PT1364032E - Utilização de proteínas de fusão cuja parte do terminal n é um derivado da hirudina para a preparação de proteínas recombinantes através de secreção por leveduras - Google Patents

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO CUJA PARTE DO TERMINAL N É UM DERIVADO DA HIRUDINA PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES ATRAVÉS DE SECREÇÃO POR LEVEDURAS" 0 desenvolvimento de processos optimizados para a preparação de fármacos com base em proteínas recombinantes é uma tarefa que tem de fazer justiça aos seguintes pontos de vista. Em primeiro lugar, um processo deve ser tão eficaz quanto possível a nível de custo e, em segundo lugar, o produto deve ser da pureza mais elevada. Nesta ligação, a escolha do sistema de expressão determina o curso do processo de preparação em particular, e é óbvio para o especialista que o desenvolvimento das novas técnicas em química de proteínas e uma larga variedade de possibilidades bioquímicas e novas combinações de técnicas conhecidas, tornam sempre possíveis as melhorias dos processos existentes. É aqui largamente utilizado a expressão de proteínas relevantes deste tipo em leveduras. A preparação de proteínas, tais como insulina, GM-CSF (Leukine ®) e hirudina (Refludan ®) é um exemplo do desenvolvimento bem sucedido de processos de modificação genética que estão baseados na síntese da proteína particular ou seus percursores na levedura. Geralmente, as leveduras podem sintetizar directamente, em particular, hirudinas com bons rendimentos que estão na escala de grama quando se utiliza a Hansenula polymorpha (Weydemann et al. Appl. Microbiol Biotechnol. 44: 377-385, 1995) ou Pichia pastoris (Rosenfeld et al. Protein Expr. Purif: 4, 476-82, 1996). 1

No Pedido de Patente Europeia 0158564A1, são revelados os vectores para a expressão da Hirudina ou um análogo da hirudina. 0 Pedido de Patente Internacional WO91/09125 revela que as proteinas de fusão inactivas são activáveis por enzimas da cascata de coagulação, para possuirem actividade fibrinolitica e/ou de inibição de formação de coágulos. Por exemplo, uma proteina de fusão compreendendo duas moléculas de Hirudina ou estreptocinase, ligadas por uma sequência de ligação clivável, pode ser clivável para produzir hirudina anti-trombótica ou estreptocinase fibrinolitica pela trombina ou Factor Xa. A actividade de inibição fibrinolitica ou de formação de coágulos está, portanto, direccionada para o sítio de formação do coágulo.

Winter et al. (Journal of Biotechnology 84(2000)175-185) descreve um método para a produção de elevadas quantidades de proinsulina solúvel humana nativa em E. coli fundindo proinsulina ao terminal C da oxirredutase de dissulfito periplásmica DsbA através de um sítio de clivagem da tripsina.

Surpreendentemente, foi agora verificado que as proteínas de fusão contendo hirudina ou derivados de hirudina no terminal N podem ser exportadas a partir de leveduras com bons rendimentos, semelhantes aos da própria hirudina. Os rendimentos são baseados na molaridade. Isto significa que um sistema hospedeiro/vector produzindo rendimentos de 100 mg de hirudina nativa por litro pode produzir aprox. 180 mg de proteina de fusão por litro, que é composta de hirudina e, por exemplo, mini-proinsulina que é como descrito no documento EP-A0347781. 2

Surpreendentemente, a hirudina é activa biologicamente e a mini-proinsulina está presente na forma tridimensional com o enrolamento correcto. Se as duas proteínas são fundidas através de um ligante de aminoácidos gue são reconhecidos especificamente por endoproteases gue clivam eficientemente a proteina de fusão nessa única posição, então a proteina de interesse pode ser clivada directamente e na sua forma activa. No caso da produção de insulina, o ligante entre a hirudina e mini-proinsulina contém, de um modo preferido, arginina na extremidade do terminal carboxilo. Num processamento simultâneo é, então, possivel por conversão com tripsina, clivar a porção da fusão e converter a proinsulina a insulina mono-Arg. A invenção refere-se, assim, a uma molécula de ADN (termo alternativo: cassete de expressão) da forma:

Px - Sx - Bn - (ZR) - Hir (AsmR) - proteina (Y) - T,

P

X z R Asm Hir é qualguer sequência de ADN promotora, seleccionada de um modo que os rendimentos optimizados da proteina de interesse se tornem atingíveis; é qualquer ADN que codifica uma sequência sinal ou sequência líder que permite rendimentos optimizados; são codões de 1-15 aminoácidos ou uma ligação química; é o codão de um aminoácido seleccionado a partir do grupo compreendendo Lys e Arg; é um codão Arg ou uma ligação química; é uma ligação química ou m codões de aminoácidos, em que m = 1-10; é uma sequência de ADN que codifica a hirudina ou um derivado da hirudina que é, pelo menos, 40% homóloga 3 com a hirudina natural, em que o derivado da hirudina pode ser exportado a partir da levedura com bons rendimentos, semelhante aos da própria Hirudina; proteína Y é uma sequência de ADN que codifica uma mini-proinsulina, e T é uma sequência de ADN não traduzida possuindo um efeito estabilizador no ARNm.

As proteínas Y preferidas são polipéptidos, tais como derivados da mini-proinsulina, interleucinas, linfocinas ou interferões. A cassete de expressão é, de um modo preferido, introduzida em leveduras. A referida cassete de expressão pode possuir uma ou mais cópias estavelmente integradas no genoma da levedura particular ou pode ser apresentado extracromossomalmente num vector multicópia ou num tipo de elemento minicromossomal.

Outra forma de realização da invenção é uma proteína de fusão codificada por qualquer das moléculas de ADN anteriormente mencionadas.

Uma forma de realização adicional da invenção é um vector multicópia e um plasmídeo compreendendo a molécula de ADN anteriormente mencionada.

Uma forma de realização adicional da invenção é uma célula hospedeira compreendendo a molécula de ADN anteriormente mencionada, o vector multicópia anteriormente mencionado ou o plasmídeo anteriormente mencionado, como uma parte do seu cromossoma, como uma parte de um mini-cromossoma, ou 4 extracromossomalmente, em que, de um modo preferido, a referida célula hospedeira é uma levedura, seleccionada em particular a partir do grupo compreendendo S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha e P. pastoris.

Outra forma de realização da invenção é um processo de fermentação da proteina de fusão acima mencionada, no qual (a) a molécula de ADN acima mencionada, o vector multicópia anteriormente mencionado, ou o plasmideo anteriormente mencionado é expresso numa célula hospedeira acima mencionada, e (b) a proteina de fusão expressa é isolada a partir do sobrenadante da cultura de células, em que, em particular, após conclusão da fermentação, o pH é ajustado para 2,5-3,5, de modo a precipitar proteinas não desejadas e a proteina de fusão expressa é isolada a partir do sobrenadante da precipitação.

Outra forma de realização da invenção é o processo anteriormente mencionado, onde, após a separação do sobrenadante de fermentação das células hospedeiras, as células hospedeiras são repetidamente cultivadas em meio fresco, e é isolada a proteina de fusão libertada a partir de cada sobrenadante obtido durante a cultura.

Outra forma de realização da invenção é o processo anteriormente mencionado, em que é seleccionado um passo do processo para concentrar a proteina expressa no sobrenadante após precipitação a partir de um grupo, compreendendo 5 microfiltração, cromatografia de interacção hidrofóbica e cromatografia de troca iónica.

Uma forma de realização adicional da invenção é um processo para preparar insulina, no qual (a) a proteina de fusão acima mencionada é expressa e isolada de acordo com o processo anteriormente mencionado; (b) a proteina de fusão é tratada com tripsina e carboxipeptidase B; e (c) a insulina é isolada a partir da mistura da reacção do passo (b). 0 sistema de expressão a seguir descrito serve como um exemplo. É óbvio para o especialista que, de modo a introduzir a cassete de expressão no referido sistema seleccionado, as construções de ADN recombinante apropriadas devem ser preparadas dependendo do tipo do sistema hospedeiro seleccionado.

Consequentemente, a fermentação industrial pode ser optimizada em relação ao sistema hospedeiro/vector seleccionado.

As sanguessugas do tipo Hirudo desenvolveram, por exemplo, várias isoformas de hirudina, inibidor da trombina. A hirudina foi optimizada para as exigências farmacêuticas por variação artificial da molécula, por exemplo troca do aminoácido do terminal N (e. g. documento EP-A0324712). A invenção inclui a utilização de hirudina e variantes da hirudina. As formas de realização particulares da invenção utilizam uma das isoformas da hirudina natural (as isoformas naturais são em conjunto 6 denominadas de "hirudina"). Uma isoforma natural é, por exemplo, Val-Val-hirudina ou Ile-Thr-hirudina. Outras formas de realização da invenção utilizam uma variante de uma isoforma da hirudina natural. Uma variante é derivada de uma isoforma da hirudina natural mas contém, por exemplo, aminoácidos adicionais e/ou delecções de aminoácidos e/ou trocas de aminoácidos comparativamente com a isoforma natural. Uma variante da hirudina pode conter segmentos de péptidos alternados de isoformas da hirudina natural e novos aminoácidos. As variantes da hirudina são conhecidas e estão descritas, por exemplo, no documento DE3430556. As variantes da hirudina estão disponíveis comercialmente na forma de proteínas (Calbiochem Biochemicals, Cat. N° 377-853, -950-960).

Frequentemente, as proteínas de fusão contendo hirudina apresentam, surpreendentemente, boa solubilidade em meio acidico, e isto conduz a vantagens distintas no que diz respeito à progressão quimica da proteina. Em primeiro lugar, os muitos componentes do sobrenadante são precipitados sob as referidas condições e, em segundo lugar, a maioria das peptidases ou proteases estão inactivas. Assim, acidificando o caldo de fermentação, no final da operação, torna possivel separar directamente proteínas não desejáveis do sobrenadante juntamente com as células hospedeiras da proteina de fusão e, num passo adicional, concentrar a referida proteina de fusão. Isto é igualmente um objectivo da invenção.

No final da fermentação, o processo de enrolamento pode ainda não estar 100% completo. A adição de mercaptano ou, por exemplo, cloridrato de cisteina pode completar o processo. Isto é igualmente um objectivo da invenção. 7

Os exemplos a seguir descrevem a invenção em maior detalhe, sem serem limitantes.

Exemplo 1: Construção de uma cassete de expressão que codifica uma proteína de fusão constituída de Leu - hirudina (Refludan®) - Arg - mini-proinsulina

Os materiais de partida são os plasmídeos pK152 (documento PCT/EP00/08537), pSW3 (documento EP-A0347781) e o derivado de plasmídeo de levedura recombinante que codifica para a interleucina 2 bovina (Price et al. Gene 55, 1987) . 0 plasmídeo de levedura é distinguido por transportar a sequência líder do factor cc sob o controlo do promotor ADH2 de levedura. Esta sequência é seguida pela sequência de ADNc da interleucina 2 bovina que está ligada através de um sítio de reconhecimento do enzima de restrição Kpnl e que contém, após manipulação, um sítio de reconhecimento do enzima de restrição Ncol na extremidade 3' não traduzida que é única no vector. Assim, a sequência de ADNc pode ser removida prontamente do plasmídeo através da clivagem com Kpnl/Ncol. Uma vez que foram referidos bons rendimentos de expressão, pode ser assumido que a restante sequência 3' da interleucina 2 (como T) possui um efeito estabilizador no ARNm e assim não necessita de ser substituída por uma sequência de terminação especifica de levedura. 0 plasmídeo pK152 contém a sequência de ADN que codifica para a Leu-hirudina (Refludan) kodiert e o plasmídeo pSW3 contém a sequência de ADN para a mini-proinsulina. A sequência do gene para codificar hirudina - Lys Arg - mini-proinsulina é preparada, em primeiro lugar, através de tecnologia de PCR. Para este propósito, são preparados 4 iniciadores com o auxílio do sistema síntese de ADN Expedite™: i. hir_insfl (SEQ ID NO: 1, segmento de proteína codificado: SEQ ID N0:2)

I P E E Y L Q Arg F V N Q H L C 5'-ATCCCTGAGGAATACCTTCAG CGA TTTGTTAACCAACACTTGTGTGG-3' 59 60 61 62 63 64 65 BI B2 B3 B4 B5 B6 B7 ii. hir_insrevl (SEQ ID NO: 3) 5'-CCTCACAAGTGTTGGTTAACA AA TCG CT GAAGGTATTC CTCAGGGAT- 3' iii. hirfl(SEQ ID NO: 4, segmento de proteína codificado: SEQ ID NO: 5)

L T Y T D C

5'-TTTTTTTGGATOOTTT GGATAAAAGACTTACGTATACTGACTGCAC iv. insncol rev (SEQ ID NO: 6)

5'-TTTTTTCCAT GGGTCGACTATCAG O iniciador hir_insfl descreve a união entre codões para os aminoácidos terminais da hirudina (59-65) e a sequência da insulina B1-B7 através do ligante Arg (codão a negrito). O iniciador hir_insrevl é 100% complementar à mesma. O iniciador hirfl codifica para o início do gene da hirudina prolongado até ao sítio de clivagem Kpnl como descrito no documento EP-A 0324712. O iniciador insncoirev marca a extremidade 3' da mini-proinsulina sintética de acordo com o documento EP-A 0347781. 9 São realizadas duas reacções da polimerase em cadeia de referência utilizando os pares de iniciadores hirf1/hir_insrevl de ADN de plasmídeo pK152 como molde e hir_insf1/inscoirev com ADN de plasmideo pSW3 como molde. As reacções são realizadas em 100 pL de tampão de PCR com, em cada caso, 200 nmol de iniciador, 1 pL de polimerase e 100 ng de vector. O passo 1 é uma incubação de 2 minutos a 95 °C.

Isto é depois seguido por 25 ciclos de 30'' a 95 °C, 30'' a 55 °C e 30'' a 72 °C. O último ciclo é seguido por uma incubação a 72 °C durante 3 minutos e a reacção é subsequentemente terminada. Uma vez que os iniciadores hir_insrevkr e hir_insfkr são 100% complementares, os produtos de ADN dos dois produtos sobrepõem-se de acordo com a referida sequência, de modo que, numa terceira reacção, utilizando os produtos das duas primeiras reacções como moldes e os iniciadores hirfl e insncoirev, é formado um fragmento de ADN que codifica a hirudina e mini-proinsulina separadas por Arg. O fragmento de PCR é digerido pelos enzimas Kpnl e Ncol e a seguir, numa reacção com ligase de T4, inserido num vector paADH2 linearizado com Kpnl/Ncol. Em analogia ao exemplo 7 do documento EP-A0347781, são então transformadas células competentes MM294 de E. coli com a mistura da ligação. O ADN de plasmideo é, então, isolado a partir de dois clones para caracterização através de análise da sequência de ADN. Após confirmação da sequência de ADN inserida, é utilizado o ADN de uma preparação de plasmideo para transformar células da estirpe Y79 de levedura de padeiro, de acordo com o referido exemplo. Contudo, ao utilizar o vector paADH2, a introdução do vector é seguida através da selecção para complementação da mutação trpl-1, em contraste com o referido 10 exemplo. Para outro controlo, é re-isolado o ADN de plasmídeo a partir de transformantes de leveduras e analisado através de análise por restrição. 0 vector de expressão construído é denominado de pADH2Hir_Ins. A expressão é realizada de acordo com o exemplo 4. A proteína de fusão é encontrada no sobrenadante.

Exemplo 2: Construção de uma cassete de expressão que codifica uma proteína de fusão constituída por Leu - hirudina (Refludan) - Gly Asn Ser Ala Arg - mini-proinsulina 0 exemplo demonstra um modo de modificar o sítio de reconhecimento da tripsina entre o derivado da hirudina e mini-proinsulina. A construção é realizada de acordo com o exemplo 1. São sintetizados dois novos oligonucleótidos:

Hir insf (SEQ ID NO: 7, segmento de proteína codificado: SEQ ID NO: 8)

GN SARFVNQHLC 5' ATCCCTGAGGAATACCTTCAGGGAAATTCGGCACGATTTGTTAACCAACACTTGTGTGG 3'

Hir65 BI B2 B3 B4 B5 Ββ B7

Hir_insrev (SEQ ID NO: 9)

5'CCACACAAGTGTTGGTTAACAAATCGTGCCGAATTTCCCTGAAGGTATTCCTCAGGGAT B2 BI Hir65 11 São realizadas duas reacções de polimerase em cadeia utilizando os pares de iniciadores hirfl/hir_insrevl com ADN do plasmídeo pK152 como molde e hir_insf1/insncoirev com ADN do plasmideo pSW3 como molde. Numa terceira reacção, utilizando os produtos das primeiras duas reacções como moldes e os iniciadores hirfl e insncoirev, é formado um fragmento de ADN, que codifica a hirudina e a mini-proinsulina separadas pelo ligante Gly Asn Ser Ala Arg. 0 produto de PCR3 é clivado subsequentemente com Kpnl e Ncol, introduzido no vector paADH2 linearizado apropriadamente e caracterizado de acordo com o exemplo 1. 0 plasmideo é denominado de pADHH_GNSA_Ins. As células são transformadas com o ADN do plasmideo. A expressão é realizada de acordo com o exemplo 3. A proteína de fusão é verificada no sobrenadante.

Exemplo 3: Expressão dos produtos recombinantes no sistema de leveduras de padeiro A expressão é dividida em duas fases. Em primeiro lugar, é cultivada uma pré-cultura em meio minimo de levedura. 0 meio possui a seguinte composição por litro: 6,7 g - base de azoto de levedura (sem aminoácidos) 5,0 g - casamino-ácidos (livre de vitaminas) 0,008% - adenina 0,008% - uracilo 2% - glucose A cultura principal ou de expressão é inoculada com uma alíquota da pré-cultura. 12 A cultura principal contém por litro: 10 g - extracto de levedura 20 g - peptona 0,008% - adenina 0,008% - uracilo 4% - glucose

Utilizando o meio descrito, a expressão é realizada num frasco de agitação do seguinte modo: 0,3 mL de uma pré-cultura que foi cultivada de um dia para o outro é diluída com 80 mL de meio pré-aquecido e incubados com agitação vigorosa a 30 °C durante aprox. 24 h. Em cada caso, é então centrifugado 1 mL da cultura preparada deste modo, após determinar a densidade óptica, e, após remover as células, o sobrenadante é liofilizado e analisado através de SDS-PAGE. O conteúdo de hirudina activa biologicamente é determinado realizando um ensaio de inibição de trombina. Um protocolo de fermentação alternativo proporciona que as células sejam removidas por filtração ou centrifugação cuidadosa. Enquanto se isola a proteína de interesse a partir do meio, as células são proporcionadas com meio de cultura principal fresco pré-aquecido contendo álcool e não mais do que 0,5% de glucose como fontes de carbono, e assim a fermentação é continuada sem interrupção. Este passo pode ser repetido até 5 vezes.

Exemplo 4: Clonagem e expressão da proteína de fusão hirudina - Arg - mini-proinsulina no sistema P. pastoris A Invitrogen® vende um kit de clonagem e expressão para preparar proteínas recombinantes com a ajuda do sistema da P. 13

Pastoris. Para tal, é proporcionado um protocolo técnico detalhado considerando a preparação e expressão subsequente de um sistema da P. pastoris para a produção de uma proteina recombinante desejada de modo que apenas a construção do vector de expressão que codifica a proteina desejada tenha de ser descrito quando precede os referidos protocolos. É utilizado o kit de expressão EasySelect™ Pichia (n° de catálogo K1740-01). 0 vector pPICZCtA é parte do kit. Linearizando o vector através dos enzimas de restrição Xhol e SacII torna possível adicionar, similarmente ao exemplo 1, uma proteína de interesse para a sequência líder do factor alfa e testar quanto à secreção no sobrenadante. A clonagem da proteína de fusão requer dois iniciadores. 0 iniciador pichia_H_Ifl (SEQ ID NO: 10) possui a sequência: 5' - TTTTTTTCTCGAGAAAAGA CTTACGTATACTGAC - 3'

XhoI Hiri Hir2 etc. O iniciador pichia_H_Irev2 (SEQ ID NO: 11) possui a sequência: 5' - TTTTTTGGCGCCGAATTCACTATTAGTTACAGTAGTTTTCC - 3'

SacII EcoRI A21 O molde utilizado é ADN do plasmídeo pADH2Hir_Ins. Um PCR de referência com ambos os iniciadores produz um produto de PCR que contém a sequência hirudina - Arg - mini-proinsulina alargada pelos sítios de integração Xhol e SacII. O produto de ADN é clivado apropriadamente e é isolado o fragmento, podendo o referido fragmento ser inserido no vector de ADN linearizado, numa reacção com a ligase de ADN T4. Numa modificação do 14 protocolo do fabricante, a estirpe MM294 de E. coli, descrita no exemplo 1, é transformada com a mistura da ligação e são rastreadas as colónias recombinantes quanto à transformação bem sucedida em placas de selecção de zeocina. 0 ADN de plasmideo é re-isolado a partir de clones e, depois, é caracterizado através de análise de restrição e sequência de ADN. Utilizando o plasmideo construído deste modo, é então preparado um clone de expressão de P. pastoris para produção da proteína de fusão, seguindo as instruções do fabricante.

Exemplo 5: Ensaio de inibição da Trombina A concentração de hirudina é determinada de acordo com o método de GrieBbach et al. (Thrombosis Research 37, pp. 347-350, 1985). Para este propósito, estão incluídas quantidades específicas de um padrão de Refludan nas medições de modo a estabelecer uma curva de calibração a partir da qual pode ser determinado directamente o rendimento em mg/L. A actividade biológica é também uma medida directa para o enrolamento correcto da componente proinsulina da proteína de fusão. Alternativamente, é possível utilizar uma digestão proteolítica de S. aureus e análise subsequente num sistema de RP-HPLC para determinar a formação correcta das pontes S-S.

Exemplo 6: Purificação da proteína de fusão

Após conclusão da fermentação, o pH é ajustado para 2,5-3. Em contraste com a maioria dos outros polipéptidos encontrados no sobrenadante, devido quer a lise espontânea das células hospedeiras ou secreção, a proteína de fusão não é, 15 surpreendentemente, precipitada a pH 2,5-3. 0 meio de cultura é, portanto, acidificado apropriadamente e assim, após conclusão da precipitação, o precipitado e as células são removidos por centrifugação ou por microfiltração e concentrados. Subsequentemente, o meio é ajustado para pH 6,8 e o conteúdo de proteína de fusão é determinado em paralelo através de medição analítica por HPLC. A determinação é seguida através da adição de tripsina ao sobrenadante de modo que a tripsina é aprox. 1 pg por 1-15 mg de proteína de fusão. Após incubação à temperatura ambiente durante aprox. 4 horas, a purificação é realizada através de cromatografia de troca catiónica a pH 3,5 na presença de 2-propanol. A eluição é realizada no tampão através da aplicação de um gradiente de desde 0,5 a 0,45 Μ. A mono-Arg-insulina é eluída a aprox. 0,3 M. Após uma diluição de 1:1, a mono-Arg-insulina é precipitada a partir da insulina contendo fracções a aprox. pH 6,8 com a adição de uma solução com uma força de ZnCl2 a 10%. A insulina é filtrada e depois dissolvida em Tris-HCl a 0,05 M (pH 8,5) resultando numa solução a 2 mg/mL. A seguir, é adicionada a quantidade de aprox. 1 unidade de carboxipeptidase B por 100 mL de solução e a reacção é realizada com agitação suave. O pH é então ajustado para pH 5,5 com ácido cítrico, e a insulina é cristalizada na presença de ZnCl2. Os cristais são removidos, dissolvidos e, após purificação por RP-HPLC, a insulina é purificada de novo por cristalização.

Exemplo 7: Processamento da proteína de fusão directamente no meio de cultura

No final do período de expressão, o meio de cultura é ajustado para pH 6,8 e é então adicionada a tripsina com agitação de modo que seja alcançada uma concentração final de 4- 16 8 mg por litro. Após incubação durante aprox. 4 horas, o caldo de fermentação tratado desta forma é ajustado para pH 2,5-3. Após 1-6 horas de precipitação, o pH é aumentado para 3,5, e a mono-Arg-insulina formada é purificada através de cromatografia de troca catiónica na presença de 2-propanol a 30%. A eluição é realizada através de um gradiente de NaCl de 0,05-0,5 M de sal. Os produtos contendo fracções são diluidos 1:1 com H2O e depois é adicionado ZnCl2, de modo a ser formada uma solução com uma força de ZnCl2 a 0,1%. A mono-Arg-insulina precipita a aprox. pH 6,8 e a titulo de exemplo é convertida a insulina de acordo com o exemplo 6.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Utilização de proteinas de fusão cuja parte do terminal N é um derivado da hirudina para a produção de proteinas recombinantes via secreção por leveduras <130> DEAV2001/0008 <140> 10108211.8 <141> 2001-02-20 <160> 11 <170> Patentin Ver. 2.1 <210> 1 17 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: hir insfl <4 0 0> 1 atccctgagg aataccttca gcgatttgtt aaccaacact tgtgtgg 47 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: proteina hir insfl <4 0 0> 2 Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: hir insrevl <4 0 0> 3 18 47 cctcacaagt gttggttaac aaatcgctga aggtattcct cagggat

<210> 4 <211> 46 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: hirfl <400> 4 tttttttgga tcctttggat aaaagactta cgtatactga ctgcac 46

<210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: proteína hirfl <400> 5

Leu Thr Tir Thr Asp Cys 1 5

<210> 6 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 19 <223> Descrição da Sequência Artificial: insncolrev <400> 6 ttttttccat gggtcgacta tcag 24 <210> 7 <211> 59 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Hir insf <4 0 0> 7 atccctgagg aataccttca gggaaattcg gcacgatttg ttaaccaaca cttgtgtgg 59 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: proteina Hir insf <4 0 0> 8

Gly Asn Ser Ala Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys

15 10 <210> 9 <211> 59 <212> ADN 20 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Hir insrev <4 0 0> 9 ccacacaagt gttggttaac aaatcgtgcc gaatttccct gaaggtattc ctcagggat 59 <210> 10 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: pichia H Ifl <4 0 0> 10 tttttttctc gagaaaagac ttacgtatac tgac 34 <210> 11 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: pichia H Irev2 <4 0 0> 11 ttttttggcg ccgaattcac tattagttac agtagttttc c 41

Lisboa, 24 de Novembro de 2006 21

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ADN da forma: Px - Sx - Bn - (ZR) - Hir(AsmR) - proteína (Y) - T em que Px é qualquer sequência de ADN promotora, seleccionada de um modo que os rendimentos óptimos da proteína de interesse se tornam atingíveis; Sx é qualquer ADN codificando uma sequência sinal ou sequência líder que permite rendimentos óptimos; Bn são codões de 1-15 aminoácidos ou uma ligação química; Z é o codão de um aminoácido seleccionado a partir do grupo compreendendo Lis e Arg; R é um codão Arg ou uma ligação química; Asm é uma ligação química ou m codões de aminoácidos, em que m= 1-10; Hir é uma sequência de ADN que codifica a hirudina ou um derivado da hirudina que é pelo menos 40% homóloga com a hirudina natural, em que o derivado da hirudina pode ser exportado a partir da levedura com bons rendimentos semelhante aos da própria Hirudina; proteína Y é uma sequência de ADN que codifica uma mini-proinsulina e T é uma sequência de ADN não traduzida possuindo um efeito estabilizador no ARNm. 1
2. 2. Proteína de fusão codificada por qualquer uma das moléculas de ADN de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Vector multicópia compreendendo a molécula de ADN da reivindicação 1.
4. 4. Plasmídeo compreendendo a molécula de ADN da reivindicação 1.
5. 5. Célula hospedeira compreendendo uma molécula de ADN da reivindicação 1, um vector multicópia da reivindicação 3 e/ou plasmídeo da reivindicação 4, como uma parte do seu cromossoma, como uma parte de um mini-cromossoma, ou extra- cromossomalmente.
6. 6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, em que a referida célula hospedeira é uma levedura.
7. 7. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 seleccionada a partir do grupo compreendendo de S. cerivisiae, K. lactis, H. polymorpha, e P. pastoris.
8. 8. Processo de fermentação de uma proteína de fusão de acordo com a reivindicação 2, na qual (a) uma molécula de ADN da reivindicação 1, um vector multicópia da reivindicação 3, ou um plasmídeo da reivindicação 4 é expresso numa célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, e (b) a proteína de fusão expressa é isolada a partir do sobrenadante da cultura de celular. 2
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que após conclusão da fermentação, o pH é ajustado para 2,5-3,5 de modo a precipitar as proteínas não desejadas e é isolada a proteína de fusão expressa a partir do sobrenadante da precipitação.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em cujo processo, após a separação do sobrenadante da fermentação das células hospedeiras, as células hospedeiras são cultivadas repetidamente em meio fresco e a proteína de fusão libertada é isolada a partir de cada sobrenadante obtido durante a cultura.
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que um passo do processo para concentrar a proteína expressa no sobrenadante após precipitação é seleccionado a partir de um grupo compreendendo microfiltração, cromatografia de interacção hidrofóbica e cromatografia de troca iónica.
12. 12. Processo para preparar insulina, no qual (a) uma proteína de fusão é expressa e isolada de acordo com as reivindicações 9 a 11/ (b) a proteína de fusão é tratada com tripsina e carboxipeptidase B; e 3 (c) a insulina é isolada a partir da mistura da reacção do passo (b). Lisboa, 24 de Novembro de 2006 4