらのダイデ
オキシ法により目的の塩基配列を有していることを確認
し、このプラスミドをpGL145とした。pGL145構築過程を
図４に示す。
【００２４】参考例２ 融合グリセンチンの生産 pGL146で大腸菌HMS174(DE3)pLysSを形質転換し融合グリ
センチン生産能を有する形質転換体を得た。この形質転
換体を培地１リットル当たりＮＺ−アミン１０ｇ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、Ｎａ2
ＨＰＯ4 ６ｇ、グルコース４ｇ、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ ２
６４mgを含む培地に接種し３７℃で振盪培養した。菌体
濃度がＡ550＝０.６の時点でイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシドを終濃度０.５mMとなるよう加え
てさらに２.５時間培養した。菌体に蓄積した融合グリ
センチンの量をグリセンチンのアミノ末端に対する抗体
とカルボキシ末端に対する抗体を用いた酵素免疫測定法
（消化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI、３５
８〜３６３ページ参照）により測定したところ培養液１
リットル当たりグリセンチン換算で３０mgだった。培養
液１リットルの菌体より消化管ホルモン研究会編集、消
化管ホルモンXI、３９４〜４０１ページ（１９９２）に
記載した方法で融合グリセンチンを精製し精製標品７.
３mgを得た。
センチン生産能を有する形質転換体を得た。この形質転
換体を培地１リットル当たりＮＺ−アミン１０ｇ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、Ｎａ2
ＨＰＯ4 ６ｇ、グルコース４ｇ、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ ２
６４mgを含む培地に接種し３７℃で振盪培養した。菌体
濃度がＡ550＝０.６の時点でイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシドを終濃度０.５mMとなるよう加え
てさらに２.５時間培養した。菌体に蓄積した融合グリ
センチンの量をグリセンチンのアミノ末端に対する抗体
とカルボキシ末端に対する抗体を用いた酵素免疫測定法
（消化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI、３５
８〜３６３ページ参照）により測定したところ培養液１
リットル当たりグリセンチン換算で３０mgだった。培養
液１リットルの菌体より消化管ホルモン研究会編集、消
化管ホルモンXI、３９４〜４０１ページ（１９９２）に
記載した方法で融合グリセンチンを精製し精製標品７.
３mgを得た。
【００２５】精製標品をペプチドシークエンサーにかけ
てアミノ末端側５個のアミノ酸の配列を調べたところＭ
ｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−の配列が得ら
れ、天然型グリセンチンのアミノ末端側に設計した通り
２個のアミノ酸が付加した融合型グリセンチンであっ
た。
てアミノ末端側５個のアミノ酸の配列を調べたところＭ
ｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−の配列が得ら
れ、天然型グリセンチンのアミノ末端側に設計した通り
２個のアミノ酸が付加した融合型グリセンチンであっ
た。
【００２６】実施例３ pGL145で大腸菌HMS174(DE3)pLysSを形質転換し、融合型
グリセンチン生産能を有する形質転換体を得た。この形
質転換体を参考例２と同様の条件下で培養および融合型
グリセンチンの精製を行い、参考例２に記載されている
方法に従って、菌体内に蓄積した融合型グリセンチンの
量と精製した融合型グリセンチンの量を測定した。菌体
内に蓄積した融合型グリセンチンは、培養液１リットル
当たり９０mgであった。精製した融合型グリセンチン
は、２２mgであった。
グリセンチン生産能を有する形質転換体を得た。この形
質転換体を参考例２と同様の条件下で培養および融合型
グリセンチンの精製を行い、参考例２に記載されている
方法に従って、菌体内に蓄積した融合型グリセンチンの
量と精製した融合型グリセンチンの量を測定した。菌体
内に蓄積した融合型グリセンチンは、培養液１リットル
当たり９０mgであった。精製した融合型グリセンチン
は、２２mgであった。
【００２７】精製標品をペプチドシークエンサーにかけ
てアミノ末端側の１３アミノ酸の配列を調べたところ配
列はＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−であり、天然型グリセンチンのアミノ末端側に
ｓ１０ペプチドのＮ末端側の１０個のアミノ酸が付加し
た融合型グリセンチンであった。
てアミノ末端側の１３アミノ酸の配列を調べたところ配
列はＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−であり、天然型グリセンチンのアミノ末端側に
ｓ１０ペプチドのＮ末端側の１０個のアミノ酸が付加し
た融合型グリセンチンであった。
【００２８】参考例３ 天然型グリセンチンの調製 カテプシンＣの基質としては、Ｍｅｔ−Ａｒｇ付加グリ
センチンを用いた。基質である融合型グリセンチン１５
mgを終濃度１mg／mlとなるように５０mM酢酸ナトリウム
（pH５.０）５mM ＮａＣｌ ５mM ＤＴＴを含む溶液の中
に溶かした。この溶液にベーリンガー・マンハイム・山
之内社のカテプシンＣ（２０units／ml）を３unit加え
た。さらに夾雑プロテアーゼによる非特異的切断を押さ
えるためにロイペプチンを終濃度２５μＭとなるように
添加した。２２℃で１時間反応した後、ＯＤＳカラムを
用いる逆相ＨＰＬＣにより保持時間１１.２７分の主ピ
ークを分離回収した。分離条件は、流速１.０ml／分、
モニター２２０nm、ＧＬサイエンス社製Inertsil ＯＤ
Ｓ−２カラム（４.６×２５０mm）、Ａ液；２０％アセ
トニトリル＋０.００２Ｍ ＨＣｌ、Ｂ液；４０％アセト
ニトリル＋０.００２Ｍ ＨＣｌで２０分間の直線グラジ
エントである。
センチンを用いた。基質である融合型グリセンチン１５
mgを終濃度１mg／mlとなるように５０mM酢酸ナトリウム
（pH５.０）５mM ＮａＣｌ ５mM ＤＴＴを含む溶液の中
に溶かした。この溶液にベーリンガー・マンハイム・山
之内社のカテプシンＣ（２０units／ml）を３unit加え
た。さらに夾雑プロテアーゼによる非特異的切断を押さ
えるためにロイペプチンを終濃度２５μＭとなるように
添加した。２２℃で１時間反応した後、ＯＤＳカラムを
用いる逆相ＨＰＬＣにより保持時間１１.２７分の主ピ
ークを分離回収した。分離条件は、流速１.０ml／分、
モニター２２０nm、ＧＬサイエンス社製Inertsil ＯＤ
Ｓ−２カラム（４.６×２５０mm）、Ａ液；２０％アセ
トニトリル＋０.００２Ｍ ＨＣｌ、Ｂ液；４０％アセト
ニトリル＋０.００２Ｍ ＨＣｌで２０分間の直線グラジ
エントである。
【００２９】主ピークのペプチドを回収し、アミノ末端
の配列をペプチドシークエンサーで解析した結果、天然
型グリセンチンの配列であるＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−が得られた。また回収した主
ピークを定法に従いベーリンガー・マンハイム・山之内
社製のリシルエンドペプチダーゼで切断し、ＨＰＬＣに
より分離してペプチドマッピングを行った。分離条件は
下記の通りである。流速１.０ml／分、モニター２２０n
m、ＧＬサイエンス社製Inertsil ＯＤＳ−２カラム
（４.６×２５０mm）、Ａ液；０.０５％トリフルオロ酢
酸水溶液、Ｂ液；８０％アセトニトリル＋０.０５％ト
リフルオロ酢酸水溶液で、Ａ液とＢ液の割合を６０分間
でＡ液１００％、Ｂ液０％からＡ液２０％、Ｂ液８０％
に直線的に変えてＨＰＬＣを行った。ＨＰＬＣのクロマ
トグラムを図５に示した。
の配列をペプチドシークエンサーで解析した結果、天然
型グリセンチンの配列であるＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−が得られた。また回収した主
ピークを定法に従いベーリンガー・マンハイム・山之内
社製のリシルエンドペプチダーゼで切断し、ＨＰＬＣに
より分離してペプチドマッピングを行った。分離条件は
下記の通りである。流速１.０ml／分、モニター２２０n
m、ＧＬサイエンス社製Inertsil ＯＤＳ−２カラム
（４.６×２５０mm）、Ａ液；０.０５％トリフルオロ酢
酸水溶液、Ｂ液；８０％アセトニトリル＋０.０５％ト
リフルオロ酢酸水溶液で、Ａ液とＢ液の割合を６０分間
でＡ液１００％、Ｂ液０％からＡ液２０％、Ｂ液８０％
に直線的に変えてＨＰＬＣを行った。ＨＰＬＣのクロマ
トグラムを図５に示した。
【００３０】それぞれのピークを分取し、気相式自動ペ
プチドシークエンサー（ＰＳＱ−１、島津製作所）によ
り解析したところピークａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅの画分はア
ミノ酸配列が配列表・配列番号１４、１５、１６、１
７、１８に示したものであり、それぞれがグリセンチン
の６３−６９、１−９、３２−４４、１０−３１、４５
−６２の部分に相当した。これにより得られたペプチド
は天然型グリセンチンの全構造を保持していることが確
認された。
プチドシークエンサー（ＰＳＱ−１、島津製作所）によ
り解析したところピークａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅの画分はア
ミノ酸配列が配列表・配列番号１４、１５、１６、１
７、１８に示したものであり、それぞれがグリセンチン
の６３−６９、１−９、３２−４４、１０−３１、４５
−６２の部分に相当した。これにより得られたペプチド
は天然型グリセンチンの全構造を保持していることが確
認された。
【００３１】実施例４ 天然型グリセンチンの調製 カテプシンＣの基質としてはｓ１０−ペプチド付加グリ
センチンを用いた。基質である融合型グリセンチン１５
mgを終濃度１mg／mlとなるように５０mM酢酸ナトリウム
（pH５.０）５mM ＮａＣｌ ５mM ＤＴＴを含む溶液の中
に溶かした。この溶液にベーリンガー・マンハイム・山
之内社のカテプシンＣ（２０units／ml）を３unit加え
た。さらに夾雑プロテアーゼによる非特異的切断を押さ
えるためにロイペプチンを終濃度２５μＭとなるように
添加した。２２℃で１時間反応した後、ＯＤＳカラムを
用いる逆相ＨＰＬＣにより主ピークを分離回収した。分
離条件は、参考例３と同一である。
センチンを用いた。基質である融合型グリセンチン１５
mgを終濃度１mg／mlとなるように５０mM酢酸ナトリウム
（pH５.０）５mM ＮａＣｌ ５mM ＤＴＴを含む溶液の中
に溶かした。この溶液にベーリンガー・マンハイム・山
之内社のカテプシンＣ（２０units／ml）を３unit加え
た。さらに夾雑プロテアーゼによる非特異的切断を押さ
えるためにロイペプチンを終濃度２５μＭとなるように
添加した。２２℃で１時間反応した後、ＯＤＳカラムを
用いる逆相ＨＰＬＣにより主ピークを分離回収した。分
離条件は、参考例３と同一である。
【００３２】保持時間１１.４４分の主ピークを採集し
アミノ末端の配列をペプチドシークエンサーで解析した
結果、天然型グリセンチンの配列であるＡｒｇ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−が得られた。また
回収した主ピークを定法に従いリシルエンドペプチダー
ゼで切断し、ペプチドマッピングを行った。ＨＰＬＣの
クロマトグラムは図５と同様であった。各断片のアミノ
酸配列をペプチドシークエンサーを用いて解析したとこ
ろ、天然型グリセンチンの全構造を保持していることが
確認された。
アミノ末端の配列をペプチドシークエンサーで解析した
結果、天然型グリセンチンの配列であるＡｒｇ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−が得られた。また
回収した主ピークを定法に従いリシルエンドペプチダー
ゼで切断し、ペプチドマッピングを行った。ＨＰＬＣの
クロマトグラムは図５と同様であった。各断片のアミノ
酸配列をペプチドシークエンサーを用いて解析したとこ
ろ、天然型グリセンチンの全構造を保持していることが
確認された。
【００３３】次に、比較のために同様のヒト型グリセン
チンのアミノ末端側にペプチドが付加した融合グリセン
チンについて、ファクターＸａまたはエンテロキナーゼ
を用いて加水分解する方法を参考例として示す。
チンのアミノ末端側にペプチドが付加した融合グリセン
チンについて、ファクターＸａまたはエンテロキナーゼ
を用いて加水分解する方法を参考例として示す。
【００３４】参考例４ ヒト型グリセンチンのアミノ末端側にＡｌａ−Ｓｅｒ−
Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｇｎ−Ｍ
ｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの配列を有するペプチドが付加した
融合グリセンチンをファクターＸａで加水分解した。基
質の融合グリセンチン１００μｇを２mMＣａＣｌ2を含
む２０mMトリスー塩酸緩衝液（pH８.０）２００μｌに
溶解し、ファクターＸａを０.０８unit加えた。２８℃
で２時間反応した後実施例５と同一条件下でＨＰＬＣを
行い、２種の反応生成物を得た。生成物のアミノ末端側
のアミノ酸配列を気相シーケンサーにより解析したとこ
ろ、生成物の一方のアミノ末端側１０アミノ酸の配列は
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒであり、グリセンチンの
アミノ末端側１０アミノ酸の配列と一致した。他の生成
物のアミノ末端側１０アミノ酸の配列はＳｅｒ−Ｐｈｅ
−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕで、グリセンチンのアミノ末端から１２
番目のアミノ酸以降の１０アミノ酸の配列と一致した。
即ちファクターＸａはグリセンチンの１１番目のアミノ
酸Ａｒｇと１２番目のアミノ酸Ｓｅｒの間を加水分解し
てアミノ末端側１１アミノ酸が欠損した不完全なグリセ
ンチンを生ずる。反応中の融合グリセンチン、グリセン
チン、アミノ末端欠損グリセンチンの量の変化を経時的
に調べた。結果を次の表に示した。
Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｇｎ−Ｍ
ｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの配列を有するペプチドが付加した
融合グリセンチンをファクターＸａで加水分解した。基
質の融合グリセンチン１００μｇを２mMＣａＣｌ2を含
む２０mMトリスー塩酸緩衝液（pH８.０）２００μｌに
溶解し、ファクターＸａを０.０８unit加えた。２８℃
で２時間反応した後実施例５と同一条件下でＨＰＬＣを
行い、２種の反応生成物を得た。生成物のアミノ末端側
のアミノ酸配列を気相シーケンサーにより解析したとこ
ろ、生成物の一方のアミノ末端側１０アミノ酸の配列は
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒであり、グリセンチンの
アミノ末端側１０アミノ酸の配列と一致した。他の生成
物のアミノ末端側１０アミノ酸の配列はＳｅｒ−Ｐｈｅ
−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕで、グリセンチンのアミノ末端から１２
番目のアミノ酸以降の１０アミノ酸の配列と一致した。
即ちファクターＸａはグリセンチンの１１番目のアミノ
酸Ａｒｇと１２番目のアミノ酸Ｓｅｒの間を加水分解し
てアミノ末端側１１アミノ酸が欠損した不完全なグリセ
ンチンを生ずる。反応中の融合グリセンチン、グリセン
チン、アミノ末端欠損グリセンチンの量の変化を経時的
に調べた。結果を次の表に示した。
【００３５】
【表１】 反応時間 融合グリセンチン グリセンチン アミノ末端欠損グリセンチン １時間 ５６.８％ ３２.１％ １１.１％ ２時間 ３６.８ ３４.５ ２８.７ ４時間 ２.５ ３３.５ ６４.０
【００３６】反応により生ずるグリセンチンは最初に添
加した融合グリセンチンの３５％以下で、ファクターＸ
ａによるグリセンチンの生産法はカテプシンＣを用いた
方法より劣る。
加した融合グリセンチンの３５％以下で、ファクターＸ
ａによるグリセンチンの生産法はカテプシンＣを用いた
方法より劣る。
【００３７】参考例５ 参考例４と同一の融合グリセンチンをエンテロキナーゼ
で加水分解した。基質の融合グリセンチン１００μｇを
１０mM ＣａＣｌ2を含有する４０mM酢酸ナトリウム緩衝
液（pH５.０）１mlに溶解し、エンテロキナーゼ１unit
を加えた。３７℃で３時間反応した後参考例３と同一条
件下でＨＰＬＣを行い生成物を分析したところ、少なく
とも６個の断片に切断されていた。エンテロキナーゼは
グリセンチンを非特異的に加水分解するのでグリセンチ
ンの生産には不適当である。
で加水分解した。基質の融合グリセンチン１００μｇを
１０mM ＣａＣｌ2を含有する４０mM酢酸ナトリウム緩衝
液（pH５.０）１mlに溶解し、エンテロキナーゼ１unit
を加えた。３７℃で３時間反応した後参考例３と同一条
件下でＨＰＬＣを行い生成物を分析したところ、少なく
とも６個の断片に切断されていた。エンテロキナーゼは
グリセンチンを非特異的に加水分解するのでグリセンチ
ンの生産には不適当である。
【００３８】
配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GATCCTTAGC GTAGGCCTT
【００３９】 配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GATCAAGGCC TACGCTAAG
【００４０】 配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 ＤＮＡ 配列： GGATCCTTAG CGTAGGCCT
【００４１】 配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CATGGCCCGG GACAGCACA
【００４２】 配列番号：５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AGCTTGTGCT GTCCCGGGC
【００４３】 配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 ＤＮＡ 配列： CCATGGCCCG GGACAGCAAG CTT
【００４４】 配列番号：７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AATTCAGATC TATCGAAGGT CGACGTTCTC TGCA
【００４５】 配列番号：８ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GAGAACGTCG ACCTTCGATA GACTG
【００４６】 配列番号：９ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 ＤＮＡ 配列：
【００４７】 配列番号：１０ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TATGCGTCGT TCCCTGCA
【００４８】 配列番号：１１ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GGGAACGACG CA
【００４９】 配列番号：１２ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TATGGCTAGC ATGACTGGTG GACAGCAAAT GGGTCGTTCC CTGCA
【００５０】 配列番号：１３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GGGAACGACC CATTTGCTGT CCACCAGTCA TGCTAGCCA
【００５１】 配列番号：１４ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala
【００５２】 配列番号：１５ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Arg-Ser-Leu-Gln-Asp-Thr-Glu-Glu-Lys
【００５３】 配列番号：１６ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Arg-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ly
s
s
【００５４】 配列番号：１７ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ser-Arg-Ser-Phe-Ser-Ala-Ser-Gln-Ala-Asp-Pro-Leu-Se
r-Asp-Pro-Asp-Gln-Met-Asn-Glu-Asp-Lys
r-Asp-Pro-Asp-Gln-Met-Asn-Glu-Asp-Lys
【００５５】 配列番号：１８ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Tr
p-Leu-Met-Asn-Thr-Lys
p-Leu-Met-Asn-Thr-Lys
【図１】プラスミドpGL125の構築過程を示す図。
【図２】プラスミドpGL144の構築過程を示す図。
【図３】プラスミドpGL146の構築過程を示す図。
【図４】プラスミドpGL145の構築過程を示す図。
【図５】カテプシンＣ処理後の精製物をリシルエンドペ
プチダーゼで処理した加水分解物の高速液体クロマトグ
ラムを示す図。
プチダーゼで処理した加水分解物の高速液体クロマトグ
ラムを示す図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/00 A61K 38/00 C07K 14/575 C12N 15/00 C12P 21/00
Claims (1)
- 【請求項１】 ヒトグリセンチンのアミノ末端に付加ペ
プチドが結合した式Ｍｅｔ−Ａ−グリセンチン （式中、Ｍｅｔは翻訳開始コドンＡＴＧによりコードさ
れるメチオニンであり、ＡはＴ７ｓ１０ペプチドであ
る）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含み、大腸菌
にて該遺伝子の発現を指令できる組換えベクターで形質
転換された該グリセンチン融合蛋白質を発現できる菌株
を培養してグリセンチン融合蛋白質を生産し、次いでカ
テプシンＣによる加水分解で付加ペプチドを切断して天
然型ヒトグリセンチンを得ることを特徴とするヒトグリ
センチンの生産方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5334126A JP2887060B2 (ja) | 1993-06-30 | 1993-12-28 | グリセンチンの生産方法 |
| EP94304707A EP0635573A3 (en) | 1993-06-30 | 1994-06-28 | Process for the production of native, human glicentin. |
| KR1019940014950A KR950000878A (ko) | 1993-06-30 | 1994-06-28 | 천연의 사람 글리센틴의 제조방법 |
| CA002127068A CA2127068A1 (en) | 1993-06-30 | 1994-06-29 | Process for the preparation of native human glicentin |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16097793 | 1993-06-30 | ||
| JP5-160977 | 1993-06-30 | ||
| JP5334126A JP2887060B2 (ja) | 1993-06-30 | 1993-12-28 | グリセンチンの生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07135993A JPH07135993A (ja) | 1995-05-30 |
| JP2887060B2 true JP2887060B2 (ja) | 1999-04-26 |
Family
ID=26487272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5334126A Expired - Fee Related JP2887060B2 (ja) | 1993-06-30 | 1993-12-28 | グリセンチンの生産方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0635573A3 (ja) |
| JP (1) | JP2887060B2 (ja) |
| KR (1) | KR950000878A (ja) |
| CA (1) | CA2127068A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2729159B2 (ja) * | 1994-10-31 | 1998-03-18 | 日清製粉株式会社 | ヒトグリセンチンのモノクローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマおよびそれを用いるヒトグリセンチンの定量法 |
| US5702922A (en) | 1994-11-29 | 1997-12-30 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Method for the extraction of glicentin or glicentin analogous substances |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| JPH04364199A (ja) * | 1990-08-15 | 1992-12-16 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | ヒト型グリセンチンの合成遺伝子 |
| FR2673952A1 (fr) * | 1991-03-14 | 1992-09-18 | Inst Nat Sante Rech Med | Moyens pour le diagnostic in vitro de constituants de granules cytoplasmiques et applications biologiques. |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP5334126A patent/JP2887060B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-06-28 KR KR1019940014950A patent/KR950000878A/ko not_active Application Discontinuation
- 1994-06-28 EP EP94304707A patent/EP0635573A3/en not_active Withdrawn
- 1994-06-29 CA CA002127068A patent/CA2127068A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR950000878A (ko) | 1995-01-03 |
| JPH07135993A (ja) | 1995-05-30 |
| EP0635573A3 (en) | 1995-05-03 |
| EP0635573A2 (en) | 1995-01-25 |
| CA2127068A1 (en) | 1994-12-31 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |