CN1228121A - 大量生产抗微生物肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了大量生产抗微生物肽的方法，该方法包括下列步骤：构建含有编码具有至少两个半胱氨酸残基的带负电的酸性肽的第一个基因和编码带正电的碱性抗微生物肽的第二个基因的融合基因；用包括该融合基因的表达载体转化宿主微生物；培养转化的微生物以表达含有酸性肽和抗微生物肽的融合肽；和回收表达的抗微生物肽。根据本发明，通过与酸性肽融合可以急剧减少表达的抗微生物肽对宿主微生物的生长的抑制作用。因此，从重组微生物可以大规模制备抗微生物的肽，不管抗微生物肽的种类如何。

Description

大量生产抗微生物肽的方法
发明背景 发明领域
本发明涉及大量生产抗微生物肽的方法，更具体地说，涉及通过基因操作手段生产有外源肽的融合蛋白质形式的抗微生物肽的大量生产抗微生物肽的方法。现有技术的描述
总的来说，抗微生物肽受物理和化学因素例如加热、碱等作用时不易于失去它们的生物学活性。而且，它们不易于诱导对微生物的抗性，因为它们通过其特征性作用机理显示抗微生物活性，显然它们的作用机理与常规抗生素有区别。因此，在药剂学、食品等领域抗微生物肽已经具有高工业实用性。
但是，抗微生物肽在工业上应用存在极困难的问题，因为常规技术不允许以低价格大量生产这样的肽。例如，化学合成不能以经济合理的方式大量生产抗微生物肽。关于这一点，本领域内技术人员已经提出了使用重组微生物的遗传工程技术作为一种可替代的方法。但是，该方法也已经显示了产量低的缺点，因为表达的抗微生物肽抑制重组微生物的生长。
美国专利5,205,154公开了包括抑制杀菌肽的抗微生物活性的载体多肽基因和杀菌肽的基因的基因构建体，其中araB用作为载体多肽，尽管载体多肽的特性不是关键的。
美国专利5,593,866教导了用于制备带正电的抗微生物肽的方法，所述肽为与带负电的肽融合的蛋白质，以抑制细菌蛋白质的裂解，其中将谷胱甘肽-S-转移酶、蛋白质A、蛋白质A的IgG-结合区域、铜绿假单孢菌的F蛋白质或前防卫素原用作为带负电的肽。
因此，非常需要研制和开发用于以经济方式大量生产抗微生物肽的可替代的方法。发明概述
本发明人已经对解决制备抗微生物肽的过程中低产量和低经济效率的缺点进行了尝试，并且借助于重组DNA技术以大规模和经济的方式成功地制备了抗微生物肽。
本发明的首要目的是提供在重组微生物中大量生产抗微生物肽的方法，该方法使用了可以大量生产抗微生物肽的表达系统。附图简述
根据下面给出的描述以及结合附图，本发明的上述和其它目的和特征是显而易见的，其中：
图1(A)显示了Guamerin基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和从其转译的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图1(B)显示MMIS(修饰的爪蟾抗菌肽插入片段)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和从其转译的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图2(A)是显示通过PCR对Guamerin基因与Buforin II基因的融合产物(SEQ ID NO：5)进行构建的方案图解。
图3是显示利用基因扩增载体构建多聚体融合基因的构建方案图解。
图4(A)是显示含有抗微生物肽MSI-78的基因和Guamerin基因的融合基因(基因I)(SEQ ID NO：7)的构建方案图解。
图4(B)是显示含有抗微生物肽MSI-78的基因和Guamerin基因的融合基因(基因II)(SEQ ID NO：8)的构建方案图解。
图5(A)是用含有包括Guamerin或MMIS的多聚体融合基因的载体转化的大肠杆菌在诱导蛋白质表达之后的细胞裂解物的SDS-PAGE模式。
图5(B)是用含有前爪蟾抗菌肽原基因的载体转化的大肠杆菌在诱导蛋白质表达之后的细胞裂解物的SDS-PAGE模式。
图6是用含有包括Guamerin基因和各种抗微生物肽的基因的融合基因的载体转化的大肠杆菌在诱导蛋白质表达之后的细胞裂解物的SDS-PAGE模式。
图7是用含有包括Guamerin基因和各种抗微生物肽的融合基因的载体转化的大肠杆菌在诱导蛋白质表达之后的细胞裂解物的SDS-PAGE模式。发明详述
本发明的大量生产抗微生物肽的方法包括下列步骤：构建含有编码具有至少两个半胱氨酸残基的酸性肽的第一个基因和编码碱性抗微生物肽的第二个基因的融合基因；用包括该融合基因的表达载体转化宿主微生物；培养转化的微生物以表达含有酸性肽和抗微生物肽的融合肽；和从该融合肽回收抗微生物的肽。
在实施本发明时，本质上需要包括编码具有至少两个半胱氨酸残基的酸性肽的第一个基因和编码碱性抗微生物肽的第二个基因的基因构建体，以及包括可操作连接到含有编码具有至少两个半胱氨酸残基的酸性肽的第一个基因和编码碱性抗微生物肽的第二个基因的序列的启动子的表达载体，该融合基因以单体或多体的方式存在。
与美国专利5,593,866的结果相反，本发明人发现：通常的酸性肽基因不允许碱性抗微生物肽进行有效的表达；并且酸性肽中的至少两个半胱氨酸残基的存在能够有效地解决所述的问题。
对于本发明的基因构建体，第一个基因编码为具有至少两个半胱氨酸残基和基本上中和抗微生物肽的正电荷的酸性肽。尽管酸性肽的长度没有限制，当考虑正电荷的长度和分布时优选的是它等同于或长于抗微生物肽的长度以便有效地中和所需的抗微生物肽的电荷。此外，酸性肽具有两个或多个半胱氨酸残基。推测由于借助于二硫键形成次级结构，半胱氨酸残基促进了酸性肽的负电荷和抗微生物肽的正电荷之间的相互作用。
根据本发明，可以采用人工方法合成或在天然酸性肽中选择酸性肽，并且可以利用编码肽的合成基因获得或从自然界分离。人工设计的酸性肽具有两个或多个半胱氨酸残基，可以将天然的酸性肽修饰为具有足够的半胱氨酸残基。为了易于与编码抗微生物肽的第二个基因融合，易于从融合肽分离抗微生物肽，或制备融合基因的各种多聚体形式，也可以以各种方式修饰酸性肽基因。
例如，可以合成或修饰酸性肽基因以便可以将它连接到抗微生物肽基因，从而具有正确的阅读框架，导致产生所需的抗微生物肽。也可以合成或修饰酸性肽基因以使之包括编码特异性蛋白酶或化学产品的裂解位点的核苷酸序列，以便从表达的融合肽分离抗微生物的肽。
可以在酸性肽基因的单体或多体中选择具有最适合于中和抗微生物肽的长度的酸性肽基因。通过使用基因扩增技术可以制备酸性肽基因的多体。例如，通过将在含有两个以相反方向定位的IIS类选择性酶位点的载体的两个IIS类选择性酶位点之间插入酸性肽基因，用IIS类选择性酶位点消化载体，分离含有酸性肽基因的DNA片段，自体连接分离的DNA片段以制备多体，并且将各个多体克隆到用IIS类选择性酶消化的该载体，能够制备包括酸性肽基因的多体的载体(参见：Lee，J.H.等人，遗传分析：生物分子工程学，13：139-145(1996))。
根据本发明，可以人工设计或在天然酸性肽中选择抗微生物的肽，并且可以利用编码所需肽的合成基因获得或从自然界分离。为了易于与酸性肽基因融合，易于从融合肽分离抗微生物的肽，或制备各个多体形式的融合基因，可用各个方法修饰抗微生物的肽基因。
例如，可以对抗微生物的肽基因进行修饰以便可以以正确的阅读框架将抗微生物肽的C-末端的区域连接到酸性肽的N-末端区域(抗微生物肽基因I)。
还可以将抗微生物肽的基因进行修饰以便在抗微生物肽的N-末端包括编码由特定的蛋白酶或化学物质裂解的位点的核苷酸序列，以便从表达的融合肽分离抗微生物的肽，并且在抗微生物肽的C-末端包括允许肽合成终止的核苷酸序列(抗微生物肽基因II)。
另外，可以将抗微生物的肽基因进行修饰以在抗微生物肽的N-末端和C-末端包括编码特定的蛋白酶或化学物质的裂解位点的核苷酸序列(例如，编码由CNBr裂解的甲硫氨酸残基的密码子)，以便从表达的融合肽分离抗微生物的肽(抗微生物肽基因III)。
通过将酸性肽基因和如上所述制备的抗微生物肽基因连接可以制备融合基因，并且酸性肽基因或抗微生物肽基因可以是如上所述的单体或多体。
根据本发明，融合基因含有编码酸性肽的第一基因和编码抗微生物肽的第二基因，这些基因可以通过直接或借助于连接段等间接连接，只要两个基因以正确的阅读框架连接。
在本发明的优选的实施方案中，通过将酸性肽基因和抗微生物肽基因修饰以在各个基因的单链的3’-末端具有互补的核苷酸序列，借助于部分杂交将两个基因退火，用杂交的基因作为模板和对应于各个单链基因的5’末端的序列作为引物进行PCR，可以制备融合基因。
采用本领域内的常规方法，例如融合基因的自体连接，可以将由此制备的各种数量的融合基因的单体连接以制备该融合基因的各种多体。通过使用基因扩增系统也可以制备融合基因的多体，例如，通过将在含有两个以相反方向定位的IIS类选择性酶位点的载体的两个IIS类选择性酶位点之间插入该融合基因，用IIS类选择性酶位点消化该载体，分离含有融合基因的DNA片段，自体连接分离的DNA片段以制备该融合基因的多体，并且将融合基因的多体克隆到用IIS类选择性酶消化的载体，能够制备包括融合基因的多体的载体。
在本发明的一个优选的实施方案中，融合基因的多体是包括抗微生物肽基因III的融合基因的多体。
在本发明的一个优选的实施方案中，融合基因的多体是其中将包括抗微生物肽基因II的融合基因连接到包括抗微生物肽基因I的融合基因的单体或多体的3’-末端的多体。
在本发明的一个优选的实施方案中，融合基因的多体是其中将包括抗微生物肽基因II的融合基因连接到包括抗微生物肽基因III的融合基因的单体或多体的3’-末端的多体。
可以将融合基因的多体克隆到合适的表达载体并且在微生物例如大肠杆菌中表达，从而表达融合肽的多体。用一种酶或化学物质例如CNBr处理融合肽的多体以去除酸性肽并且将抗微生物肽分离为单体，利用阳离子交换层析等纯化抗微生物的肽。当用一种酶或化学物质例如CNBr处理多体表达之后获得融合肽的多体，可以获得单体的天然形式的存在于多体的末端的抗微生物肽。
在下面的实施例中进一步描述本发明，这些实施例不应该被认为用于限制本发明的范围。特别是，由于实施例中使用的抗微生物肽，酸性肽和它们的多体仅仅是本发明的优选的实施方案，本发明覆盖了为了大量生产各个碱性抗微生物肽目的而使用含有至少两个半胱氨酸残基的酸性肽的所有发明的内容。
             实施例1：酸性肽的选择
将具有大量半胱氨酸残基的天然的Guamerin(下文中称之为“G”；Jung，H.I.等人(1995)生物化学杂志，270：13879-13884)和修饰的MIS(下文称之为“M”；Zasloff，M.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84：5449-5453)用作酸性肽。如在附图1(A)和1(B)(其中仅显示有意义链)中看到的，合成了编码酸性肽的单链寡聚核苷酸(SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3)。
以相同的摩尔比将由此合成的寡聚核苷酸溶解于TE缓冲液(pH8.0)，在70℃加热10分钟，并且在0℃保持30分钟。在20％(W/V)聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，分离双链DNA片段，并且克隆到用BbsI消化的pBBS1载体(参见：Lee，J.H.等人，遗传分析：生物分子工程，13：139-145(1996))以构建pBBS1-G1(Guamerin)或pBBS1-M1(MIS)载体。由于利用由此构建的pBBS1-G1或pBBS1-M1可以制备酸性肽基因的多体(pBBS1-Gn或pBBS1-Mn，n＝1，2，3......)，选择具有中和抗微生物肽最合适的长度的酸性肽。
         实施例2：抗微生物肽基因的制备
为了通过表达融合肽的多体形式的抗微生物肽并且用CNBr处理制备抗微生物肽，将甲硫氨酸密码子导入到Buforin II(TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(SEQ ID NO：9)(Park，C.B.等，(1996)生物化学和生物物理学研究通讯，218，408-413)，一种抗微生物肽的基因的两个末端。
合成编码Buforin II(下文中称之为“B”)的DNA序列并且克隆到用BbsI消化的pBBS1载体以构建pBBS1-B1载体。获得的pBBS1-B1载体含有完整的Buforin II基因和在Buforin II基因的两个末端含有两个甲硫氨酸密码子。
实施例3：制备含有酸性肽基因和抗微生物肽基因的融合基因
为了制备含有实施例1中的酸性肽基因和实施例2中的抗微生物肽基因的融合基因，按照如下所述进行PCR(参见：附图2(A)和2(B))：分别利用对应于酸性肽(即Guamerin)基因的5’-末端和3’末端的偶合引物(引物1：5’-AAAGAAGACGGCCCCCGGTCGACGAGAATGCG-3’(SEQ ID NO：10)和引物2：5’-GCTGCTACGGGTCATGATCCCCGCGCAGGT-3’(SEQ ID NO：11))，借助于PCR技术扩增Guamerin基因。同时，利用分别对应于抗微生物肽(Buforin II)的5’-末端和3’末端的偶合引物(引物3：5’-ACCTGCGCGGGGATCATGACCCGTAGCAGC-3’(SEQ ID NO：12)和引物4：5’-TGCATGCCTGC AG GTCGA-3’(SEQ ID NO：13))，通过PCR扩增Buforin II基因。
将由此扩增获得的PCR产物以相同的摩尔比例混合并且利用引物1(SEQ ID NO：10)和引物4(SEQ ID NO：13)通过PCR再扩增。由此获得的PCR产物用BbsI消化。然后，分离含有Guamerin基因和BuforinII基因的融合基因的片段，并且克隆到用BbsI消化的pBBS1载体以构建pBBS1-(GB)1载体(参见：附图2(A))。
然后，为了使用基因扩增系统制备融合基因的多体，将pBBS1-(GB)1载体用BbsI消化并且分离含有融合基因的片段。分离的DNA片段自体连接以制备多体，并且将各个多体克隆到用BbsI消化的pBBS1载体以构建含有命名为pBBS1-(GB)n(n＝1，2，3，4，......)的融合基因的多体的载体(参见附图3)。
另一方面，以类似于上面所述的方法，构建pBBS1-(MB)1载体和包括融合基因的多体的载体pBBS1-(MB)n(n＝1，2，3，4，......)，不同的是使用了MIS(含有S-S键)作为酸性肽替代Guamerin(参见：附图2(B))。
           实施例4：用于表达天然的抗微生物肽和
                  其多体的融合基因的制备
从实施例3制备的融合基因的多体获得的抗微生物多肽在其C-末端具有高丝氨酸残基。为了制备不含有高丝氨酸残基的天然的抗微生物肽，按照如下所述制备对在实施例3制备的融合基因的序列稍微修饰的融合基因：为了该目的，分别将Guamerin用作酸性肽并将MSI-78(GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK-氨基：SEQ ID NO：14)用作为抗微生物肽。
制备适用于该目的的两种抗微生物肽基因(下文分别称之为“BI”和“BII’)，而在制备抗微生物肽基因I时，使由该基因编码的肽可以在N-末端没有甲硫氨酸残基，并且在框架中将C-末端以正确的阅读框架融合到下列酸性肽基因，在制备抗微生物肽基因II时，使由该基因编码的肽可以在N-末端具有-个甲硫氨酸残基，并且使肽的合成可以在C-末端终止。
以类似于实施例3的方式分别将由此制备的抗微生物肽基因I和II连接到酸性肽基因以制备融合基因，和克隆到用BbsI消化的pBBS1载体以分别构建pBBS1-(GBI)1载体和pBBS1-(GBII)1载体(参见：附图4(A)和4(B))。使用基因扩增系统从pBBS1-(GBI)1载体制备GB I融合基因的多体，和将GB II融合基因的单体连接到该多体的末端以构建命名为pBBS1-[(GB I)n(GB II)](n＝0，1，2，3，4，......)的载体。
        实施例5：抗微生物肽的表达和制备
为了在大肠杆菌中表达克隆到实施例3和4中制备的载体的融合基因的多体，将该多体克隆到用BanH I/Hind III消化的pET21c(Novagen，USA)表达载体，并且转化到大肠杆菌BL21(DE3)，用以表达融合肽的多体。在诱导多体的表达之后，从培养基收集细胞。采用SDS-PAGE分析由此获得的裂解液(参见：附图5(A))。在附图5(A)中，泳道M显示分子量标记物；泳道1显示不含有表达载体的大肠杆菌的细胞裂解液；泳道2-14显示分别用pET21c，pET21c-B1，pET21c-B2，pET21c-B4，pET21c-B6，pET21c-(GB)1，pET21c-(GB)2，pET21c-(GB)4，pET21c-(GB)6，pET21c-(MB)1，pET21c-(MB)2，pET21c-(MB)4和pET21c-(MB)6转化的大肠杆菌的细胞裂解液。如图5(A)所示，发现与仅含Buforin II的多体相比，该多体的表达显著地增加了。在含有表达载体的重组大肠杆菌中，最后选择显示最大表达的重组体。
将按照如上所述证实其表达的融合肽的多体的包含体悬浮于含有1N盐酸和6M盐酸胍的溶液中，用1M CNBr处理。然后，利用Sep-Pak通过反相浓缩收集该肽，通过QAE-Sephadex(Sigma化学公司，USA)阴离子交换层析纯化带正电的抗微生物肽。通过反相HPLC进一步纯化由此分离的抗微生物肽以获得纯化的重组抗微生物肽。纯化的重组抗微生物肽的生物学活性分析已经显示它与上面的天然形式具有类似的抗微生物活性。
                     比较实施例1：
将具有类似于(MB)6的结构但是不含有半胱氨酸残基的编码前爪蟾抗菌肽原的基因(SEQ ID NO：15)克隆到pET21b(Novagen，USA)载体并且转化到大肠杆菌BL21(DE3)。核苷酸序列和由此转译的氨基酸序列如下所述(其中底下划线的序列是爪蟾抗菌肽1或2)：前爪蟾抗菌肽原ccaaaggcctctgcggatgaagatatggatgaaagagaggtccggggaattggtP  K  A  S  A  D  E  D  M  D  E  R   E  V  R   G  I  GaaatttttgcattcagcgggcaaatttggaaaagcttttgtgggagagataatgK  F  L  H  S  A  G  K  F  G  K  A   F  V  G  E  I  MaagtcaaaacgagatgcagaagcagtaggaccagaggcctttgcagatgaagatK  S  K  R  D  A  E  A  V  G  P  E   A  F  A  D  E  DttagatgaaagagaggtccggggaattggtaaatttttgcactcagcaaaaaaaL  D  E  R  E  V  R  G  I  G  K  F   L  H  S  A  K  KtttggaaaagcttttgtgggagagataatgaattcaaaacgagatgcagaagcaF  G  K  A  F  V  G  E  I  M  N  S  K   R  D  A  E  AgtaggaccagaggcctttgcagatgaagatttagatgaaagagaggtccggggaV  G  P  E  A  F  A  D  E  D  L  D  E   R  E  V  R  GattggtaaatttttgcactcagcaaaaaaatttggaaaagcttttgtgggagaaI  G  K  F  L  H  S  A  K  K  F  G  K   A  F  V  G  EataatgaattcaaaacgagatgcagaagcagtaggaccagaggcctttgcagatI  M  N  S  K  R  D  A  E  A  V  G  P   E  A  F  A  DgaagatttagatgaaagagaggtccggggaattggtaaatttttgcactcagcaE  D  L  D  E  R  E  V  R  G  I  G  K   F  L  H  S  AaaaaaatttggaaaagcttttgtgggagaaataatgaattcaaaacgagatgcaK  K  F  G  K  A  F  V  G  E  I  M  N   S  K  R  D  AgaagcagtaggaccagaggcctttgcagatgaagatttagatgaaagagaggtcE  A  V  G  P  E  A  F  A  D  E  D  L   D  E  R  E  VcggggaattggtaaatttttgcactcagcaaaaaaatttggaaaagcttttgtgR  G  I  G  K  F  L  H  S  A  K   K  F  G  K  A  F  VggagagataatgaattcaaaacgagatgcagaagcagtaggaccagaggcctttG  E  I  M  N  S  K  R  D  A  E   A  V  G  P  E  A  FgcagatgaagatttagatgaaagagaggtccggggaattggtaaatttttgcacA  D  E  D  L  D  E  R  E  V  R   G  I  G  K  F  L  HtcagcaaaaaaatttggaaaagcttttgtgggagagataatgaattcaaaacgaS  A  K  K  F  G  K  A  F  V  G   E  I  M  N  S  K  Rgatgcagaagcagta                        (SEQ ID NO：15)D  A  E  A  V                         (SEQ ID NO：16)
收集和裂解经过培养的转化体。通过SDS-PAGE分析由此获得的裂解液(参见：附图5(B))。在附图5(B)中，泳道M显示分子量标记物(97.4，66.2，45，31，21.5，14.4Kd)；泳道1和2显示在IPTG诱导之前和之后用pET21b转化的大肠杆菌的细胞裂解液；泳道3和4显示在IPTG诱导之前和之后用pET21b-(前爪蟾抗菌肽原)转化的大肠杆菌的细胞裂解液；如图5(B)所示，发现当利用相同的表达系统表达没有半胱氨酸的前爪蟾抗菌肽原时，没有观察到前爪蟾抗菌肽原的表达。
                  比较实施例2：
用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)序列和来源于HNP-I的作为酸性肽基因的前防卫素原序列和作为抗微生物肽基因的PGQ构建融合基因。
分别用BspLU11I和NcoI处理前防卫素原序列和GST基因并且连接到用NcoI消化的PGQ基因。在酸性肽和抗微生物肽之间导入-个甲硫氨酸残基以便进一步用CNBr裂解。将获得的融合基因克隆到pRSET(Invitrogen，USA)载体并且转化到大肠杆菌HMS174(DE3)。通过SDS-PAGE(参见：附图6)分析融合肽的表达。在附图6中，泳道M显示分子量标记物(97.4，66.2，45，31，21.5，14.4Kd)；泳道1显示大肠杆菌HMS174(DM3)的细胞裂解液；泳道2和3显示携带具有前原防卫素-PGQ和GST-PGQ的融合基因的载体的大肠杆菌的细胞裂解液。
携带具有上述融合基因的载体的大肠杆菌细胞的生长被严重地抑制了。如图6所示，发现没有观察到有以前防卫素原作为酸性肽的融合肽的表达，而观察到有以GST作为酸性肽的的非常低的表达。
   实施例6：包括作为酸性肽基因的Guamerin
             基因的融合基因的制备
对编码Guamerin的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)进行稍微的修饰以便其C-末端可以用BspHI消化，当将Guamerin基因融合到抗微生物肽基因时，在抗微生物肽基因的前面可以插入甲硫氨酸密码子，以便通过CNBr裂解融合肽仅分离到纯化的抗微生物肽。
首先，按照如下所述合成含有BamHI和NdeI限制性酶位点的N-末端寡聚核苷酸和含有BamHI和BspHI限制性酶位点的C-末端寡聚核苷酸：
N-末端寡聚核苷酸：
5’-CGGGATCCATATGCCCCCGGTCGAC-3’(25聚体)
(SEQ ID NO：17)
C-末端寡聚核苷酸：
5’-CGGGATCCTCATGATACCCGCGCAG-3’(25聚体)
(SEQ IDNO：18)
利用由此合成的N-末端和C-末端的寡聚核苷酸引物和Guamerin基因(附图1)作为模板，进行PCR合成新的Guamerin基因。
对本领域内已知的8个抗微生物肽(参见：肽科学，37期，105-122(1995))进行选择以融合肽形式表达它们，其生物化学特性概括于表1。基于大肠杆菌密码子的使用从相应的肽序列(SEQ ID NO：20；SEQ IDNO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：28；SEQ IDNO：30；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：36)推测下面的DNA序列(SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：35)，并且合成它们备用。Apidaecin Iggt aac aac cgt ccg gtt tac atc ccg cag ccg cgt ccg ccgG   N   N   R   P   V   Y   I   P   Q   P   R   P   Pcac ccg cgt act                          (SEQ ID NO：19)H   P   R   I                           (SEQ ID NO：20)Bombininggt atc ggt gcg ctg tct gcg aaa ggt gcg ctg aaa ggt ctgG   I   G   A   L   S   A   K   G   A   L   K   G*  Lgcg aaa ggt ctg gcg gaa cac ttc gcg aac  (SEQ ID NO：21)A   K   G   L   A   E   H   F   A   N   (SEQ ID NO：22)Cecropin Aaaa tgg aaa ttc aaa aaa atc gaa aaa gtt ggt cag aac atcK   W   K   F   K   K   I   E   K   V   G   Q   N   Icgt gac ggt atc atc aaa gcg ggt ccg gcg gtt gcg gtt gttR   D   G   I   I   K   A   G   P   A   V   A   V   Vggt cag gcg acc cag atc gcg aaa         (SEQ ID NO：23)G   Q   A   T   Q   I   A   K          (SEQ ID NO：24)Drosoc1nggt aaa ccg cgt ccg tac tct ccg cgt ccg acc tct cac ccgG   K   P   R   P   Y   S   P   R   P   T   S   H   Pcgt ccg atc gcg gtt                     (SEQ ID NO：25)R   P   I   A   V                      (SEQ ID NO：26)HNP-Igcg tgc tac tgc cgt atc ccg gcg tgc atc gcg ggt gag cgtA   C   Y   C   R   I   P   A   C   I   A   G   E   Rcgt tac ggt acc tgc atc tac cag ggt cgt ctg tgg gcg ttcR   Y   G   T   C   I   Y   Q   G   R   L   W   A   Ftgc tgc                                 (SEQ ID NO：27)C    C                                  (SEQ ID NO：28)Indolicidinatc ctg ccg tgg aaa tgg ccg tgg tgg ccg tgg cgt cgtI   L   P   W   K   W   P   W   W   P   W   R   R
                                (SEQ ID NO：29)
                                (SEQ ID NO：30)Magainin (MST-344 *)ggt atc ggc aaa ttc ctg aaa aag gct aag aaa ttt ggt aagG   I   G   K   F   L   K   K   A   K   K   F   G   Kgcg ttc gtt aaa atc ctg aaa aag     (SEQ ID NO：31)A   F   V   K   I   L   K   K      (SEQ ID NO：32)Melittinggt act ggt gcg gtt ctg aaa gtt ctg acc acc ggt ctg ccgG   I   G   A   V   L   K   V   L   T   T   G   L   Pgcg ctg atc tct tgg atc aaa cgt aaa cgt cag cagA   L   I   S   W   I   K   R   K   R   Q   Q
                                    (SEQ ID NO：33)
                                    (SEQ ID NO：34)Tachvplesin Iaaa tgg tgc ttc cgt gtt tgc tac cgt ggt atc tgc tac cgtK   W   C   F   F   V   C   Y   R   G   I   C   Y   Rcgt tgc cgt                             (SEQ ID NO：35)R   C   R                              (SEQ ID NO：36)
表1：各种抗微生物肽的生物化学特性*
    肽 氨基酸数目 分子量(kDa)      pI    来源
 ApidaecinI     18     2.1     12.21    昆虫
  Bombinin     24     29     10.34     蛙
  杀菌肽A     36     3.89     10.89     蛾
  Drosocin     19     2.11     12.22    苍蝇
    HNP1     30     3.46     8.28     人
 Indolicidin     13     1.91     12.51    母牛
 爪蟾抗菌肽(MSI-344)     22     2.48     11.41     蛙
  Melittin     26     2.85     12.53    昆虫
TachyplesinI     17     2.27     10.01     蟹
*：选自于肽科学，第37期，105-122(1995)
通过分别将合成的Guamerin基因与显示于表1的各种抗微生物肽基因融合制备各种Guamerin-抗微生物肽融合基因。就是说，用BspHI消化合成的Guamerin基因以获得与BspHI或NcoI裂解位点互补的末端，并且与用NcoI消化的所合成的抗微生物肽基因融合以制备融合基因。
              实施例7：抗微生物肽的表达
为了在大肠杆菌中表达实施例6制备的融合基因，使用pRSET(Invitrogen，USA)表达载体。用BamHI和EcoRI消化表达载体，脱磷酸化，并且克隆在实施例6合成的Guamerin-抗微生物肽融合基因。采用氯化钙方法用具有融合基因的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(参见：Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第二版(1989))。
于37℃在补充了氨苄青霉素的5毫升LB培养基中培养转化体过夜。在5毫升的新鲜LB培养基中将培养的细胞稀释到终浓度为1％(V/V)，并且在37℃培养2小时。然后，将乳糖加入到培养基中至终浓度为2％，在37℃，保温4小时以诱导融合肽的表达。通过SDS-PAGE分析融合基因的表达(参见：附图7)。在附图7中，泳道M显示分子量标记物(97.4，66.2，45，31，21.5，14.4Kd)；泳道1-8显示用融合基因转化的大肠杆菌的细胞裂解液，其中分别将编码apidaecin I，bombinin，杀菌肽A，drosocin，HNP1，indolicidin，melittin和tachyplesin I的基因用作为抗微生物肽基因。
如在上文清楚地阐明和证实的，本发明提供了大量生产抗微生物肽的方法，该方法包括制备具有外源肽的融合肽形式的抗微生物肽的步骤。根据本发明，通过将它与酸性肽融合可以急剧减少表达的抗微生物肽对宿主微生物的生长的抑制作用。因此，从重组微生物可以大规模制备抗微生物的肽，不管抗微生物肽的种类如何。
                             序列表
                             序列表(1)-般资料：(i)申请人：
(A)姓名：SAMYANG GENEX公司等
(B)街道：263，Yonji-Dong，Chongno-Ku
(C)城市：汉城
(D)州：不适用
(E)国家：韩国
(F)邮政编码(ZIP)：110-470
(G)电话：042-865-8305
(H)传真：042-865-8399(ii)发明名称：大量生产抗微生物肽的方法(iii)序列数目：36(iv)计算机可读形式：
(A)媒介类型：Floppy盘
(B)计算机：IBMPC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：Patent In Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：I的资料(i)序列特征
(A)长度：183个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(iv)反义：不是(vii)直接的来源：
(B)克隆：Guamerin基因(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CCCCCGGTCG ACGAGAATGC GGAGGACACA CATGGTCTCT GCGGGGAAAA   50AACCTGCTCT CCAGCACAAG TCTGTCTAAA CAACGAATGC GTTTGCACTG  100CAATCAGATG CGAGATCTTC TGTCCTAACG GATTCAAAGT TGATGAGAAT  150GGATGCGAAT ACCCATGTAC CTGCGCGGGG ATC                    183(2)SEQ ID NO：2的资料(i)序列特征
(A)长度：61个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(vii)直接的来源：
(B)克隆：Guamerin(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Pro Pro Val Asp Glu Asn Ala Glu Asp Thr His Gly Leu Cys1                5                   10Gly Glu Lys Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn15                  20                  25Glu Cys Val Cys Thr Ala Ile Arg Cys Glu Ile Phe Cys Pro
30              35              40Asn Gly Phe Lys Val Asp Glu Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys
    45                  50                  55Thr Cys Ala Gly Ile
        60(2)SEQ ID NO：3的资料(i)序列特征
(A)长度：81个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(iv)反义：不是(vii)直接的来源：
(B)克隆：MIS(爪蟾抗菌肽插入片段)基因(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CCCCTGTGCG ATGCAGAAGC AGTAGGACCA GAGGCCTTTG CAGATGAAGATTTAGATGAA TGCCCCCGGG TCTTCTAGAG T(2)SEQ ID NO：4的资料(i)序列特征
(A)长度：27个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(vii)直接的来源：
(B)克隆：MIS  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Pro Leu Cys Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala1                 5                 10Asp Glu Asp Leu Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp Glu Cys15                  20                  25(2)SEQ ID NO：5的资料(i)序列特征
(A)长度：84个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(vii)直接的来源：
(B)克隆：Guamerin/BuforinII融合蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Pro Pro Val Asp Glu Asn Ala Lys Asp Thr His Gly Leu Cys1                5                  10Gly Glu Lys Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn15                  20                  25Glu Cys Val Cys Thr Ala Ile Arg Cys Met Ile Phe Cys Pro
 30                 35                  40Asn Gly Phe Lys Val Asp Lys Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys
    45                  50                  55Thr Cys Ala Gly Ile Met Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu
        60                  65                  70Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys Met
            75                  80(2)SEQ ID NO：6的资料(i)序列特征：
(A)长度：46个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(vii)直接来源：
(B)克隆：MIS/BuforinII融合蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Pro Leu Cys Asp Ala Lys Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala1                5                  10Asp Glu Asp Leu Asp Glu Cys Pro Leu Met Thr Arg Ser Ser15                  20                  25Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu
30                  35                  40Leu Arg Lys Met
    45(2)SEQ ID NO：7的资料(i)序列特征：
(A)长度：84个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(vii)直接来源：
(B)克隆：Guamerin/MIS-78融合蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Pro Pro Val Asp Glu Asn Ala Glu Asp Thr His Gly Leu Cys1                5                   10Gly Glu Lys Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn15                  20                  25Glu Cys Val Cys Thr Ala Ile Arg Cys Glu Ile Phe Cys Pro
30                  35                  40Asn Gly Phe Lys Val Asp Glu Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys
    45                  50                  55Thr Cys Ala Gly Ile Cys Gly Ile Gly Lys Phe Leu Lys Lys
        60                  65                  70Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Lys Ile Leu Lys Lys
            75                  80(2)SEQ ID NO：8的资料(i)序列特征：
(A)长度：84个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(vii)直接来源：
(B)克隆：Guamerin/MIS-78融合蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Pro Pro Val Asp Glu Asn Ala Glu Asp Thr His Gly Leu Cys1                5                  10Gly Glu Lys Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn15                  20                  25Glu Cys Val Cys Thr Ala Ile Arg Cys Glu Ile Phe Cys Pro
30                  35                  40Asn Gly Phe Lys Val Asp Glu Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys
    45                  50                  55Thr Cys Ala Gly Ile Met Gly Ile Gly Lys Phe Leu Lys Lys
        60                  65                  70Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Lys Ile Leu Lys Lys
            75                  80(2)SEQ ID NO：9
(A)长度：21个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(vii)直接来源：
(B)克隆：BuforinII(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg1               5                  10Val His Arg Leu Leu Arg Lys15                  20(2)SEQ ID NO：10的资料(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(vii)直接来源：
(B)克隆：引物(xi)序列描述：SEQ ID NO：10
AAAGAAGACG GCCCCCGGTC GACGAGAATG CG               32(2)SEQ ID NO：11的资料  (i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(vii)直接来源：
(B)克隆：引物(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
GCTGCTACGG GTCATGATCC CCGCGCAGGT                  30(2)SEQ ID NO：12的资料(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(vii)直接来源：
(B)克隆：引物(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
ACCTGCGCGG GGATCATGAC CCGTAGCAGC                  30(2)SEQ ID NO：13的资料(i)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(vii)直接来源：
(B)克隆：引物(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：TGCATGCCTG CAGGTCGA                                18(2)SEQ ID NO：14的资料
(A)长度：22个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(vii)直接来源：
(B)克隆：MSI-78(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Gly Ile Gly Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys1                5                  10Ala Phe Val Lys Ile Leu Lys Lys15                  20(2)SEQ ID NO：15的资料(i)序列特征：
(A)长度：825个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(iv)反义：不是(vii)直接来源：
(B)克隆：前爪蟾抗菌肽基因(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CCAAAGGCCT CTGCGGATGA AGATATGGAT GAAAGAGAGG TCCGGGGAAT   50TGGTAAATTT TTGCATTCAG CGGGCAAATT TGGAAAAGCT TTTGTGGGAG  100AGATAATGAA GTCAAAACGA GATGCAGAAG CAGTAGGACC AGAGGCCTTT  150GCAGATGAAG ATTTAGATGA AAGAGAGGTC CGGGGAATTG GTAAATTTTT  200GCACTCAGCA AAAAAATTTG GAAAAGCTTT TGTGGGAGAG ATAATGAATT  250CAAAACGAGA TGCAGAAGCA GTAGGACCAG AGGCCTTTGC AGATGAAGAT  300TTAGATGAAA GAGAGGTCCG GGGAATTGGT AAATTTTTGC ACTCAGCAAA  350AAAATTTGGA AAAGCTTTTG TGGGAGAAAT AATGAATTCA AAACGAGATG  400CAGAAGCAGT AGGACCAGAG GCCTTTGCAG ATGAAGATTT AGATGAAAGA  450GAGGTCCGGG GAATTGGTAA ATTTTTGCAC TCAGCAAAAA AATTTGGAAA  500AGCTTTTGTG GGAGAAATAA TGAATTCAAA ACGAGATGCA GAAGCAGTAG  550GACCAGAGGC CTTTGCAGAT GAAGATTTAG ATGAAAGAGA GGTCCGGGGA  600ATTGGTAAAT TTTTGCACTC AGCAAAAAAA TTTGGAAAAG CTTTTGTGGG  650AGAGATAATG AATTCAAAAC GAGATGCAGA AGCAGTAGGA CCAGAGGCCT  700TTGCAGATGA AGATTTAGAT GAAAGAGAGG TCCGGGGAAT TGGTAAATTT  750TTGCACTCAG CAAAAAAATT TGGAAAAGCT TTTGTGGGAG AGATAATGAA  800TTCAAAACGA GATGCAGAAG CAGTA                   825(2)SEQ ID NO：16的资料
(A)长度：275个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(vii)直接来源：
(B)克隆：前爪蟾抗菌肽原基因(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Pro Lys Ala Ser Ala Asp Glu Asp Met Asp Glu Arg Glu Val1                5                  10Arg Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Gly Lys Phe Gly15                  20                  25Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Lys Ser Lys Arg Asp Ala
  30                  35                  40Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp
      45                  50                  55Glu Arg Glu Val Arg Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala
          60                  65                  70Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Asn Ser
              75                  80Lys Arg Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala Asp85                  90                  95Glu Asp Leu Asp Glu Arg Glu Val Arg Gly Ile Gly Lys Phe
  100                 105                 110Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu
      115                 120                 125Ile Met Asn Ser Lys Arg Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu
          130                 135                 140Ala Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp Glu Arg Glu Val Arg Gly
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170                 175                 180Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp Glu Arg
    185                 190                 195Glu Val Arg Gly Ile Gly Lys phe Leu His Ser Ala Lys Lys
        200                 205                 210Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Asn Ser Lys Arg
            215                 220Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala Asp Glu Asp225                 230                 235Leu Asp Glu Arg Glu Val Arg Gly Ile Gly Lys Phe Leu His
240                 245                 250Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met
    255                 260                 265Asn Ser Lys Arg Asp Ala Glu Ala Val
        270                 275(2)SEQ ID NO：17的资料(i)序列特征：
(A)长度：25个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(vii)直接来源：
(B)克隆：引物(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
CGGGATCCAT ATGCCCCCGG TCGAC                           25(2)SEQ ID NO：18的资料(i)序列特征：
(A)长度：25个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(vii)直接来源：
(B)克隆：引物(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：CGGGATCCTC ATGATACCCG CGCAG                             25(2)SEQ ID NO：19的资料(i)序列特征：
(A)长度：54个碱基对；
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(iv)反义：不是(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：GGTAACAACC GTCCGGTTTA CATCCCGCAG CCGCGTCCGC CGCACCCGCG   50TACT                                                     54(2)SEQ ID NO：20的资料
(A)长度：18个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(vii)直接来源：
(B)克隆：Apidaecin I(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro1                5                  10His Pro Arg Ile15(2)SEQ ID NO：21的资料(i)序列特征：
(A)长度：72个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(B)克隆：Bombinin(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：Gly Ile Gly Ala Leu Ser Ala Lys Gly Ala Leu Lys Gly Leu1                5                  10Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe Ala Asn15                  20(2)SEQ ID NO：23的资料(i)序列特征：
(A)长度：108个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(A)长度：36个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(vii)直接来源：
(B)克隆：Cecropin A(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：Lys Trp Lys Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile1                5                  10Arg Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val15                  20                  25Gly Gln Ala Thr Gln Ile Ala Lys
30                  35(2)SEQ ID NO：25的资料(i)序列特征：
(A)长度：57个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(iv)反义：不是(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：GGTAAACCGC GTCCGTACTC TCCGCGTCCG ACCTCTCACC CGCGTCCGAT        50CGCGGTT                                 57(2)SEQ ID NO：26的资料
(A)长度：19个氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(B)克隆：Drosocin(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Ser His pro1                5                  10Arg Pro Ile Ala Val15(2)SEQ ID NO：27的资料(i)序列特征：
(A)长度：90个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(iv)反义：不是(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：GCGTGCTACT GCCGTATCCC GGCGTGCATC GCGGGTGAGC GTCGTTACGG 50TACCTGCATC TACCAGGGTC GTCTGTGGGC GTTCTGCTGC         90(2)SEQ ID NO：28的资料
(A)长度：30个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(vii)直接来源：(B)克隆：HNP-1(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：Ala Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg1                5                   10Arg Tyr Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe15                  20                  25Cys Cys
30(2)SEQ ID NO：29的资料(i)序列特征：
(A)长度：39个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(iv)反义：不是(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：ATCCTGCCGT GGAAATGGCC GTGGTGGCCG TGGCGTCGT              39(2)SEQ ID NO：30的资料
(A)长度：13个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(vii)直接来源：
(B)克隆：Indolicidin(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg1                5                  10(2)SEQ ID NO：31的资料(i)序列特征：
(A)长度：66个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(iv)反义：不是(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：GGTATCGGCA AATTCCTGAA AAAGGCTAAG AAATTTGGTA AGGCGTTCGT   50TAAAATCCTG AAAAAG                                        66(2)SEQ ID NO：32的资料
(A)长度：22个氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(B)克隆：爪蟾抗菌肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：Gly Ile Gly Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys1                5                  10Ala Phe Val Lys Ile Leu Lys Lys15                  20(2)SEQ ID NO：33的资料(i)序列特征：
(A)长度：78个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(A)长度：26个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(vii)直接来源：
(B)克隆：Melittin(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro1                5                  10Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln15                  20                  25(2)SEQ ID NO：35的资料(i)序列特征：
(A)长度：51个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(iv)反义：不是(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：AAATGGTGCT TCCGTGTTTG CTACCGTGGT ATCTGCTACC GTCGTTGCCG 50T                                              51(2)SEQ ID NO：36的资料
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(vii)直接来源：
(B)克隆：Tachyplesin I  (xi)序列描述：SEQ ID NO：36：Lys Trp Cys Phe Phe Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg1                 5                 10Arg Cys Arg15

Claims (6)

1.大量生产抗微生物肽的方法，该方法包括下列步骤：
(i)构建含有编码具有至少两个半胱氨酸残基的带负电的酸性肽的第一个基因和编码带正电的碱性抗微生物肽的第二个基因的融合基因；
(ii)用包括该融合基因的表达载体转化宿主微生物；
(iii)培养转化的微生物以表达含有酸性肽和抗微生物肽的融合肽；和
(iV)回收所表达的抗微生物肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中融合基因在酸性肽和抗微生物肽之间含有蛋白酶或一种化学物质的至少一个裂解位点。
3.根据权利要求1所述的方法，其中酸性肽的负电荷基本上中和抗微生物肽的正电荷。
4.根据权利要求1所述的方法，其中表达载体包括融合基因的多体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中表达载体包括可操作连接到编码融合肽的基因的启动子，该融合肽含有中和抗微生物肽的正电荷并且至少具有两个半胱氨酸残基的酸性肽和一种抗微生物肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其中该基因是多体的形式，该多体包括编码中和抗微生物肽的正电荷和具有至少两个半胱氨酸残基的酸性肽的第一个基因和编码带正电荷的抗微生物肽的第二个基因，所述第二个基因融合到第一个基因。
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