CN102724992B - 肽的重组产生 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重复自组装前体蛋白质、编码其的核酸序列及表达构建体、及使用此类前体蛋白质重组产生肽的方法。
Description
本发明涉及重复自组装前体蛋白质、编码其的核酸序列及表达构建体、及通过使用此类前体蛋白质重组产生肽的方法。
发明背景
存在不同已知方法通过生物技术手段来产生肽。因为短的多肽链在微生物宿主细胞中之稳定性通常较低，且因为此类游离肽可对宿主生物产生可能毒性作用(例如抗微生物肽)，所以大多数方法包含产生较大前体蛋白质，在纯化前体蛋白质之后自该前体蛋白质切除肽。
获得稳定前体蛋白质之一可能性包含借助于融合蛋白质表达肽以及稳定蛋白质。该融合蛋白质之性质极大地影响后续处理步骤，其由基本上与肽序列无关之融合配偶体决定，且因此可易于控制且适于产生具有不同序列之肽。
WO2008/085543描述一种借助于融合蛋白质产生蛋白质及肽之特殊方法。此融合蛋白质除所需肽序列以外亦包含融合配偶体，该融合配偶体确保融合蛋白质具有逆相变行为。此行为首先涉及以简单且廉价之方式自细胞环境中纯化融合蛋白质。其次，在已通过蛋白质裂解将肽移除之后，同样可以简单且廉价之方式移除该融合配偶体。虽然融合蛋白质常可以优良产率获得，但前体蛋白质之肽部分通常较小，且因此此过程之效率并非最佳。
另一方法涉及重复前体蛋白质，其包含重组产生之所需肽的多个拷贝。WO03/089455描述多聚前体蛋白质之产生，通过酸裂解自此类多聚前体蛋白质中切除具有抗微生物性质之所需肽序列。
存在许多其他公开方法(实例：Metlitskaya等人，BiotechnolAppl.Biochem39；339-345(2004)；Wang及CaiAppl.BiochemandBiotechnol.141；203-213(2007))，其用于证明肽序列或肽序列家族可通过特定方法借助于重复前体蛋白质来产生。在某种程度上，已描述位于所需肽序列之重复序列之间的特点辅助序列之用途。更具体地，已提出阴离子辅助序列，其明显减少重复前体蛋白质内之阳离子抗微生物肽序列对宿主细胞之有害作用(参看例如WO00/31279及US2003/0219854)。虽然此重复方法中之前体蛋白质的所需肽序列比例比融合蛋白质之情况高，但所需阳离子肽序列极大地影响此类重复前体蛋白质之性质。
本发明人并不了解涉及根据可以有效方式进行之简单且低成本方案借助于重复前体蛋白质产生任何肽序列之可能性的任何先前方法。
各种抗微生物肽已描述于文献中且概括于评述中(Hancock，R.E.W.及Lehrer，R.1998，TrendsinBiotechnology，16：82-88；Hancock，R.E.W.及Sahl，H.G.2006，NatureBiotechnology，24：1551-1557)。
文献中亦描述组合两种活性肽之融合肽。Wade等人报导刻克罗普斯蚕蛾(Hyalophoracecropia)杀菌肽(cecropin)A与毒性蜂毒肽之各种融合物的抗菌作用(Wade，D.等人.，1992，IntemationalJoumalofPeptideandProteinResearch，40：429-436)。Shin等人描述由20个氨基酸组成的刻克罗普斯蚕蛾杀菌肽A与光滑爪蟾(Xenopuslaevis)爪蟾抗菌肽(magainin)2之融合肽的抗菌作用。杀菌肽A由37个氨基酸组成且显示出其对抗革兰氏阴性细菌(Gram-negativebacteria)之活性低于对抗革兰氏阳性细菌之活性。爪蟾抗菌肽2由23个氨基酸组成且对细菌以及肿瘤细胞系具有活性。与天蚕抗菌肽A与蜂毒肽之融合物相比，此融合物显示在可比抗菌作用下明显较低之溶血活性(Shin，S.Y.Kang，J.H.，Lee，M.K.，Kim，S.Y.，Kim，Y.，Hahm，K.S.，1998，BiochemistryandMolecularBiologyIntemational，44：1119-1126)。US2003/0096745Al及US6,800,727B2要求保护由20个氨基酸组成之此等融合肽，及因氨基酸取代、尤其带正电荷氨基酸及疏水性氨基酸之取代而带更多正电荷且疏水性更强的该融合物之变体。
Shin等人，1999描述此天蚕抗菌肽A-爪蟾抗菌肽2融合肽之进一步发展。他们证明具有SEQIDNO：6之肽的溶血活性比起始融合物低，但其对大肠杆菌(Escherichiacoli)及枯草杆菌(Bacillussubtilis)之抗菌活性未受到不利影响(Shin等人，1999JoumalofPeptideResearch，53：82-90)。
发明简述
因此，本发明之一目标为提供一种借助于重复前体蛋白质产生肽之广泛适用方法。
通过一种经由生物技术手段产生肽之新颖方法来实现此目标，其中以可预期方式产生包含高比例所需肽序列且包含控制前体蛋白质性质之辅助序列的重复前体蛋白质。该方法可用于产生不同肽序列而无需针对不同肽序列之每一者在根本上重建使前体分子表达之条件或后续处理程序。此外，可能产生出先前所用方法无效率产生之肽。
附图简述
图1描绘借助于投影α螺旋结构获得之氨基酸序列之螺旋轮表示。重复前体蛋白质中所包含之氨基酸序列A1-A7(A)描绘于环(B)上。此排列显现出α-螺旋中氨基酸之位置
图2描绘在酸裂解之后肽“ZnO”之逆相层析图；
图3描绘在酸裂解及反相HPLC之后“ZnO”肽之质谱；所示数值表示特定单同位素峰之m/z值；
图4描绘在酸裂解及阳离子交换层析之后肽“P18”之反相层析图；
图5描绘在酸裂解、阳离子交换层析及反相HPLC之后“P18”肽之质谱；所示数值指示特定单同位素峰之m/z值；
图6描绘在酸裂解之后肽“Min”之反相层析图；
图7描绘在酸裂解及反相HPLC之后“Min”肽之质谱；所示数值指示特定单同位素峰之m/z值；
图8描绘在酸裂解及阳离子交换层析之后肽SEQIDNO：6之反相层析图；
图9描绘在酸裂解、阳离子交换层析及反相HPLC之后肽SEQIDNO：6之质谱；所示数值为具体单同位素峰之m/z值；
图10描绘在根据实施例6进行酰胺化之前及之后肽“P18”之HPLC阳离子交换层析图；出于比较之目的，展示具有肽“P18”序列之以化学方式合成且酰胺化之参考肽的层析图；
图11描绘在根据实施例7进行酰胺化之前及之后肽“P18”之HPLC阳离子交换层析图；出于比较之目的，展示具有肽“P18”序列之以化学方式合成且酰胺化之参考肽的层析图。
优选实施方案
本发明尤其涉及以下实施方案：
1.一种合成、尤其重组产生之前体蛋白质，其包含所需肽(Pep)组件与辅助肽(Aux)组件之重复单元的以酶促及/或化学方式可裂解之重复序列，通式如下：
(Pep-Aux)x或
(Aux-Pep)x
其中x＞1，其中
此类Aux组件为相同或不同的且包含赋予该前体蛋白质自组装性质之氨基酸序列组件；且
此类Pep组件为相同或不同的且包含相同或不同肽分子之氨基酸序列。
2.如实施方案1之前体蛋白质，其中此类组件Pep与Aux直接或经由可裂解之肽序列以肽键连接彼此，且该肽键可以化学方式或酶促方式特异性裂解，亦即，仅仅或主要在确定氨基酸位置或确定氨基酸序列处裂解。
3.如前述实施方案中任一实施方案之前体蛋白质，其具有自组装性质以使自发(亦即自行)或经诱导形成稳定之非共价缔合物，此类缔合物在标准条件下，如尤其在室温下，无法在一小时内由0.2MNaOH溶解，或无法在10分钟内由2M尿素或1m盐酸胍溶解。本发明之稳定缔合物由所提及之此三种标准中之至少一者被满足而产生。
4.如前述实施方案中任一实施方案之前体蛋白质，其中至少一个Aux组件包含自组装肽(SA)组件，其中该SA组件包含至少一个具有至少8个，诸如8-10、8-12、8-14、8-16、8-18或8-20个连续氨基酸之序列基序，该序列基序包含至少50％、例如50-100％、60-90％或70-80％之丙氨酸残基，至少50％、例如50-100％、60-90％或70-80％之缬氨酸残基，或至少50％、例如50-100％、60-90％或70-80％之谷氨酰胺残基，或至少80％之序列基序由此等残基中至少一个组成；该SA组件可尤其包含例如至少一种以下序列基序：
An(基序1)
(GA)m(基序2)
Vn(基序3)
(VA)m(基序4)
(VVAA)o(基序5)
其中A为丙氨酸，G为甘氨酸，V为缬氨酸，n为2至12之整数，m为2至10之整数，且o为1至6之整数，其中更具体地，n＝5-10，m＝4-8且o＝2-4，举例而言，n＝7-9，m＝6-7且o＝2-3。
上述SA序列在各情况下可在C端及/或N端上延长另外1至3个随机氨基酸残基。适合N端延长之实例为序列基序“G-”，“GS-”，“GAG-”，“GPG-”，“GPS-”，“GAS-”，“GQQ-”和“GSS-”；适合C端延长的实例包含序列基序“-SGP”，“-GGA”，“-GPG”，“-SGA”，“-GGQ”，“-GGY”及“-GGL”。
5.如实施方案4之前体蛋白质，其中该SA组件包含选自氨基酸序列SEQIDNO：1至SEQIDNO：5或SEQIDNO：73之氨基酸序列。
6.如前述实施方案中任一实施方案之前体蛋白质，其中至少一个Aux肽另外包含保护性肽(SU)组件。
7.如实施方案6之前体蛋白质，其中该SU组件具有“比例增加”之带电氨基酸残基，亦即(例如在pH＝7下)非0之总带电量，例如+20至-20或+10至-10或+5至-5，尤其带负电荷氨基酸残基，例如在pH＝7下，非0之总带电量，例如-1至-20，尤其-4至-10。
8.如实施方案7之前体蛋白质，其中该前体蛋白质中之SU组件能够形成两亲性螺旋结构。
9.如实施方案8之前体蛋白质，其中该SU组件为两亲性肽，其包含能够形成两亲性α-螺旋之具有至少七个以肽键连接之氨基酸的序列区段，其中该螺旋之氨基酸残基在垂直投影中分为该螺旋之疏水性半部及亲水性半部，在该垂直投影中该螺旋之疏水性半部具有至少3个、例如3或4个相邻的相同或不同疏水性氨基酸残基，且在该垂直投影中该螺旋之亲水性半部具有至少3个、例如3或4个相邻的相同或不同亲水性氨基酸残基。
10.如实施方案7、8或9之前体蛋白质，其中选择该SU组件之带电氨基酸残基之比例，使得在pH＝7下该前体蛋白质之总净电荷大于-10且小于+10，例如大于-8且小于+8，大于-5，尤其小于+5，大于-2且小于+2。
11.如实施方案7至10中任一实施方案之前体蛋白质，其中该SU组件包含选自氨基酸序列SEQIDNO：16至SEQIDNO：19及SEQIDNO：68之氨基酸序列。
12.如前述实施方案中任一实施方案之前体蛋白质，其中该Pep组件包含具有阳离子总正电荷之抗微生物肽序列。
13.如实施方案12之前体蛋白质，其中该Pep组件包含选自阳离子氨基酸序列SEQIDNO：6至SEQIDNO：15、SEQIDNO：23、SEQIDNO：26及SEQIDNO：69至SEQIDNO：72或任何以下所示其在C端及/或N端上经修饰之形式的氨基酸序列。
14.如实施方案1至5中任一实施方案之前体蛋白质，其中该Pep肽包含选自氨基酸序列SEQIDNO：20或SEQIDNO：29至67或任何以下所示其在C端及/或N端经修饰之形式的氨基酸序列。
15.如前述实施方案中任一实施方案之前体蛋白质，其中该Aux组件彼此独立地具有任一以下含义：
SA，
SA-SU，
SU-SA，
SA-SU-SA，
SU-SA-SU，
其中此类组件SA与SU以肽键连接彼此，且此类Aux组件在末端以肽键连接于至少一个Pep组件，亦即直接或经由可裂解之肽序列连接，其中至少连接于此类Pep组件之该肽键可以化学方式或酶促方式特异性裂解。
16.一种核酸序列，其编码至少一种如前述实施方案中任一实施方案之前体蛋白质。
17.如实施方案16之核酸序列，其包含SEQIDNO：21、24、27、74及76中至少一种编码序列。
18.一种表达盒，其包含至少一种如实施方案16或17之核酸序列，该至少一种核酸序列可操作地连接于至少一种调节核酸序列。
19.一种用于使真核或原核宿主转化之重组载体，其包含如实施方案16及17中任一实施方案之核酸序列或如实施方案18之表达盒。
20.一种产生所需肽(Pep)之方法，其包含
a)产生如实施方案1至15中任一实施方案之前体蛋白质，及
b)自该前体蛋白质移除此类Pep肽，
c)该肽可任选地以酶促方式或化学方式修饰，例如可经酰胺化、酯化、氧化、烷基化或(例如经由天然化学连接反应或经由迈克尔加成反应)可连接于另一分子；其中例如该肽可借助于增强该肽之疏水性的分子来修饰，例如经含有烷基之分子修饰；其中该修饰可在该肽之任选纯化步骤之前或之后进行，如以下实施例中所说明。
适合烷基为例如C2-C16烷基，如乙基、异丙基或正丙基、正丁基、异丁基、伯丁基或叔丁基、正戊基或异戊基；此外，为正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三院基、正十四烷基、正十五烷基及正十六烷基以及其单一或多分支类似物；以及其未取代或经取代之修饰物，该修饰物含有一或多个、例如1、2或3个卤素(例如F、Cl、Br)、羟基、巯基、氨基或C1-C4-烷基氨基取代基或其可在该烷基链中被一或多个、例如1、2或3个如O或N之杂原子中断。C1-C4烷基尤其表示甲基、乙基、异丙基或正丙基、正丁基、异丁基、伯丁基或叔丁基。
21.如实施方案20之方法，其中在携带至少一个如实施方案19之载体的重组微生物中产生该前体蛋白质。
22.如实施方案21之方法，其中在重组大肠杆菌菌株中产生该前体蛋白质。
23.如实施方案20至22中任一实施方案之方法，其中任选在该表达之前体蛋白质转化为稳定缔合形式之后，将其纯化且以化学方式或酶促方式裂解以释放该所需肽(Pep)。
24.一种前体蛋白质，其包含所需肽(Pep)组件及辅助肽(Aux′)组件之可裂解序列，通式如下：
(Pep-Aux′)x或
(Aux′-Pep)x
其中x＞1，其中
此类Aux′组件为相同或不同的且包含形成两亲性α-螺旋之肽，该两亲性肽包含能够形成两亲性α螺旋之具有至少七个以肽键连接之氨基酸的序列区段，其中该螺旋之氨基酸残基在垂直投影中分为该螺旋之疏水性半部及亲水性半部，在该垂直投影中该螺旋之疏水性半部具有至少3个、例如3或4个相邻的相同或不同疏水性氨基酸残基，且在该垂直投影中该螺旋之亲水性半部具有至少3个、例如3或4个相邻的相同或不同亲水性氨基酸残基；且此类Pep组件为相同或不同的且包含相同或不同肽分子之氨基酸序列。
25.如实施方案24之前体蛋白质，其中此类Aux′组件包含至少一个如实施方案4及5中之任一者中所定义之自组装肽(SA)组件。
26.如实施方案24或25之前体蛋白质，其中该所需肽(Pep)为阳离子抗微生物肽，且该Aux′组件为形成两亲性α-螺旋之阴离子肽。
27.一种两亲性肽之用途，其作为保护性肽用于重组产生与其不同之所需抗微生物肽，其中该两亲性肽包含能够形成两亲性α螺旋之具有至少七个以肽键连接之氨基酸的序列区段，其中该螺旋之氨基酸残基在垂直投影中分为该螺旋之疏水性半部及亲水性半部，该螺旋之疏水性半部具有至少3个相邻(在该垂直投影中)的相同或不同之疏水性氨基酸残基，且该螺旋之亲水性半部具有至少3个相邻(在该垂直投影中)的相同或不同之亲水性氨基酸残基。
28.如实施方案27之用途，其中该所需肽(Pep)为阳离子抗微生物肽，且该Aux′组件为形成两亲性α-螺旋之阴离子肽。
29.如实施方案20至22中任一实施方案之方法，其中产生如实施方案12或13之前体蛋白质，诸如包含根据SEQIDNO：23或SEQIDNO：6之P18肽结构单元的前体蛋白质。
30.如实施方案29之方法，其包括以下处理步骤：
-用溶解污染蛋白质但不溶解或基本上不溶解此类前体蛋白质缔合物之溶剂，诸如0.1M至1.0MNaOH洗涤此类缔合物；
-若例如P18之该所需肽经由可以酸裂解之基团并入该前体蛋白质中，则例如用酸裂解此类前体蛋白质。
31.如实施方案30之方法，其包括至少一个以下额外处理步骤：
-在细胞破裂之后，用诸如磷酸之辅助沉淀剂处理此类前体蛋白质缔合物；
-使用层析法纯化该肽裂解反应混合物；
-用酸性溶剂或溶剂混合物洗涤该经纯化及干燥之肽。
32.如实施方案20至23及29至31中任一实施方案之方法，其用于产生SEQIDNO：23之肽，该方法包括以下处理步骤：
-在细胞破裂之后，通过添加85％浓度之磷酸直至pH＝3来处理此类前体蛋白质缔合物；
-用氢氧化钠溶液、例如0.4MNaOH洗涤此类前体蛋白质缔合物；
-以磷酸或甲酸、例如2％磷酸裂解该前体蛋白质；
-任选以己酸或99份己烷与1份乙酸之混合物洗涤该经干燥之肽。
33.如实施方案20至23及29至31中任一实施方案之方法，其用于产生SEQIDNO：6之肽，该方法包括以下处理步骤：
-例如用5％H3PO4水解或裂解沉淀物；
-离心；
-例如借助于25％NaOH将上清液之pH值调整为约4.0；
-通过阳离子交换层析纯化上清液；
-例如通过添加NaOH至洗脱物中来沉淀该所要肽；
-离心；
-使沉淀物再悬浮于水中；
-例如通过添加乙酸来溶解肽；
-冻干。
34.本发明此外涉及P18肽(SEQIDNO：23)以及SEQIDNO：6之肽及根据本发明之其产生及其在美容或制药手段中用于治疗或预防鳞屑、尤其头皮屑，或用于抑制亲脂性真菌、尤其马拉色氏霉菌属(Malasseziassp.)、尤其糠秕马拉色霉菌(Malasseziafurfur)之生长及/或活性的用途。此亦描述于例如2008年12月19日申请之先前国际申请案PCT/EP2008/010912中，本文中明确地引用该案之揭示内容。
本发明之个别方面之详细描述
1.肽
本发明之肽(Pep)亦可称为“所需肽”或“目标肽”，其为2至100个、例如5至70个且尤其7至50个、例如10至40个、12至35个或15至25个氨基酸经由肽键连接之氨基酸链。肽可包含任何α-氨基酸，尤其为蛋白质型氨基酸。
此类肽可具有特定所需生物或化学性质以及尤其药理学上可用之性质。此类性质之实例为：抗微生物活性、特异性结合至某些表面、结晶过程及粒子形成中之成核性质、控制晶体结构、金属或金属离子之结合、表面活性剂性质、乳化性质、稳定泡沫之性质、影响细胞吸附。
此类肽可具有一或多个此等性质。
在一个实施方案中，本发明涉及一种产生抗微生物肽之方法。此类“抗微生物肽”特点为，在浓度≤100μM之抗微生物肽存在下，至少一种类型之革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌及/或至少一种类型之酵母及/或至少一种类型之丝状真菌及/或至少一种类型之藻类的生长及/或增殖受到抑制及/或各个生物之细胞遭到破坏。
在一实施方案中，本发明涉及提供阳离子抗微生物肽。阳离子抗微生物肽特点为，具有如上所定义之抗微生物作用及在pH7下大于0之净电荷。
此类阳离子肽包含例如以下序列：
X1X2KX3X4X5KIPX10KFX6X7X8AX9KF(SEQIDNO：7)
其中
X10为肽键或任一或两个碱性或疏水性氨基酸残基或一或两个脯氨酸残基，且
X1至X9为除脯氨酸以外之任何碱性或疏水性氨基酸残基；及/或其突变体或衍生物；
其中存在于前体蛋白质中之重复序列基序可为相同或不同的。
在另一特定实施方案中，本发明涉及产生包含以下序列之肽：
X1X2KX3X4X5KIPX11X12KFX6X7X8AX9KF(SEQIDNO：8)
其中
X1为赖氨酸、精氨酸或苯丙氨酸，
X2为赖氨酸或色氨酸，
X3为亮氨酸或赖氨酸，
X4为苯丙氨酸或亮氨酸，
X5为亮氨酸或赖氨酸，
X6为亮氨酸或赖氨酸，
X7为组氨酸或赖氨酸，
X8为丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或丝氨酸，
X9为亮氨酸或赖氨酸，
X11为脯氨酸或化学键，且
X12为脯氨酸或化学键，
及/或其突变体及衍生物；
其中存在于前体蛋白质中之重复序列基序为相同或不同的。
上述序列或重复序列基序之非限制性实例为SEQIDNO：6、SEQIDNO：9-SEQIDNO：15、SEQIDNO：23、SEQIDNO：69、SEQIDNO：71及/或其突变体或衍生物。
其它适合肽亦描述于例如2008年12月19日申请之本发明人之国际申请案PCT/EP2008/010912中，本文中明确地引用该案之揭示内容。
2.重复前体蛋白质
本发明之重复前体蛋白质特点为，在各情况下以总序列长度计，至少60％，尤其至少80％，例如60-99％、70-95％、75-85％其氨基酸序列由肽重复单元(如下文中所定义)组成。剩余部分可包含例如非重复肽，诸如信号肽、标签等等。
3.重复单元
肽重复单元包含至少一种根据本发明有利地产生之肽且原则上如下构建：
(Pep-Aux)x或
(Aux-Pep)x
其中x＞1，且Pep为上文所示之肽且Aux如本文中所定义。
本发明之重复单元(Pep-Aux或Aux-Pep)为10-200个、例如20-130个及/或30-80个氨基酸长之氨基酸序列，其以相同序列形式或具有至少70％、例如至少80％且尤其至少约90％同一性(例如91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性)之特定序列之变异形式多次出现于前体蛋白质中。本发明之重复前体蛋白质因此可包含例如单一氨基酸序列或多个不同氨基酸序列(例如Pep及/或Aux结构单元)之相同拷贝或变异形式。
此外，任何数目之上述重复单元(例如1-100个、1-50个或2-32个且尤其4-16个)可在重复性前体蛋白质中结合在一起。
本发明肽在重复单元中之比例以摩尔质量计为20％-80％，例如30％-70％。重复单元之剩余部分由Aux序列、尤其上文所定义之SA及SU序列、及任选存在之用于选择性移除Pep结构单元之特异性裂解序列构成。
4.辅助序列
最广泛意义上之辅助序列为本发明前体蛋白质中影响该前体蛋白质之性质以便改良该前体蛋白质之表达、稳定性及/或处理的氨基酸序列。重复前体蛋白质中之辅助序列可为重复单元(上文所示之Aux结构单元)之一部分，或可附接至前体蛋白质之氨基端或羧基端，诸如6xHis标签(HHHHHH)、T7标签(MASMTGGQQMG)、S标签(KETAAAKFERQHMDS)、c-Myc标签(EQKLISEEDL)、Strep标签(WSHPQFEK)或HA标签(YPYDVPDYA)、谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、纤维素结合蛋白。此等及其它辅助序列描述于Terpe；ApplMicrobiolBiotechnol；60(5)：523-33(2003)中。此外，辅助序列CanA(Mai，，InVitroUntersuchungenzumNetzwerkvonPyrodictiumabyssiTAG11“[InVitroStudiesoftheExtracellularNetworkofPyrodictiumabyssiTAG11]，PhDTheses，RegensburgUniversity(1998))及yaaD(WohllebenEurBiophysJ，(2009)在线公开)适用于附接至前体蛋白质之氨基端或羧基端。
在一实施方案中，前体蛋白质包含影响该前体蛋白质之溶解度的辅助序列。
在一优选实施方案中，辅助序列赋予前体蛋白质”自组装”性质。前体蛋白质之该自组装性质特点为，该前体蛋白质已在表达期间“自发”(亦即自行)形成稳定缔合物，无需其它手段，或可能以“诱导性”方式，亦即通过触发物，开始可溶性前体蛋白质之此类稳定缔合物之形成。具有自组装性质之前体蛋白质优于其它前体蛋白质，因为其可以简单且有效之方式纯化。此类缔合物通常仅仅或基本上包含诸如氢键、离子及/或疏水相互作用之非共价键之形成。
自组装序列长度可为例如至少8个邻接氨基酸。适合序列可位于例如先前已检测到组装成更高分子量之缔合物的本身已知之蛋白质中。此类缔合物之实例为类淀粉原纤维、肌动蛋白或肌球蛋白丝、蛋白纤维(诸如弹性蛋白纤维)、胶原纤维、胎贝足丝线(musselbyssusthread)、角蛋白纤维或丝线。包含自组装序列之此等及其它蛋白质描述于Scheibel，CurrentOpinioninBiotechnology16；1-7(2005)中，本文中明确地引用该文献。
促稳性盐溶液可用作“触发物”。可于本文中举例提及之促稳性盐为彼等根据”霍夫迈斯特系列(Hofmeisterseries)”，包含至少一种促稳性高于钠离子或氯离子之离子。此类盐之实例为磷酸钾及硫酸铵。此类盐溶液之实例为0.5M磷酸钾及0.8M硫酸铵。
前体蛋白质之本发明稳定缔合物特点为，能在采用通常能够溶解多种聚集蛋白质之溶液处理期间维持其缔合形式一段时期，且由此能与蛋白质污染物分离。此类溶液之实例为碱、酸、尿素、盐及去污剂之溶液。更具体地，本发明之稳定缔合物在碱金属氢氧化物、尿素、胍盐或带电去污剂(诸如烷基三甲基铵盐或烷基硫酸盐)之溶液中保持一段时期内不溶解。
更具体地，稳定缔合物在以下溶液中保持一段时期内不溶：≥0.2M氢氧化钠、≥2M尿素、≥1M盐酸胍、≥1M硫氰酸胍、或≥0.1％十二烷基硫酸钠、或≥0.1％溴化十六烷基三甲基铵。更具体地，前体蛋白质之稳定缔合物在上述溶液中稳定持续≥10分钟，例如≥30分钟且尤其≥60分钟。
特定言之，若在室温(亦即约20℃)下，
a)无法由0.2MNaOH在1小时内溶解，及/或
b)无法由2M尿素及/或
c)无法由1M盐酸胍
在10分钟内溶解，则存在稳定缔合物。
在另一特定实施方案中，前体蛋白质包含辅助序列(SU)，其保护宿主细胞免受重复前体蛋白质之破坏影响。
在一特定实施方案中，前体蛋白质包含辅助序列SU，其保护宿主细胞兔受存在于重复前体蛋白质中之阳离子抗微生物肽序列之破坏影响。更具体地，此等保护性序列包含带负电荷之氨基酸(Asp、Glu)。更具体地，辅助序列包含许多带负电荷之谷氨酸及/或天冬氨酸氨基酸，导致在pH＝7下重复前体蛋白质内之总净电荷大于-10且小于+10，尤其大于-5且小于+5，例如大于-2且小于+2。
在另一特定实施方案中，带负电荷之保护性序列形成两亲性螺旋。若一级结构中7个连续氨基酸序列(A1-A7)按顺序A1-A5-A2-A6-A3-A7-A4(图1)之环形排列(亦即，在轴向(沿螺旋轴线)投影或俯视图中)中，该环上有至少3个相邻氨基酸为疏水性氨基酸(Ala、Met、Cys、Phe、Leu、Val、Ile)或甘氨酸，且该环上有3个相邻氨基酸为亲水性氨基酸(Thr、Ser、Trp、Tyr、Pro、His、Glu、Gln、Asp、Asn、Lys、Arg)或甘氨酸，则形成本发明之两亲性螺旋。此环形排列亦称为“螺旋轮投影”。
在一优选实施方案中，带负电荷之保护性序列对应于序列SEQIDNO：16-SEQIDNO：19之任一者。
5.裂解序列
裂解序列为排列于本发明所需肽序列(Pep)之上游及下游的氨基酸序列。此等序列能够使Pep结构单元通过“特异性”裂解自重复前体蛋白质中移除。在本文中，“特异性”意谓该裂解发生在前体蛋白质中基本上、尤其仅仅在一或多个确定位置处，藉此移除所需肽或其前体。
“前体”例如可由在一端或两端上包含不为天然原始肽序列之一部分但不干扰进一步使用及功能性，或必要时籍由使用习知化学或生物化学方法裂解可移除之氨基酸残基的肽链组成。
裂解序列可借助于蛋白水解活性酶之特异性识别序列发挥作用，此类活性酶结合至该序列且使两个特定氨基酸之间的肽键裂解。实例为以下识别序列：Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、胱天蛋白酶(caspase)、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、肠激酶、因子Xa、谷氨酰基内肽酶、粒酶B、LysC赖氨酰基内肽酶(无色杆菌属(Achromobacter)蛋白酶1)、LysN肽基-Lys金属内肽酶、胃蛋白酶、脯氨酸内肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶。相应识别序列描述于文献中，例如描述于Keil，“Specificityofproteolysis”第335页，Springer-Verlag(1992)中。
或者，特定氨基股序列能够使多肽主链通过如以下之特定化学物质选择性裂解：BNPS粪臭素(2-(2′-硝基苯基亚磺酰)-3-甲基-3-溴假吲哚)、溴化氰(bromcyane)、酸、羟胺、氧碘基苯甲酸、NTCB(2-硝基-5-硫氰基苯甲酸)。
更具体地，所用裂解序列能够使重复前体蛋白质通过化学物质裂解。尤其适合之裂解序列包含允许以羟胺裂解之序列基序Asn-Gly，或允许以酸裂解之Asp-Pro或AspXxx，其中Xxx可为任何蛋白质型氨基酸。
6.本发明序列之其它发展
6.1氨基酸序列
除了本文中特别揭示之肽(Pep)序列、及辅助序列(Aux、SA、SU)、重复顺序、裂解序列及重复前体蛋白质之序列以外，本发明亦涉及该序列之功能等同物、功能衍生物及盐。
根据本发明，“功能等同物”亦尤其意谓在上述氨基酸序列之至少一个序列位置中，具有与特别提及之氨基酸不同之氨基酸，但性质仍与最初未经修饰之肽相同的突变体。“功能等同物”因此包含通过一或多个氨基酸添加、取代、缺失及/或倒位可获得之突变体，此类修饰可能发生在任何序列位置处，只要其产生具有根据本发明之性质概况之突变体即可。更具体地，即使突变体与未经修饰之多肽之间的反应模式在性质上相对应，仍存在功能等同物。
在上述意义上之“功能等同物”亦为所述多肽之“前体”以及此类多肽之“功能衍生物”及“盐”。
本文中之“前体”为具有或不具有所需生物活性的此类多肽之天然或合成前体。
适合氨基酸取代之实例可见于下表中：
表述“盐”意谓本发明肽分子的羧基之盐及氨基之酸加成盐。羧基之盐可以本身已知之方式制备且包含诸如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐及锌盐之无机盐，以及与如下有机碱形成之盐：例如胺(诸如三乙醇胺)、精氨酸、赖氨酸、哌啶及其类似物。本发明同样涉及酸加成盐，诸如与诸如盐酸或硫酸之无机酸形成之盐，及与诸如乙酸及草酸之有机酸形成之盐。
本发明多肽之“功能衍生物”(或“衍生物”)可同样借助于已知技术在功能性氨基酸侧基上或在其N端或C端产生。此类衍生物之实例包含羧酸基围之脂族酯；羧酸基团之酰胺，通过与伯胺或仲胺反应可获得；游离氨基之N酰基衍生物，通过与酰基反应来制备；或游离羟基之O-酰基衍生物，通过与酰基反应来制备。此外，1至5个、例如2、3或4个随机D-或L-氨基酸残基可另外共价(以肽键)结合至N端及/或C端。
6.2核酸、表达构建、载体及包含其之微生物
核酸：
本发明此外包含编码本发明所用之肽及蛋白质序列的核酸分子。
本文中所提及之所有核酸序列(单链及双链DNA及RNA序列，例如cDNA及mRNA)可以本身已知之方式，通过自核苷酸结构单元化学合成，例如通过对双螺旋之个别重迭互补核酸结构单元进行片段融合而制备。举例而言，寡核苷酸可以已知方式，通过亚磷酰胺方法化学合成(Voet，Voet，第2版，WileyPressNewYork，第896-897页)。借助于DNA聚合酶之克列诺片段(Klenowfragment)及连接反应，组装合成寡核苦酸及填补缺口，以及一般克隆方法描述于Sambrook等人(1989)，MolecularCloning：Alaboratorymanual，ColdSpringHarborLaboratoryPress中。
本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物活性区段之分离之核酸分子，与可例如用作供鉴别或扩增本发明之编码核酸之杂交探针或引物的核酸片段。此外，本发明之核酸分子可包含来自编码基因区域之3′端及/或5′端之未翻译序列。
“分离之”核酸分子自存在于该核酸之天然来源中之其它核酸分子中移除，且另外当通过重组技术制备时，其可基本上无其它细胞物质或培养基，或当以化学方式合成时可无化学前体或其它化学物质。
本发明之核酸分子可借助于标准分子生物学技术及本发明所提供之序列信息分离。举例而言，可通过使用任何特别揭示之具体序列或其任何区段作为杂交探针及标准杂交技术自适合cDNA文库中分离出cDNA(例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.及Maniatis，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual.第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989中所述)。此外，可使用包含任何揭示之序列或其区段的核酸分子，其可通过聚合酶链反应，使用基于此序列产生之寡核苷酸引物来分离。以此方式扩增之核酸可克隆至适合载体中且可通过DNA序列分析来表征。本发明之寡核苷酸亦可通过标准合成方法，例如使用DNA合成仪来制备。
此外，本发明包含与特别描述之核苷酸序列或其区段互补之核酸分子。
本发明之核苷酸序列能够产生可用于鉴别及/或克隆其他细胞类型及生物中之同源序列的探针及引物。通常此类探针及引物之核苷酸序列区域在严格条件下与本发明核酸序列之有义链或相应反义链之至少约12个，优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸杂交。
本发明亦包含彼等包含“沉默突变”或已根据特定原始或宿主生物之密码子选择，与特别提及之序列相比经修饰之核酸序列，以及其天然存在之变体，诸如剪接变体或等位基因变体。本发明亦涉及可通过保守核苷酸取代(亦即，相关氨基酸经相同电荷、尺寸、极性及/或溶解度之氨基酸置换)获得之序列。
本发明亦涉及因序列多态性而衍生自特别揭示之核酸的分子。由于天然变异，故此等遗传多态性可存在于单一群体内之个体中。此等天然变异通常导致基因之核苷酸序列中1至5％之变异。
此外，本发明亦包含与上述编码序列杂交或与其互补之核酸序列。可通过筛选基因组或cDNA文库，找到此等多核苷酸，且任选借助于PCR，使用适合引物，由此扩增，且随后例如使用适合探针来分离。另一可能性为以本发明之多核苷酸或载体转化适合微生物，增殖此类微生物及因此增殖此类多核苷酸，且随后分离其。另外，亦可以化学方式合成本发明之多核苷酸。
能够与多核苷酸”杂交”之性质意谓多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下结合至基本上互补序列的能力，同时在此等条件下非互补配偶体之间未发生非特异性结合反应。为达成此目的，序列应为70-100％、优选90-100％互补。举例而言，在Northern或Southern印迹技术中或在PCR或RT-PCR中引物结合下，使用互补序列能特异性彼此结合之性质。通常，出于此目的，采用至少30个碱基对长度之寡核苷酸。例如在Northern印迹技术中，严格条件意谓使用50-70℃，优选60-65℃洗涤溶液，例如今有0.1％SDS之0.1xSSC缓冲液(20xSSC：3MNaCl、0.3M柠檬酸钠，pH7.0)，以洗脱非特异性杂交之cDNA探针或寡核苷酸。如上所述，在此情况下仅高度互补之核酸保持彼此附接。严格条件之调节为技术人员所知且描述于例如Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。
两个核酸之间的“同一性”意谓在各情况下核酸总长度上核苷酸之同一性，尤其为借助于来自Informax(USA)之VectorNTISuite7.1软件且应用Clustal方法(HigginsDG，SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.1989年4月；5(2)：151-1)且设定下列参数进行比较所计算之同一性：
多个比对参数：
成对比对参数：
表达构建体及载体：
本发明另外涉及包含在由调节核酸序列之遗传控制下编码本发明肽或前体蛋白质之核酸序列的表达构建体，及包含至少一个此类表达构建体之载体。本发明之此类构建体优选包含特定编码序列之5′-上游的启动子及3’下游之终止子序列，以及任选还用之在各情况下可操作地连接于编码序列的其它常见调节元件。“可操作地连接”意谓启动子、编码序列、终止子及任选其它调节元件以某一方式按序排列，使得此类调节元件之每一者可在编码序列表达期间实现其预定功能。可操作地连接序列之实例为靶向序列以及增强子、多腺苷酸化信号等等。其它调节元件包含选择标记、扩增信号、复制起点等等。适合调节序列描述于例如Goeddel，GeneExpressionTechnology：MethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)中。
除人工调节序列之外，天然调节序列仍可存在于实际结构基因之上游。此天然调节可任选通过遗传修饰来关闭，藉此增加或减少基因之表达。然而，基因构建体亦可具有更简单之结构，亦即无额外调节信号插入结构基因之上游，且不移除具有调节作用之天然启动子。反之，天然调节序列以一方式发生突变，使得不再进行调节且增加或减少基因表达。基因构建体可包含核酸序列之一或多个拷贝。
可用启动子之实例为：cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子，其宜用于革兰氏阴性细菌中；以及革兰氏阳性启动子amy及SPO2、酵母启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH或植物启动子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLSl、B33、not或泛素启动子或菜豆球蛋白启动子。尤其优选使用诱导性启动子，诸如光诱导性及尤其温度诱导性启动子，诸如PrPl启动子。原则上，可使用具有调节序列之任何天然启动子。另外，亦宜使用合成启动子。
此类调节序列意欲能够使核酸序列及蛋白质以特定方式表达。视宿主生物而定，例如此可意谓基因仅在诱导之后表达或过表达，或基因即刻表达及/或过表达。
此处优选为能积极地影响表达且藉此增加或减少表达之调节序列或因子。因此，有可能通过使用强转录信号(诸如启动子及/或“增强子”)有利地在转录水平上强化调节元件。然而，此外，亦可能例如通过提高mRNA之稳定性来增加翻译。
通过将适合启动子融合至适合编码核苷酸序列且融合至终止或多腺苷酸化信号来制备表达盒。出于此目的，使用熟悉之重组及克隆技术如例如以下文献中所描述：T.Maniatis，E.F.Fritsch及1.Sambrook，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY(1989)；及T.J.Silhavy，M.L.Berman及L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY(1984)；及Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)。
为在适合宿主生物中表达重组核酸构建体或基因构建体，宜将其插入宿主特异性载体中，该载体能够使基因在宿主中最佳表达。载体为技术人员所熟知且可见于例如“CloningVectors”(PouwelsP.H.etal.，eds.，Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985)中。应了解除质体之外，载体亦包括技术人员已知之任何其它载体，诸如噬菌体、病毒(诸如SV40、CMV、杆状病毒及腺病毒)、转座子、IS元件、质体、黏粒及线性或环状DNA。此类载体可在宿主生物中自主复制或随染色体复制。
可提及之适合表达载体之实例为：
常见融合表达载体，诸如pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith，D.B.及Johnson，K.S.(1988)Gene67：31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)及pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白及蛋白质A分别融合至重组靶蛋白质。
非融合蛋白表达载体，如pTrc(Amann等人，(1988)Gene69：301-315)及pET11d(Studieretal.GeneExpressionTechnology：MethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)60-89)。
用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达之酵母表达载体，诸如pYepSec1(Baldarietal.，(1987)EmboJ.6：229-234)，pMFa(KurjanandHerskowitz(1982)Cell30：933-943)，pJRY88(Schultzetal.，(1987)Gene54：113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，SanDiego，CA)。适用于诸如丝状真菌之其它真菌之载体及载体构建方法包含彼等详细描述于以下文献中者：vandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)“Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi”，in：AppliedMolecularGeneticsofFungi，J.F.Peberdyetal.，eds.，pp.1-28，CambridgeUniversityPress：Cambridge。
可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质之杆状病毒载体包含pAc系列(Smith等人，(1983)Mol.CellBioI.3：2156-2165)及pVL系列(Lucklow及Summers，(1989)Virology170：31-39)。
植物表达载体，诸如彼等详细描述于以下文献中者Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder”，PlantMol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)“BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation”，Nucl.AcidsRes.12：8711-8721。
哺乳动物表达载体，诸如pCDM8(Seed，B.(1987)Nature329：840)及pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBO1.6：187-195)。
用于原核及真核细胞之其它适合表达系统描述于以下文献之第16章及第17章中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.及Maniatis，T.，Molecularcloning：ALaboratoryManu训，第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989。
重组微生物：
可借助于本发明载体，产生已例如经至少一种本发明载体转化且可用于产生本发明多肽之重组微生物。宜将上述本发明之重组构建体引入适合宿主系统中且表达。此处优选使用技术人员所熟悉之克隆及转染方法，诸如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等等，例如以便实现此类核酸在各个表达系统中之表达。适合的系统描述于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，F.Ausubeletal.，Hrsg.，WileyInterscience，NewYork1997，或Sambrooketal.，MolecularCloning：ALaboratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989中。
根据本发明，亦可产生同源重组之微生物。出于此目的，制备包含本发明基因或编码序列之至少一个区段的载体，任选向载体中引入至少一个氨基酸缺失、添加或取代以修饰，例如在功能上破坏(“敲除”载体)本发明序列。所引入序列亦可为例如来自相关微生物或衍生自哺乳动物、酵母或昆虫来源之同源物。或者，用于同源重组之载体可以一方式设计，使得在同源重组之后，内源性基因以另一方式突变或修饰，但仍编码功能性蛋白质(举例而言，上游调节区域可以改变内源性蛋白质表达之方式经修饰)。本发明基因之经修饰区段存在于同源重组载体中。用于同源重组之合适载体之构建描述于例如Thomas，K.R.及Capecchi，M.R.(1987)Cell51：503中。
适合的宿主生物原则上为能够表达本发明核酸、其等位基因变体、其功能等同物或衍生物之任何生物。宿主生物意谓例如细菌、真菌、酵母、植物或动物细胞。
原核表达生物之非限制性实例为大肠杆菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)及其它。真核表达生物之非限制性实例为酵母，诸如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及其它酵母；丝状真菌，诸如黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、里氏木霉(Trichodermareesei)、产黄支顶孢(Acremoniumchrysogenum)及其它丝状真菌；哺乳动物细胞，如Hela细胞、COS细胞、CHO细胞及其它哺乳动物细胞；昆虫细胞，诸如Sf9细胞、MEL细胞及其它昆虫细胞；植物或植物细胞，诸如马铃薯(Solanumtuberosum)、烟草(Nicotiana)及其它植物或植物细胞。
可借助于同样存在于载体或表达盒中之标记基因选择经成功转化之生物。此类标记基因之实例为负责抗生素抗性之基因，及负责催化着色反应而使转化细胞染色之酶的基因。随后可借助于自动细胞分选来选出此类转化细胞。载有合适抗生素抗性基因(例如G418或潮霉素)之经载体成功转化之微生物可借助于包含相应抗生素之液体或固体培养基来加以选择。在细胞表面上呈递之标记蛋白质可用于借助于亲和层析之选择。
7.重组产生前体蛋白质及肽
本发明所用肽及前体蛋白质原则上可以本身已知之方式重组产生，该方式包含培养产生肽/前体蛋白质之微生物，任选诱导此类多肽表达，且自培养物中分离出此类多肽。必要时亦可以此方式以工业规模产生肽及前体蛋白质。
可根据已知方法培养及发酵重组微生物。举例而言，可在TB或LB培养基中及在20℃至40℃及pH6至9下使细菌增殖。适合的培养条件详细地描述于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch及J.Sambrook，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY(1989)中。
除非肽或前体蛋白质分泌至培养基中，否则使细胞破裂且通过已知的蛋白质分离法自裂解物中回收产物。任选可通过高频超音波，通过高压(例如在弗氏细胞压碎器(Frenchpressurecell)中)，通过渗透，通过去污剂、裂解酶或有机溶剂作用，通过匀浆器，或通过组合多种所列方法，使细胞破裂。
可使用已知之层析法，诸如分子筛层析(凝胶过滤)，诸如Q-Sepharose层析、离子交换层析及疏水性层析，及通过其它常见方法，诸如超滤、结晶、盐析、透析及非变性凝胶电泳，来纯化肽或前体蛋白质。适合方法描述于例如Cooper，F.G.，BiochemischeArbeitsmethoden[原始标题：TheToolsofBiochemistry]，VerlagWalterdeGruyter，Berlin，NewYorkorinScopes，R.，ProteinPurification，SpringerVerlag，NewYork，Heidelberg，Berlin中。
此外，可通过使用载体系统或寡核苷酸分离重组肽或前体蛋白质，此类载体系统或寡核苷酸使cDNA延长特定核苷酸序列且因此编码用于例如更简单纯化之经修饰之多肽或融合蛋白质。此类适合修饰之实例为充当锚定物之“标签”，例如称为六组氨酸锚定物之修饰，或可由抗体识别为抗原之表位(描述于例如Harlow，E.及Lane，D.，1988，Antibodies：ALaboratoryManual.ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中)。此等锚定物可用于将蛋白质固定至固相支持体(例如聚合物基质)上，该固相支持体可引入例如层析柱中或可用于微量滴定板或另一支持体上。
同时，此等锚定物亦可用于识别蛋白质。此外，可单独使用或与此类锚定物组合使用诸如以下之常见标记物来识别此类蛋白质以衍生蛋白质：荧光染料、在与底物反应后形成可检测反应产物之酶标记物、或放射性标记物。
更具体地，通过表达编码本发明重复前体蛋白质之经合成制备之基因序列来产生重复前体蛋白质。合成基因序列之一可能制备方法描述于Hummerich等人，Biochemistry43；13604-13612(2004)中。
重复前体蛋白质可以可溶或不溶形式存在于宿主细胞中。在两种情况下，细胞均破裂。更具体地，借助于高压匀浆机，在1000-1500巴下进行破裂。在可溶性重复前体蛋白质之情况下，通过将裂解物加热至60-100℃，诸如70-90℃或75-85℃，使大部分细胞蛋白质沉淀，且通过适合分离方法(例如沉降或过滤)，自可溶性重复前体蛋白质中移除。随后通过添加促稳性盐(如上所述)使重复前体蛋白质沉淀。重复前体蛋白质在该过程中形成稳定缔合物。视缔合物而定，所添加之促稳性盐之最终浓度可变化且约在约0.2-3M或例如0.8-2M之范围内。可以蛋白质化学家所熟悉之简单方式确定最佳浓度。
亦可在无外部触发物之情况下组装重复前体蛋白质。在此情况下，重复前体蛋白质在宿主细胞中组装，得到相应稳定缔合物。在细胞破裂之后，籍由适合分离方法(例如沉降或过滤)，将此类缔合物与可溶性组分分离。
可在细胞破裂之后，通过添加辅助沉淀剂，来改良缔合物之移除。此类辅助沉淀剂会引起缔合物进一步凝结，因此，沉降需要较低加速度，例如以便将缔合物与水性培养基分离。可使用之辅助沉淀剂为酸、碱液、聚合物溶液，尤其为带电聚合物之水溶液。辅助沉淀剂之实例为磷酸或聚乙烯亚胺溶液。
可进一步纯化重复前体蛋白质之稳定缔合物。出于此目的，稳定缔合物不溶但其它污染物可溶之溶液可用于此纯化。更具体地，使用碱、酸、尿素、盐及去污剂之水溶液。尤其适合使用碱金属羟化物、尿素、胍盐或带电去污剂(诸如烷基三甲基铵盐或；烷基硫酸盐)之溶液。更具体地，使用≥0.2M氮氧化钠、≥2M尿素、≥1M盐酸胍、≥1M硫氰酸胍、或≥0.1％十二烷基硫酸钠、或≥0.1％溴化十六烷基三甲铵之溶液。为进行纯化，将稳定缔合物再悬浮于相应溶液中，且随后通过简单分离方法(例如沉降或过滤)与溶液分离。随后将重复前体蛋白质以水洗涤且使用技术人员所熟悉之方法进行干燥。
为了自重复前体蛋白质中回收肽，必须将此等序列自此类前体蛋白质中裂解且与辅助序列分离。在存在于重复前体蛋白质中之裂解序列处进行裂解。用于特异性裂解氨基酸链之方法描述于文献中。可依酶促方式或化学方式裂解重复前体蛋白质。可用于特异性裂解氨基酸链之酶之实例为Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、胱天蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、肠激酶、因子Xa、谷氨酰基内肽酶、粒酶B、LysC赖氨酰基内肽酶(无色杆菌属蛋白酶I)LysN肽基-Lys金属内肽酶、胃蛋白酶、脯氨酸内肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶。可用于特异性裂解氨基酸链之化学物质之实例为BNPS粪臭素(2-(2′-硝基苯基亚磺酰)3-甲基-3-溴假吲哚)、溴化氰、酸、羟胺、氧碘代苯甲酸、NTCB(2-硝基-5-硫氰基苯甲酸)。
更具体地，依化学方式，例如通过羟胺或酸裂解，使重复前体蛋白质裂解。pKs小于5且大于0，优选小于4且大于1之任何无机酸或有机酸均适用于酸裂解。更具体地，使用1-5％磷酸或1-5％甲酸进行该裂解。视酸裂解之条件而定，在氨基酸Asp与Pro之间或Asp与Xxx之间发生简单裂解，其中Xxx为任何蛋白质型氨基酸，或首先在氨基酸Asp与Pro之间或Asp与Xxx之间发生裂解，且随后自肽氨基酸序列中之该天冬氨酸之N端上游的氨基酸完全裂解天冬氨酸。
可使用经纯化之重复前体蛋白质，或使用包含重复前体蛋白质之细胞级分(例如宿主细胞之可溶性组分或宿主细胞之不溶性组分)，或使用包含重复前体蛋白质之完整宿主细胞进行裂解。在裂解之后必须使裂解剂失活。用于实现此目的之方法为技术人员所知。
失活后，裂解反应混合物尤其包含所需肽、裂解出来之辅助序列及失活裂解剂。在该溶液中，肽可能已具有其所需活性。若需要更大纯度，则自重复前体蛋白质中释放之肽可在裂解之后自辅助序列移除。自组装辅助序列之优势在于此类辅助序列在裂解期间或之后组装。其可在裂解期间在所选裂解条件下自发组装，或因添加支持此类辅助序列组装之物质而组装。此类组装促进物质为例如促稳性盐，其包含至少一种类型之根据霍夫迈斯特系列，促稳性比钠离子或氯离子高之离子。其它组装促进物质为例如酸，或碱液，或可与水混溶之有机溶剂，诸如醇类。经组装之辅助序列可通过沉降或过滤自释放之可溶性肽移除。可能需要其它纯化步骤，以自所需肽移除剩余蛋白质或肽污染物或在裂解期间或之后添加之盐或其它物质。出于此目的，可才采用例如层析法、沉淀、透析、两相萃取及技术人员所熟悉之其它方法。
含有肽之溶液随后可直接用于所需应用，或可使用技术人员所熟悉之方法(例如喷雾干燥或冷冻干燥)来干燥溶液，且使用相应干燥产物。
干燥后，只要将肽溶解于水中，通过以该肽不可溶之溶剂来洗涤，可移除不能自肽移除之污染物。适用溶剂为有机溶剂，诸如正己烷、N-甲基吡咯烷酮；或溶剂与酸之混合物，例如正己烷与乙酸之混合物；或有机酸，诸如乙酸或己酸。对于此纯化步骤，将干燥肽再悬浮于适当溶剂/溶剂混合物中，且随后通过沉降或过滤、再次移除。可通过干燥来移除剩余溶剂/溶剂混合物。
通过裂解获得之形式的所需肽可具有所需活性。然而，在裂解之后亦可能需要进一步修饰肽。举例而言，肽可经酰胺化、酯化、氧化、烷基化或以化学方式连接于任何分子。可应用于此类修饰中之分子之实例为醇类，醇半胱氨酸酯、羧酸、硫酯或及马来酰亚胺。更具体地，用于此类修饰的分子是增加肽的疏水性的分子。此类分子可含有经修饰或未经修饰之如上所定义之烷基。此类分子优选含有C2-C16-烷基，尤其为C6-C14-烷基。相应方法为技术人员所知。可在以下任何时候进行修饰：例如直接在细胞破裂之后，在前体蛋白质纯化之后，在前体蛋白质裂解之后，或在肽纯化之后。
可直接使用具有所需纯度之肽溶液。或者，可应用不同保存方法来长期储存。保存方法之实例为冷却、冷冻、添加防腐剂。或者，可干燥肽。干燥方法之实例为冻干或喷雾干燥。可随后储存干燥之肽。为使用肽，将干燥之物质溶解于适合溶剂、优选水溶液中。该水溶液可包含盐或缓冲物质或无其它添加物。
8.各种其它一般术语之定义
除非另有说明，否则”衍生”自特别揭示之序列或与其”同源”之序列(例如衍生之氨基酸或核酸序列)意谓根据本发明，与起始序列有至少80％或至少90％，尤其91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％及99％同一性之序列。
实验部分
基于产生三种具有不同序列及氨基酸组成之肽(ZnO、P18、Min)来证明本发明中所述之产生任何肽序列(Pep)之方法的普遍适用性。
除非另有说明，否则使用有机与生化分析及蛋白质之重组产生及微生物培养之标准方法。
实施例1：产生肽ZnO(SEQIDNO：20)
肽ZnO为衍生自公开序列之肽，其影响氧化锌粒子之形成(Umetsuetal.Adv.Mat.17：2571-75(2005))。使用限制性核酸内切酶BamHI及HindIII，将合成基因ZnO4(SEQIDNO：21)克隆至Hummerich等人，Biochemistry43；13604-13612(2004)中所述的载体pAZL中，且根据其中所述之方案进行二聚化，且克隆至载体pET21(Novagen)中。随后存在于该载体中之序列编码重复前体蛋白质ZnO8(SEQIDNO：22)。该重复前体蛋白质包含8个重复单元，每一者均包含ZnO肽拷贝及一辅助序列。该辅助序列包含聚丙氨酸序列且赋予重复前体蛋白质自组装性质。意欲使用的使ZnO肽能够自前体蛋白质中选择性裂解出来之氨基酸Asp-Pro位于辅助序列与肽序列之间。在菌株大肠杆菌BL21[DE3](Novagen)中进行表达。
在pO2＞20％及pH＝6.8下，以补料分批方法进行培养及蛋白质合成。
培养基：
痕量盐溶液：
补料溶液：
在存在于基础培养基中之甘油耗尽之后，开始以100ml/h之速率恒定地补料。
在细菌培养物达到OD600＝60之光密度之后，通过添加1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白质合成。此时，培养物之温度自37℃降至30℃。在诱导之后5小时，收获细胞。
根据以下方案纯化ZnO8：
-每克湿质量细胞沉淀物重悬浮于5ml20mMMOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)(pH7.0)
-在高压匀浆机中在1400巴下使细胞破裂
-在5000×g下离心30分钟
-在80℃下培育上清液30分钟
-在5000×g下离心30分钟
-通过在4℃下添加1.8M硫酸铵(最终浓度)隔夜，使ZnO8自上清液中沉淀出
-以8M尿素洗涤沉淀物
-以水洗涤沉淀物2次
-冻干
-使经冻干之ZnO8达至-20℃。
自每一升培养基回收2.2g纯ZnO8。
为进行裂解，将250mg经冻干之ZnO8前体蛋白质重悬浮于5ml1％甲酸中且在90℃下温育6小时。在此温育期间，冻干产物发生溶解，得到凝胶状物质。冷却至室温之后，通过在18000xg下沉降，自可溶性组分中移除凝胶状物质。以2MNaOH中和剩余溶液。随后冻干溶液。冻干产物包含所需裂解产物及由甲酸中和得到之甲酸钠。
借助于HPLC分析经冻干之产物：为此，将产物以1mg/ml之浓度溶解于水中且使用反相层析柱(JupiterProteo4.6x250mm；Phenomenex)分析。所用洗脱剂为0.1％三氟乙酸水溶液，使用线性梯度，以0.1％三氟乙酸之乙腈溶液替换。在206nm下进行检测(图2)。为进一步分析，收集主峰之级分且进一步研究其中存在之物质。N端测序证实此组分为ZnO肽。借助于质谱分析(MALDI-TOF)之研究确立2002之质量，其与ZnO肽之理论质量一致(图3)。HPLC分析揭示基于UV活性组分，纯度为62％。
实施例2：产生肽P18(SEQIDNO：23)
肽P18为衍生自Shin等人，J.PeptideRes.58：504-14(2001)所述之高活性抗微生物肽序列之肽。使用限制性内切核酸酶BamHI及HindIII，将合成基因AHeAP182(SEQIDNO：24)克隆至Hummerich等人，Biochemistry43；13604-13612(2004)中所述之载体pAZL中，且根据其中所述之方案进行二聚化，且克隆至载体pET21(Novagen)中。随后存在于该载体中之序列编码重复前体蛋白质AHeAP184(SEQIDNO：25)。该重复前体蛋白质包含4个重复单元，每一者包含一P18肽拷贝及一辅助序列。该辅助序列包含两个聚丙氨酸序列且赋予重复前体蛋白质自组装性质。此外，辅助序列包含带负电荷之螺旋保护性序列。意欲通过酸使P18肽自前体蛋白质中选择性裂解出来之氨基酸Asp-Pro位于辅助序列与P18肽序列之间。在菌株大肠杆菌BL21[DE3](Novagen)中进行表达。
在pO2＞20％及pH＝6.8下，以补料分批方法进行培养及蛋白质合成。培养基、痕量盐溶液及补料溶液具有实施例1中所述之组成。
在存在于基础培养基中之甘油耗尽之后，开始以100ml/h之速率恒定地补料。
在细菌培养物达到OD600＝60之光密度之后，通过添加1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白质合成。在诱导之后10小时，通过在5000xg下沉降30分钟来收获细胞。湿生物量为1932g。
根据以下方案纯化湿生物量：
-重悬浮细胞沉淀物：每克生物量添加6g20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)且充分混合
-在高压匀浆机中，在1500巴下使细胞破裂
-添加磷酸至pH＝3±0.5
-在搅拌下于23℃下培育10分钟
-离心：20分钟，至少5000xg
-重悬浮此类沉淀物：每克湿质量添加25ml0.2MNaOH，匀浆且在搅拌下于23℃下培育4小时
-中和：以85％浓度之H3PO4调整pH值为8.5±0.5
-离心：20分钟，至少5000xg
-用2％浓度之H3PO4水解或裂解由经洗涤之包含P18前体蛋白质之包含体组成的沉淀物
裂解条件：
i.每克沉淀物使用5mlH3PO4
ii.匀浆
iii.在摇动下于90℃下培育16小时。
-使裂解反应混合物冷却。
-离心：20分钟，至少5000xg
-中和：以10MNaOH调整pH值为5.5±0.5
-离心：20分钟，至少5000xg
-以水稀释上清液，直至电导率小于10mS/cm
-经由阳离子交换层析(FractogelCOO；Merck)；以450mMNaCl洗脱，自上清液纯化P18
-汇集含有肽之级分，且以水稀释，直至电导率小于10mS/cm
-经由阳离子交换层析(FractogelCOO；Merck)，以50mMHCl洗脱，自汇集级分纯化P18
-以2MNaOH中和洗脱物
-冻干中和溶液。
借助于HPLC分析经冻干之产物：为此，将产物以1mg/ml之浓度溶解于水中且使用反相层析柱(JupiterProteo4.6x250mm；Phenomenex)分析。所用洗脱剂为0.1％三氟乙酸水溶液，使用线性梯度，以0.1％三氟乙酸之乙腈溶液替换。在280nm下进行检测(图4)。为进一步分析，收集主峰之级分且进一步研究其中存在之物质。N端测序证实此组分为P18肽。
借助于质谱分析(MALDI-TOF)之研究确立肽之质量为2512，此与P18肽之理论质量一致(图5)。HPLC分析揭示基于UV活性组分，纯度为85％。由30g湿生物量获得52mgP18肽。因此，每升发酵培养物可回收约330mg纯P18肽。
为研究P18肽之活性，将LB培养基(5g/l酵母提取物；10g/l胰蛋白胨，5g/l氯化钠)中之大肠杆菌B培养物在摇动下于37℃下与不同浓度之P18肽一起培育，此类培养物具有如在600nm下所测量0.1之光密度。24小时后，通过测量光密度监控细菌生长。以31ppm之肽浓度实现生长之完全抑制(24小时后，600nm下之光密度＜0.15)。通过使C端羧基酰胺化可进一步提高抗微生物活性。为此，以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐及N-羟基-磺基琥珀酰亚胺活化此类羧基且通过随后添加氨使其酰胺化。
实施例3：产生肽Min(SEQIDNO：26)
使用限制性内切核酸酶BamHI及HindIII，将合成基因AEMin4(SEQIDNO：27)克隆至Hummerich等人Biochemistry43；13604-13612(2004)中所述之载体pAZL中，且根据其中所述方案进行二聚化，且克隆至载体pET21(Novagen)中。随后存在于该载体中之序列编码重复前体蛋白质AEMin8(SEQIDNO：28)。该重复前体蛋白质包含8个重复单元，每一者包含一Min肽拷贝及一辅助序列。辅助序列包含聚丙氨酸序列且赋予重复前体蛋白质自组装性质。此外，辅助序列包含带负电荷之保护性序列。意欲使用酸使P18肽自前体蛋白质中选择性裂解出来之氨基酸Asp-Pro位于辅助序列与肽序列之间。在菌株大肠杆菌BL21[DE3](Novagen)中进行表达。
在pO2＞20％及pH＝6.8下，以补料分批方法进行培养及蛋白质合成。培养基、痕量盐溶液及补料溶液具有实施例1中所述之组成。
在存在于基础培养基中之甘油耗尽之后，开始以100ml/h之速率恒定地补料。
在细菌培养物达到OD600＝60之光密度之后，通过添加1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白质合成。此时，培养物之温度自37℃降至30℃。在诱导之后5小时，收获细胞。
根据以下方案纯化AEMin8：
-将每克湿质量细胞沉淀物重悬浮于5ml20mMpH7.0MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)中
-在高压匀浆机中，在1400巴下使细胞破裂
-在5000xg下离心30分钟
-在80℃下培育上清液20分钟
-在5000xg下离心30分钟
-通过在4℃下添加2M硫酸铵(最终浓度)隔夜，使AEMin8自上清液中沉淀出
-以8M尿素洗涤沉淀物
-以水洗涤沉淀物2次
-冻干
-使经冻干之AEMin8达到-20℃。
每升培养基回收0.4g纯AEMin8。
为裂解，将250mg经冻干之AEMin8前体蛋白质重悬浮于12.5ml1％磷酸中且在90℃下培育8小时。冷却至室温之后，通过在18000xg下沉降，自可溶性组分中移除不溶性物质。以2MNaOH中和剩余溶液。接着冻干溶液。冻干产物包含所需裂解产物及由磷酸中和得到之磷酸氢二钠。
借助于HPLC分析经冻干之产物：为此，将产物以1mg/ml之浓度溶解于水中，且使用反相层析柱(JupiterProteo4.6x250mm；Phenomenex)分析。所用洗脱剂为0.1％三氟乙酸水溶液，使用线性梯度，以0.1％三氟乙酸之乙腈溶液替换。在206nm下进行检测(图6)。为进一步分析，收集主峰之级分且进一步研究其中存在之物质。N端测序证实此组分为Min肽。借助于肽质谱分析(MALDI-TOF)之研究确立1900之质量，其与Min肽之理论质量一致(图7)。HPLC分析揭示基于UV活性组分，纯度为68％。
实施例4：优化肽P18(SEQIDNO：23)之制备
为提高来自实施例2之肽P18的产率，研究不同Aux序列对肽产率之影响。在合成基因AHe2AP182(SEQIDNO：74)在根据实施例2克隆至载体pET21中之后编码SEQIDNO：75之前体蛋白质的情况下，观察到表达及总产率显著提高。根据实施例2中所述条件进行发酵。
根据以下方案纯化湿生物量：
-重悬浮细胞沉淀物：每克生物量添加6g水且充分混合
-在高压匀浆机中，在1500巴下使细胞破裂
-添加磷酸至pH＝3±0.5
-在搅拌下于23℃下培育10分钟
-离心：20min，至少5000xg
-重悬浮此类沉淀物：每克湿质量添加20ml0.4MNaOH，匀浆且在搅拌下于23℃下培育1小时
-中和：以1MpH6.0磷酸钾缓冲液调整pH值为8.5±0.5
-离心：20分钟，至少5000xg
-用2％H3PO4水解或裂解由经洗涤之包含P18前体蛋白质之包含体组成的沉淀物
裂解条件：
i.每克沉淀物使用7mlH3PO4
ii.匀浆
iii.在摇动下于90℃下温育16小时
-冷却裂解反应混合物
-离心：20分钟，至少5000xg
-以25％NaOH调整pH值为4.0±0.5
-离心：20分钟，至少5000xg
-以水稀释上清液，直至电导率小于30mS/cm
-经由阳离子交换层析(SP-SepharoseHighPerformance；GEHealthcare)，自上清液纯化P18；洗涤缓冲液：10mMpH4乙酸钠缓冲液+450mMNaCl；洗脱缓冲液：10mMpH4乙酸钠缓冲液+1100mMNaCl
-通过添加25％NaOH至洗脱物中，直至pH＝10.5±0.3，使肽沉淀
-离心：20分钟，至少5000xg
-每克湿质量沉淀物重悬浮于5毫升水中
-溶解肽：添加乙酸，直至pH＝6±0.5
-冻干
以上述方式，每升发酵培养液可获得约1g纯P18肽。
实施例5：制备肽SEQIDNO：6
经由自各个前体蛋白质进行酸裂解，获得实施例1至4中所提及之肽。这涉及天冬氨酸与脯氨酸之间的肽键水解。因此，如实施例1中所示，肽序列在N端之脯氨酸残基开始及在C端之天冬氨酸残基结束。如实施例2及3中所示，可在某些条件下使C端天冬氨酸残基裂解，因此，允许产生具有自由选择C端序列之肽序列。
为展示本发明之方法可制备N端不以脯氨酸残基开始而以自由选择的N端氨基酸开始的肽，制备具有SEQIDNO：6之肽。出于此目的且根据实施例4，利用合成基因AHe2AP182-P-G(SEQIDNO：76)制备具有SEQIDNO：77之前体蛋白质。该前体蛋白质与实施例4之前体蛋白质SEQIDNO：75的不同之处在于P18肽之N端氨基酸为Pro-Gly，且此外C端Gly缺失。根据实施例4中所述条件进行克隆及发酵。
根据以下方案纯化湿生物量：
-重悬浮细胞沉淀物：每克生物量添加6g水且充分混合
-在高压匀浆机中，在1500巴下使细胞裂解
-离心：20分钟，至少5000xg
-用5％H3PO4水解或裂解由含有P18前体蛋白质之包含体组成之沉淀物
裂解条件：
i.每克沉淀物使用5mlH3PO4
ii.匀浆
iii.在摇动下于90℃下温育16小时
-冷却裂解反应混合物
-离心：20分钟，至少5000xg
-以25％NaOH调整pH值为4.0±0.5
-离心：20分钟，至少5000xg
-以水稀释上清液，直至电导率小于30mS/cm
-经由阳离子交换层析(SP-SepharoseHighPerformance；GEHeraltheare)，自上清液纯化肽；洗涤缓冲液：10mMpH4乙酸钠：缓冲液+450mMNaCl；洗脱缓冲液：10mMpH4乙酸钠缓冲液+1100mMNaCl
-通过添加25％NaOH至洗脱物中，直至pH＝10.5±0.3，使肽沉淀
-离心：20分钟，至少5000xg
-每克湿质量沉淀物重悬浮于5毫升水中
-通过添加乙酸，直至pH＝6.0±0.5，来溶解肽
-冻干
借助于HPLC分析经冻干之产物。为此，将产物以1mg/ml之浓度溶解于水中，且借助于反相层析柱(JupiterProteo4.6x250mm；Phenomenex)分析。使用的洗脱剂为0.1％三氟乙酸水溶液，以线性梯度之0.1％三氟乙酸之乙腈溶液替换。在280nm下进行检测(图8)。为进一步分析，收集主峰之级分且进一步研究其中所含物质。借助于质谱分析(MALDI-TOF)之研究展示具有2300.6之质量的肽，其与肽SEQIDNO：6之理论质量一致(图9)。
实施例6：经冻干之肽p18(SEQIDNO：23)之酰胺化
在一些情况下，若C端不含游离羧基而以酰胺化形式存在，则此对于肽活性而言可为有利的。为进一步证明此，根据以下方案使实施例4之经冻干之肽P18酰胺化：
○10mg/mlP18肽
○30％EtOH
○10mMpH5.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸
○3M氯化铵
○2.5mMN-羟基琥珀酰亚胺
○50mM1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
○在室温下温育2小时
○以NaOH中和至pH7.0
通过使用LunaSCX5μ100A层析柱(Phenomenex，Torrance，CA，USA)进行HPLC来分析酰胺化样品：使用的洗脱剂是20mMKH2PO4(pH2.5)及25％乙腈，以线性梯度以20mMKH2PO4(pH2.5)、25％乙腈及1MKCl替换。在280nm下进行检测(图10)。为进行比较，图10展示具有肽“P18”序列之以化学方式合成及酰胺化之参考肽(如由BachemAG，Bubendorf，Switzerland所制备)的层析图。
通过如实施例4中所述之阳离子交换层析进一步纯化肽。
实施例7：以整合酰胺化来制备肽P18(SEQIDNO：23)
为提高制备酰胺化肽P18之经济效率，将酰胺化整合到处理过程中而不是如根据实施例6所述在肽纯化后进行酰胺化。出于此目的，通过根据实施例4之发酵获得前体蛋白质SEQIDNO：75，且通过使前体蛋白质进行酸裂解，释放肽。
随后进行以下步骤：
-冷却裂解反应混合物
-离心：20分钟，至少5000xg
-以25％NaOH调整pH值为10.5±0.5
-离心：20分钟，至少5000xg
-每克湿质量沉淀物溶解于3ml乙醇中
-离心；确定上清液中之肽(稀释)
-混合以下组分：
a.12.5ml溶解于乙醇中之肽
b.4.2ml水
c.添加400μ1500mM2-(N-吗啉代)乙磺酸
d.以HCl调整pH值为5.0
e.添加2.14g氯化铵
f.200μ1500mMN-羟基琥珀酰亚胺
g.1ml1M1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
-在室温下温育2小时
-以水稀释混合物，直至电导率小于30mS/cm
-经由阳离子交换层析(SP-SepharoseHighPerformance；GEHealthcare)，纯化经修饰之P18；洗涤缓冲液：10mMpH4乙酸钠缓冲液+450mMNaCl；洗脱缓冲液：10mMpH4乙酸钠缓冲液+1100mMNaCl
-通过添加25％NaOH至洗脱物中，直至pH＝10.5±0.3，使肽沉淀
-离心：20分钟，至少5000xg
-每克湿质量沉淀物重悬浮于5毫升水中
-溶解肽：添加乙酸至pH6±0.5
-冻干
通过使用LunaSCX5μ100A层析柱(Phenomenex，Torrance，CA，USA)进行HPLC来分析酰胺化样品：使用的洗脱剂是20mMKH2PO4(pH2.5)及25％乙腈，以线性梯度以20mMKH2PO4(pH2.5)、25％乙腈及1MKCl替换。在280nm下进行检测(图11)。为比较，图11展示具有肽“P18”序列之以化学方式合成及酰胺化之参考肽(如由BachemAG，Bubendorf，Switzerland所制备)的层析图。
本发明之序列之总览
SA＝自组装序列
SU＝保护性肽
Pep＝待产生之肽
除上述特异性Pep氨基酸序列之外，所列序列可因添加特异性裂解序列(例如介于酸裂解之残基“DP”之间；或介于羟胺裂解之残基“NG”之间)或因由此类裂解产生之剩余氨基酸残基而在C端及/或N端改变。任选，间隔残基(诸如G残基)亦可另外插入裂解序列与Pep序列之间。尤其应提及可由根据本发明所产生之Pep序列之酸裂解或羟胺裂解产生之上述Pep序列的以下改变：
N端：添加PG-、P-或G-残基；
C端：添加GD-、GN-、G-、N-或D-残基
此类改变尤其适用于每一上述Pep序列，尤其为SEQIDNO：6至15、29至67及72之序列。
明确参考本文中所引用之文献的揭示内容。
Claims (22)
1.一种前体蛋白质，其包含所需肽组件及辅助肽组件的可裂解重复序列，具有通式
(Pep-Aux)X或
(Aux-Pep)X
其中x>1，其中
此类Aux组件为相同或不同的且包含赋予所述前体蛋白质自组装性质的氨基酸序列组件，其中至少一个Aux组件包含自组装肽组件，该自组装肽组件由C端和N端延长序列以及选自An、Vn和(VVAA)O的序列组成，其中所述N端延长序列为“G-”,“GS-”,“GAG-”,“GPG-”,“GPS-”,“GAS-”,“GQQ-”和“GSS-”，所述C端延长序列为“–SGP”,“–GGA”,“–GPG”,“–SGA”,“–GGQ”,“-GGY”及“–GGL”，A为丙氨酸，G为甘氨酸，V为缬氨酸，S为丝氨酸，P为脯氨酸，Q为谷氨酸，Y为酪氨酸，n为5至12的整数，且o为2至6的整数；
其中所需肽组件由Pep组件表示，辅助肽组件由Aux组件表示，且自组装肽组件由SA组件表示；及
此类Pep组件为相同或不同的且包含相同或不同肽分子的氨基酸序列，所述肽分子具有5至70个氨基酸残基的序列长度，Pep组件侧翼是裂解序列，所述裂解序列能够使Pep组件自前体蛋白质中特异性移除，且其中所述组件Pep与Aux以肽键连接彼此且该肽键可依化学方式或酶促方式特异性裂解。
2.根据权利要求1的前体蛋白质，其形成稳定缔合物，此类稳定缔合物在室温下不能在1小时内由0.2MNaOH溶解或在10分钟内由2M尿素或1M盐酸胍溶解。
3.根据权利要求1的前体蛋白质，其中所述SA组件由选自氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:5及SEQIDNO:73的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1-3中任一项的前体蛋白质，其中至少一个Aux肽另外包含保护性肽组件，其中所述保护性肽组件由SU组件表示。
5.根据权利要求4的前体蛋白质，其中所述SU组件具有比例增加的带负电荷的氨基酸残基。
6.根据权利要求5的前体蛋白质，其中所述前体蛋白质中的所述SU组件能够形成两亲性螺旋结构。
7.根据权利要求6的前体蛋白质，其中所述SU组件为两亲性肽，其包含能够形成两亲性α-螺旋的至少七个以肽键连接的氨基酸的序列区段，其中所述螺旋的氨基酸残基在垂直投影中分为该螺旋的疏水性半部及亲水性半部，该螺旋的疏水性半部在该垂直投影中具有至少3个相邻的相同或不同的疏水性氨基酸残基，且该螺旋的亲水性半部在该垂直投影中具有至少3个相邻的相同或不同的亲水性氨基酸残基。
8.根据权利要求5、6或7的前体蛋白质，其中选择所述SU组件的带电氨基酸残基的比例，使得在pH＝7下该前体蛋白质的总净电荷大于-10且小于+10。
9.根据权利要求5至7中任一项的前体蛋白质，其中所述SU组件包含选自氨基酸序列SEQIDNO:16至SEQIDNO:19及SEQIDNO:68的氨基酸序列。
10.根据权利要求5至7中任一项的前体蛋白质，其中所述Pep组件包含阳离子抗微生物肽序列。
11.根据权利要求10的前体蛋白质，其中所述Pep组件包含选自阳离子氨基酸序列SEQIDNO:6至SEQIDNO:15、SEQIDNO:23、SEQIDNO:26及SEQIDNO:69至SEQIDNO:72的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至3中任一项的前体蛋白质，其中所述Pep组件包含选自氨基酸序列SEQIDNO:20或SEQIDNO:29至67的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-3中任一项的前体蛋白质，其中所述Aux组件彼此独立地具有以下结构：
SA，
其中所述Aux组件在末端以肽键连接于至少一个Pep组件，且连接于所述Pep组件的此肽键可依化学方式或酶促方式特异性裂解。
14.根据权利要求4中的前体蛋白质，其中所述Aux组件彼此独立地具有任一以下结构：
SA-SU，
SU-SA，
SA-SU-SA，
SU-SA-SU，
其中所述组件SA与SU以肽键连接彼此，且所述Aux组件在末端以肽键连接于至少一个Pep组件，且连接于所述Pep组件的此肽键可依化学方式或酶促方式特异性裂解。
15.一种核酸序列，其编码至少一种根据前述权利要求中任一项的前体蛋白质。
16.根据权利要求15的核酸序列，其包含序列SEQIDNO:21、24、27、74及76的至少一种编码序列。
17.一种表达盒，其包含至少一种根据权利要求15或16的核酸序列，该至少一种核酸序列可操作性连接于至少一种调节核酸序列。
18.一种用于转化真核或原核宿主的重组载体，其包含根据权利要求15及16中任一项的核酸序列，或根据权利要求17的表达盒。
19.一种产生所需肽的方法，其包括
a)产生根据权利要求1至14中任一项的前体蛋白质，
及
b)自该前体蛋白质移除所述Pep肽；
其中所述所需肽由Pep表示。
20.根据权利要求19的方法，其中在携带至少一种根据权利要求18的载体的重组微生物中产生所述前体蛋白质。
21.根据权利要求20的方法，其中在重组大肠杆菌菌株中产生所述前体蛋白质。
22.根据权利要求19至21中任一项的方法，其中任选在所述表达的前体蛋白质转化为稳定缔合形式后，将其纯化且依化学方式或酶促方式裂解，以释放该所需肽，其中所述所需肽由Pep表示。
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