NO331376B1

NO331376B1 - DNA-molekyl kodende for fusjonsproteiner der den N-terminale delen er et hirudinderivat for fremstilling av rekombinante proteiner via sekresjon fra gjaer, samt multikopivektor, plasmid, vertscelle og fremgangsmater for fermentering og fremstilling

Info

Publication number: NO331376B1
Application number: NO20033672A
Authority: NO
Inventors: Paul Habermann
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2003-08-19
Publication date: 2011-12-12
Also published as: JP2004518446A; NO20033672L; IL157416A0; AU2002250903B2; HK1065068A1; CN1279171C; CA2439042A1; CY1106274T1; CA2439042C; WO2002070722A1; DE60215315T2; DK1364032T3; ATE342367T1; IL157416A; PE20020857A1; PT1364032E; NZ527642A; BR0207379A; DE60215315D1; KR100858833B1

Abstract

Oppfinnelsen angår en ekspresjonskassett på formen Px-Sx-Bn-(ZR)-Hir (AsmR)-protein (Y) - T, der Px er en hvilken som helst promoter DNA-sekvens utvalgt på en slik måte at optimale utbytter av proteinet av interesse blir oppnåelig, Sx er et hvilket som helst DNA som koder for en signalsekvens eller en ledersekvens som muliggjør optimale utbytter, Bn er 1 -15 aminosyrekodoner eller en kjemisk binding, Z er kodonet for en aminosyre utvalgt fra gruppen omfattende Lys og Arg, R er et Arg kodon eller en kjemisk binding, Asm er en kjemisk binding eller m aminosyrekodoner der m = 1- 10; Hir er en DNA-sekvens koder for hirudin eller et hirudinderivat som er minst 40% homologt med naturlig hirudin, protein Y er en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst protein som kan fremstilles og utskilles av gjær, T er en utranslatert DNA-sekvens som er hensiktsmessig for ekspresjonen.

Description

Utvikling av optimaliserte prosesser for å fremstille farmasøytiske midler på basis av rekombinante proteiner er en oppgave som tilfredsstiller de følgende punkter. Først bør fremgangsmåten være så kostnads effektiv som mulig og for det andre bør produktet være av den høyeste renhet. I denne forbindelse bestemmer valg av ekspresjonssystem forløpet for den spesielle produksjonsprosessen, og det er åpenbart for fagpersoner innen teknikken at utvikling av nye teknikker innen proteinkjemi og den store variasjon i biokjemiske muligheter og nye kombinasjoner av kjente teknikker alltid gjør forbedringer av eksisterende fremgangsmåte mulig. Ekspresjonen av relevante proteiner av denne typen i gjær er utstrakt anvendt her.

Produksjon av proteiner slik som insulin, GM-CSF ("Leukin") og hirudin ("Refludan") er et eksempel på en vellykket utvikling av bioteknologiske fremgangsmåter som baseres på syntese av det spesielle proteinet eller forløpere for dette i gjær. Generelt kan gjær syntetisere direkte spesielt hirudiner med godt utbytte som er i gram skala når Hansenula polymorfa anvendes (Weydemann et al. Appl. Microbiol Biotechnol. 44: 377 - 385, 1995) eller Pichia pastoris (Rosenfeld et al. Protein Expr. Purif: 4, 476 - 82, 1996).

Overraskende er det nå funnet at fusjonsproteiner inneholdende hirudin eller hirudinderivater ved den N-terminale ende kan eksporteres fra gjær med godt utbytte tilsvarende de for hirudin selv. Utbyttet baseres på molaritet. Dette betyr at et vert/vektorsystem som har et produksjonsutbytte på 100 mg nativt hirudin per liter kan produsere ca. 180 mg fusjonsprotein per liter, hvilket er laget av hirudin og, for eksempel mini-proinsulin som omfatter et pro-insulin hvori A-kjeden og B-kjeden er forbundet via en forkortet C-kjede. Uventet er hirudin biologisk aktivt og mini-proinsulin er til stede i den korrekt foldete tredimensjonale form. Dersom de to proteinene fusjoneres via en linker av aminosyrer som gjenkjennes spesifikt av endoproteaser som effektivt spalter fusjonsproteinet akkurat på dette stedet, da kan proteinet av interesse spaltes direkte fra og i aktiv form. I tilfelle insulinproduksjon inneholder linkeren mellom hirudin og mini-proinsulin fortrinnsvis arginin i den karboksyterminale ende. Ved tilsvarende prosessering er det således mulig ved konvertering med trypsin å spalte fra fusjonsdelen og konvertere prosinsulin til mono-Arg-insulin.

Foreliggende oppfinnelsen angår således et DNA-molekyl (alternativ betegnelse: ekspresjonskassett) som følger:

DNA-molekyl, kjennetegnet ved det er på formen:

Px- Sx- Bn - (ZR) - Hir (AsraR) - protein (Y) - T

der

Pxer en hvilken som helst promoter DNA-sekvens utvalgt på en slik måte at optimalt utbytte av proteinet av interesse blir oppnåelig;

Sxer en hvilken som helst DNA som koder for en signalsekvens eller en ledersekvens som muliggjør optimale utbytter;

Bn er en 1 - 15 aminosyre kodoner eller en kjemisk binding;

Z er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen omfattende Lys og Arg;

R er et Arg kodon eller en kjemisk binding;

Asmer en kjemisk binding eller m aminosyrekodoner, der m = 1 - 10;

Hir er en DNA-sekvens som koder for hirudin eller et hirudinderivat som har minst 40% sekvensidentitet med naturlig hirudin, der hirudinderivatet kan eksporteres fra gjær med gode utbytter på linje med det fra hirudin;

protein Y er en DNA-sekvens som koder for et mini-proinsulin og T er en utranslatert DNA-sekvens som er hensiktsmessig for ekspresjonen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fusjonsprotein kodet for av et hvilket som helst av DNA molekylene i følge krav 1.

Omfattet av oppfinnelsene er også multikopivektor, kjennetegnet ved at den omfatter DNA-molekylet ifølge av krav 1.

Videre omfatter oppfinnelsen plasmid, kjennetegnet ved at det omfatter DNA-molekylet ifølge krav 1.

Videre omfatter oppfinnelsen vertscelle, kjennetegnet ved at den omfatter et DNA-molekyl ifølge krav 1, en multikopivektor ifølge krav 3 og/eller et plasmid ifølge krav 4, som en del av sitt kromosom, som en del av et minikromosom eller ekstrakromosomalt.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte for å fermentere et fusjonsprotein ifølge krav 2, kjennetegnet ved at (a) et DNA-molekyl ifølge krav 1, en multikopivektor ifølge krav 3 eller et plasmid ifølge krav 4 uttrykkes i en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 7, og

(b) det uttrykte fusjonsprotein isoleres fra cellekulturens supernatant.

Omfattet av oppfinnelsen er også fremgangsmåte for fremstilling av insulin, kjennetegnet ved at (a) et fusjonsprotein uttrykkes og isoleres ifølge krav 9 til 11; (b) fusjonsproteinet behandles med trypsin og karboksypeptidase B; og (c) insulin isoleres fra reaksjonsblandingen i trinn (b)

Foretrukne proteiner Y er polypeptider slik som mini-proinsulinderivater, interleukiner eller lymfokiner eller interferoner. Ekspresjonskassetten introduseres fortrinnsvis i gjær. Ekspresjonskassetten kan ha en eller flere kopier stabilt integrert i det spesielle gjærgenomet eller kan være til stede ekstrakromosomalt på en multikopivektor eller i form av minikromosomalt element.

En ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen er en vertscelle omfattende det ovennevnte DNA-molekyl eller den ovennevnte multikopivektoren eller det ovennevnte plasmid, som en del av sitt kromosom, som en del av et mini-kromosom, eller ekstrakromosomalt, der vertscellen fortrinnsvis er en gjær, i særdeleshet utvalgt fira gruppen bestående av S. cerevisia, K. lactis, H. polymorfa og P. pastoris.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å fermentere det ovennevnte fusjonsprotein, der (a) det ovennevnte DNA-molekyl, den ovennevnte multikopivektoren eller det

ovennevnte plasmidet uttrykkes i en av de ovennevnte vertsceller, og

(b) det uttrykte fusjonsprotein isoleres fira cellekulturens supernatant, der i særdeleshet etter endt fermentering pH justeres til 2,5-3,5 for å utfelle uønskede proteiner og det uttrykte fusjonsprotein isoleres fra supernatanten til fellingen.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er den ovennevnte fremgangsmåte, der fremgangsmåten etter separering av fermenteringssupernatanten fira vertscellene omfatter gjentatt dyrkning av verscellene i friskt medium, og det frigitte fusjonsprotein isoleres fra hver supernatant oppnådd under dyrkingen.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er den ovennevnte fremgangsmåte, der et fremgangsmåtetrinn for konsentrering av det uttrykte protein i supernatanten etter utfelling utvelges fra en gruppe omfattende mikrofiltrering, hydrofob interaksjonskromatografi og ionebyttekromatografi.

Ekspresjonssystemet beskrevet nedenfor fungerer som et eksempel. Det er åpenbart for fagpersoner innen teknikken at, for å introdusere ekspresjonskassetten i det utvalgte system, må de hensiktsmessige rekombinante DNA-konstruksjoner lages avhengig av typen vertssystem som velges. Følgelig kan industriell fermentering optimaliseres i forhold til det utvalgte verts/vektorsystem.

Igler av typen Hirudo har for eksempel utviklet ulike isoformer av trombininhibitorhirudin. Hirudin er optimalisert for farmasøytiske behov ved kunstig variering av molekylet, for eksempel ved endring av den N-terminale aminosyre (for eksempel EP-A 0 324 712). Oppfinnelsen inkluderer anvendelse av hirudin og hirudinvarianter. Spesielle utførelsesformer ifølge oppfinnelsen anvender en av de naturlige hirudinisoformer (de naturlige isoformer bestegnes samlet "hirudin"). En naturlig isoform er for eksempel Val-Val-hirudin eller lle-Thr-hirudin. Andre utførelsesformer ifølge oppfinnelsen anvender en variant av en naturlig hirudinisoform. En variant er avledet fra en naturlig hirudinisoform men inneholder for eksempel ytterligere aminosyrerer og/eller aminosyredelesjoner og/eller aminosyrebyttinger sammenlignet med den naturlige isoformen. En hirudinvariant kan inneholde vekslende peptidsegmenter av naturlig hirudinisoformer og nye aminosyrer. Hirudinvarianter er kjent og er beskrevet for eksempel i DE 3 430 556. Hirudinvarianter er kommersielt tilgjengelige i form av proteiner (Calbiochem Biochemicals, kat. nr. 377-853, -950-960).

Fusjonsproteiner inneholdende hirudin viser ofte overraskende god løselighet i surt medium, og dette fører til klare fordeler med hensyn til kjemisk opparbeiding av proteinet. Først felles de mange komponentene i supernatanten under gitte betingelser, og dernest er de fleste peptidaser eller proteaser inaktive. Følgelig medfører en surgjøring av fermenteringsløsningen ved slutten av prosessen det mulig direkte å separere uønskede supernatantproteiner sammen med vertscellene fra fusjonsproteinet og, i et senere trinn å konsentrere fusjonsproteinet. Dette er således et aspekt ifølge oppfinnelsen.

På slutten av fermeteringen kan foldingsprosessen foreløpig ikke være 100% fullstendig. Tilsetting av merkaptan eller for eksempel cystein hydroklorid kan fullføre denne prosessen. Dette er på samme måte et aspekt ifølge oppfinnelsen.

Eksemplene beskrevet nedenfor beskriver oppfinnelsen mer detaljert.

Eksempel 1: Oppbygging av en ekspresjonskassett som koder for et fusjonsprotein laget av Leu - hirudin ("Refludan") - Arg - mini-proinsulin.

Utgangsmaterialene er plasmidene pK152 (PCT/EPOO/08537), pSW3 (EP-A 0 347 781) og de rekombinante gjærplasmidderivat som koder for bovint interleukin 2 (Price et al. Gene 55,1987). Gjærplasmidet kan skjelnes ved at det bærer a-faktorledersekvensen under kontroll av gjær ADH2-promoteren. Denne sekvensen er etterfulgt av bovint interleukin 2-cDNA-sekvensen som er bundet via et Kpnl-restriksjonsenzyms gjenkjennelsessete og som inneholder, etter manipulering et Ncol-restrilcsjonsenzymgjenkjennelsessete i den utranslaterte 3'-ende som er unik i vektoren. Følgelig kan cDNA-sekvensen enkelt fjernes fra plasmidet via Kpnl/Ncol-spalting. Siden gode ekspresjonsutbytter er rapportert kan det antas at den gjenværende 3' interleukin 2-sekvensen (som T) har en stabiliserende effekt på mRNA og følgelig ikke trenger å erstattes av en gjærspesifikk terminatorsekvens. Plasmid pK152 bærer DNA-sekvensen som koder for Leu-hirudin ("Refludan") og plasmid pSW3 bærer DNA-sekvensen for mini-proinsulin. Gensekvensen som koder hirudin - Lys Arg - mini-proinsulin tilberedes først ved hjelp av PCR-teknologi. For dette formål tilberedes 4 primere ved hjelp av "Expedite" DN-syntesesystemet:

Primeren hir_insfl beskriver forbindelsen mellom kodoner for de terminale aminosyrer i hirudin (59-65) og insulinsekvensen B1-B7 via Arg-likeren (kodon i uthevet skrift). Primer hir_insrevl er 100% komplementær med denne. Primer hirfl koder for starten av hirudingenet som strekker seg fra Kpnl-spaltingsetet som beskrevet i EP-AO 324 712. Primeren inscoirev markerer den 3'-ende av det syntetiske mini-proinsulin ifølge EP-A 0 347 781.

To standard polymerasekjedereaksjoner utføres ved anvendelse av primerparene hirl/hir_insrevl med DNA til plasmid pK152 som templat og hir_insfl/inscoirev med DNA i plasmid pSW3 som templat. Reaksjonene utføres i lOOul PCR buffer med 200 nmol primer, 1 ul polymerase og 100ng vektor i hvert tilfelle. Trinn 1 er en 2 minutters inkubasjon ved 95°C.

Dette etterfølges av 25 sykluser av 30" ved 95°C, 30" ved 55°C og 30" ved 72°C. Den siste syklusen etterfølges av en inkubering ved 72°C i 3 minutter, og reaksjonen stoppes deretter. Siden primerene hirjnsrevkr og hir_insfkr er 100% komplementære overlapper DNA-produktene til de to produkter med sekvensen slik at en tredje reaksjon, som anvender produktene fra de to første reaksjoner som templater og primerene hirfl og inscoirev, et DNA-fragment dannes, som koder for hirudin og mini-proinsulin separert med Arg. PCR-fragmentet spaltes av enzymene Kpnl og Ncol og deretter, i en T4-ligasereaksjon, innføyes i pa ADH2-vektoren åpnet av Kpnl/Ncol. I analogi med eksempel 7 i EP-A 0 347 781, transformeres således kompetente E. coli MM294-celler med ligeringsblandingen. Plasmid-DNA isoleres deretter fra to kloner for karakterisering ved hjelp av DNA-sekvensanalyse. Etter bekreftelse av den innføyde DNA-sekvens anvendes DNA fra en plasmidtilberedning til å transformere celler fra bakegjærstamme Y79, ifølge nevnte eksempel. Når paADH2-vektoren etterfølges imidlertid vektoren ved å selektere komplementering av trpl-l-mutasjonen, i motsetning til eksemplet. For en annen kontroll reisoleres plasmid-DNA fra gjærtransformasjonene og analyseres ved hjelp av restriksjonsanalyse. Den konstruerte ekspresjonsvektor betegnes pADH2Hir_Ins. Ekspresjonen utføres ifølge eksempel 4. Fusjonsproteinet finnes i supernatanten.

Eksempel 2: Konstruksjon av en ekspresjonskassett som koder for et fusjonsprotein laget av Leu - hirudin ("Refludan") - Gly Asn Ser Ala Arg - mini-proinsulin.

Eksempelet viser en måte å modifisere trypsin gjenkjennelsessete mellom hirudinderivatet og mini-proinsulin. Konstruksjonen utføres ifølge eksempel 1.

To nye oligonukleotider syntetiseres:

To polymrase kjedereaksjoner utføres ved anvendelse av primerparene hirfl/hir_insrevl med DNA fra plasmid pK152 som templat og hir_insfl/insncoirev med DNA fra plasmid pSW3 som templat. I en tredje reaksjon som anvender produktene fra de første to reaksjoner som templater og primerne hirfl og insncoirev, dannes et DNA-fragment som koder for hirudin og mini-proinsulin atskilt av linkeren Gly Asn Ser Ala Arg. Produktet fra PCR3 spaltes deretter av Kpnl og Ncol, introdusert i den hensiktsmessige åpnede paADH2-vektoren ogkarakterisertifølge eksempel 1. Plasmidet betegnes pADHH_GNSA_Ins. Cellene transformeres med plasmid-DNA. Ekspresjonen utføres ifølge eksempel 3. Fusjonsproteinet finnes i supernatanten.

Eksempel 3: Ekspresjon av de rekombinante produkter i bakegjærsystemet.

Ekspresjonen er inndelt i to faser. Først dyrkes en forkultur i minimalt gjærmedium. Mediet har den følgende sammensetning per liter:

Hovedkulturen eller ekspresjonskulturen inokuleres med en alikvot av forkulturen.

Hovedkulturmediet inneholder per liter:

Ved anvendelse av de beskrevne medier utføres ekspresjon i en omrystet flaske på følgende måte: 0,3 ml av en forkultur som er dyrket over natten fortynnes med 80 ml forvarmet medium og inkuberes med kraftig risting ved 30°C i omtrent 24 timer. I hvert tilfelle sentrifugeres 1 ml av kulturen fremstilt på denne måten, etter bestemmelse av optisk tetthet og etter fjerning av cellene, lyofiliseres supernatanten og analyseres ved hjelp av SDS-PAGE. Det biologisk aktive hirudininnholdet bestemmes ved å utføre en trominhibisjonsanalyse. En alternativ fermenteringsprotokoll gjør det mulig at cellene fjernes ved filtrering eller ved forsiktig sentrifugering. Mens proteinet av interesse isoleres fra mediet tilbys cellene friskt forvarmet hovedkulturmedium inneholdende alkohol og ikke mer enn 0,5% glukose som karbonkilde og fermenteringen fortsetter således uten avbrudd. Dette trinnet kan gjentas opptil 5 ganger.

Eksempel 4: Kloning og ekspresjon av hirudin - Arg - mini-proinsulinfusjonsprotein i P. pastoris-systemet.

"Invitrogen" selger et klonings- og ekspresjonskitt for fremstilling av rekombinante proteiner ved hjelp av P. pastorissystemet. Til dette følger en detaljert teknisk protokoll for fremstilling og videre ekspresjon av et P. pastorissystem for fremstilling av ønsket rekombinant protein slik at bare konstruksjon av ekspresjonsvektoren som koder for det ønskede protein må beskrives når nevnte protokoller følges. "EasySelect" Pichia-ekspresjonskitt (katalog nr. K1740-01) anvendes.

pPICZaA-vektoren er en del av kittet. Åpning av vektoren ved restriksjonsenzymene Xhol og SacII gjør det mulig å tilføye, på samme måte som i eksempel 1, et protein av interesse til alfa-faktorledersekvensen og å teste sekresjon til supernatanten. Kloning av fusjonsproteinet krever to primere. Primer pichia_H_Ifl (SEQ ID NO: 10) har sekvensen:

Templaten som anvendes er DNA av plasmid pADH2ir_Ins. En standard PCR med begge primere produserer et DNA-produkt som inneholder sekvensen hirudin - Arg - mini-proinsulin som strekker seg fra Xhol og SacII-integreringssetene. Dersom DNA-produktet spaltes hensiktsmessig og fragmentet isoleres kan fragmentet innføyes i den åpnede vektor-DNA i en T4 DNA-ligasereaksjon. Avvikende fra produsentens protokoll transformeres E. coli-stammen MM294 beskrevet i eksempel 1 med ligeringsblandingen og rekombinante kolonier screenes for vellykket transformasjon på zeocinseleksjonsplater. Plasmid-DNA reisoleres fra kloner og karakteriseres deretter ved hjelp av restriksjon og DNA-sekvensanalyse. Ved anvendelse av plasmidet konstruert på denne måten fremstilles således en P. pastoris-ekspresjonsklon for fremstilling av fusjonsproteinet etter produsentens retningslinjer.

Eksempel 5: Trombininhibisjonsanalyse

Hirudinkonsentrasjonen bestemmes ifølge fremgangsmåten til Greipach et al.

(Thrombosis Research 37, side 347 - 350, 1985). I denne hensikt inkluderes spesifikke mengder av en Refludan-standard i målingene for å etablere en kalibreringskurve fra hvilket utbytte i mg/l kan bestemmes direkte. Den biologiske aktiviteten er også et direkte mål for korrekt folding av proinsulinkomponenten til fusjonsproteinet. Alternativt er det mulig å anvende en proteolytisk S. aureus-spalting og etterfølgende analyse i en RP-HPLC-system for å bestemme den korrekte S-S-brobyggingen.

Eksempel 6: Rensing av fusjonsproteinet

Etter avsluttet fermentering justeres pH til 2,5 - 3.1 motsetning til de fleste andre polypeptider som finnes i supernatanten enten på grunn av spontan lyse av vertscellene eller sekresjon, felles overraskende ikke fusjonsproteinet ved pH 2,5 - 3. Kulturmediet surgjøres derfor på en hensiktsmessig måte og etter fullstendig utfelling fjernes presipitatet og cellene ved sentrifugering eller ved mikrofiltrering og konsentrering. Deretter justeres mediet til pH 6,8 og fusjonsproteininnholdet bestemmes i parallell ved analytisk HPLC-måling. Bestemmelsen følges ved tilsettes av trypsin til supernatanten slik at trypsin er ved ca. 1 ug per 1-1,5 mg fusjonsprotein. Etter inkubering ved romtemperatur i omtrent 4 timer utføres rensing ved kationebyttekromatografi aved pH 3,5 i nærvær av 2-propanol. Eluering utføres i bufferen ved å tilføre en gradient fra 0,15 til 0,45. Mono-Arg-insulin elueres ved ca. 0,3 M. Etter 1:1 fortynning utfelles mono-Arg-insulin fra de insulin-inneholdende fraksjonene ved omtrent pH 6,8 med tilsetting av en 10% ZnCk-løsning. Insulin filtreres fra og løses i 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) hvilket gir en 2 mg/ml løsning. Deretter tilsettes omtrent en mengde på 1 enhet karboksypeptidase B per 100 ml løsning og reaksjonen utføres ved mild omrøring. pH justeres deretter til 5,5 med sitronsyre, og insulin krystalliseres i nærvær av ZnCb. Krystallene fjernes, løses og, etter rensing ved RP-HPLC, renses insulin igjen ved krystallisering.

Eksempel 7: Prosessering av fusjonsproteinet direkte i kulturmediet

Etter endt ekspresjonsperiode justeres kulturmediet til pH 6,8 og trypsin tilsettes ved omrøring slik at en sluttkonsentrasjon på 4 - 8 mg per liter etableres. Etter inkubering i ca. 4 timer justeres pH i denne fermenteringsløsningen til pH 2,5 - 3. Etter 1-6 timers utfelling økes pH til 3,5, og den dannede mono-Arg-insulin renses via kationebyttekromatografi i nærvær av 30% 2-propanol. Eluering utføres ved hjelp av en NaCl-gradient på 0,05 - 0,5 M salt. De produktinneholdende fraksjonene fortynnes 1:1 med vann og ZnCh tilsettes slik at en 0,1% ZnC2-Løsning dannes. Mono-Arg-insulin felles ved omtrent pH 6,8 og konverteres eksempelvis til insulin ifølge eksempel 6.

Claims

1. DNA-molekyl,karakterisert vedat det er på formen: Px - Sx- Bn - (ZR) - Hir (AsmR) - protein (Y) - T der Pxer en hvilken som helst promoter DNA-sekvens utvalgt på en slik måte at optimalt utbytte av proteinet av interesse blir oppnåelig; Sxer en hvilken som helst DNA som koder for en signalsekvens eller en ledersekvens som muliggjør optimale utbytter; Bn er en 1 - 15 aminosyre kodoner eller en kjemisk binding; Z er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen omfattende Lys og Arg; R er et Arg kodon eller en kjemisk binding; Asmer en kjemisk binding eller m aminosyrekodoner, der m = 1 - 10; Hir er en DNA-sekvens som koder for hirudin eller et hirudinderivat som har minst 40% sekvensidentitet med naturlig hirudin, der hirudinderivatet kan eksporteres fra gjær med gode utbytter på linje med det fra hirudin; protein Y er en DNA-sekvens som koder for et mini-proinsulin og T er en utranslatert DNA-sekvens som er hensiktsmessig for ekspresjonen.

2. Fusjonsprotein kodet for av et hvilket som helst av DNA molekylene i følge krav 1.

3. Multikopivektor,karakterisert vedat den omfatter DNA-molekylet ifølge av krav 1.

4. Plasmid,karakterisert vedat det omfatter DNA-molekylet ifølge krav 1.

5. Vertscelle,karakterisert vedat det omfatter et DNA-molekyl ifølge krav 1, en multikopivektor ifølge krav 3 og/eller et plasmid ifølge krav 4, som en del av sitt kromosom, som en del av et minikromosom eller ekstrakromosomalt.

6. Vertscelle ifølge krav 5,karakterisert vedat vertscellen er en gjær.

7. Vertscelle ifølge krav 6,karakterisert vedat den er valgt fra gruppen bestående av S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha og P. pastoris.

8. Fremgangsmåte for å fermentere et fusjonsprotein ifølge krav 2,karakterisert vedat (a) et DNA-molekyl ifølge krav 1, en multikopivektor ifølge krav 3 eller et plasmid ifølge krav 4 uttrykkes i en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 7, og (b) det uttrykte fusjonsprotein isoleres fra cellekulturens supernatant.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat pH, etter endt fermentering justeres til 2,5 - 3,5 for å utfelle uønskede proteiner og det uttrykte fusjonsprotein isoleres fra supernatanten til utfellingen.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter at vertscellene, etter at de er separert fra fermenteringssupernatanten, dyrkes gjentagende ganger i friskt medium, og det frigitte fusjonsprotein isoleres fra hver supernatant som oppnås under dyrkingen.

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 10,karakterisert vedat fremgangsmåtetrinnet for konsentrering av det uttrykte protein i supernatanten etter utfelling utvelges fra gruppen omfattende mikrofiltrering, hydrofobinteraksjonskromatografi og ionebyttekromatografi.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av insulin,karakterisertv e d at (d) et fusjonsprotein uttrykkes og isoleres ifølge krav 9 til 11; (e) fusjonsproteinet behandles med trypsin og karboksypeptidase B; og (f) insulin isoleres fra reaksjonsblandingen i trinn (b).