CN103740661B - 一种提高酶热稳定性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高酶热稳定性的方法，通过将双亲短肽与重组酶进行融合表达获得热稳定性的提高的重组酶。其中优选的双亲短肽的序列为DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDWLKAFYDKVAEKLKEAF。该方法具有效果显著、工艺简单、便于推广。本发明为快速提高工业酶热稳定性提高了新的方法和思路。

Description

一种提高酶热稳定性的方法
技术领域
本发明涉及一种提高酶热稳定性的方法，特别是一种利用双亲短肽融合表达提高重组酶的热稳定性的方法。
背景技术
双亲短肽是具有亲水和亲油能力的小分子肽，广泛存在于膜蛋白及脂肪代谢相关酶类的结构中。其双亲的特点能够帮助酶分子与疏水性底物结合、实现酶分子的定位等。
生物活性酶在工业生产中具有广泛的应用，而提高酶的热稳定性是工业酶的研究重点之一。目前，提高酶热稳定性的方法主要包括：1.定向进化：通过定点突变，随即突变，饱和突变等技术，筛选得到热稳定的突变株；2.从嗜热微生物中筛选热稳定性的酶。但是，这些方法并不适用于所有酶分子热稳定性改造中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高酶热稳定性的方法，通过在重组酶的N端或C端融合表达双亲短肽实现酶热稳定性的提高。
为解决上述技术问题提供如下技术方案：
第一步双亲短肽基因的获得
根据双亲短肽的氨基酸序列，化学合成相应的DNA序列，并将其克隆至大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)的Nde I和Nco I酶切位点之间上，构建成为pET-22b(+)/AP质粒；
第二步融合双亲短肽的重组酶表达质粒的构建
将重组酶基因克隆至pET-22b(+)/AP质粒的Nco I和Hind III位点之间。构建成为表达融合双亲短肽的重组酶表达质粒pET-22b(+)/AP-enzyme。
第三步融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建
将重组质粒pET-22b(+)/AP-enzyme转化宿主大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))，构建高效表达目的酶的诱导型大肠杆菌基因工程菌。
菌株经培养表达目的酶的方法为：
培养基组成(g/L)：
种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5；
发酵培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。；
各组分溶解后高压灭菌；冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL；高压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)；
培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD600达到0.6时，将培养温度降为16℃，同时加入终浓度为1.0mM的诱导剂IPTG。
目的酶热稳定的测定方法：
将目的酶分别应用疏水层析、离子交换层析等分离手段，得到电泳纯的目的酶。将目的酶在一定温度下保温，测定酶活相比初始未保温时损失50%所需要的时间(T1/2)。
本发明提供了一种提高酶热稳定性的方法，应用双亲短肽融合表达重组酶能够提高目的重组酶的热稳定性。该方法具有效果显著、工艺简单、便于推广。本发明为快速提高工业酶热稳定性提高了新的方法和思路。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。
材料和方法：所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，PCR试剂，DNA Marker等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109，引物，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司。
实施例1：双亲短肽的氨基酸序列并克隆至质粒pET-22b(+)
1AEAEAKAKAEAEAKAK
2.VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGTNSFVSGVSGVASGAGSIGRR
3.DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVEPLRADWLKAFYDKVAEKLKEAF
4.DWLKAFYDKVAEKLKEAFGLLPVLEDWLKAFYDKVAEKLKEAF
5.DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDWLKAFYDKVAEKLKEAF
6.DWLKAFYDKVAEKLKEAFNGGARLADWLKAFYDKVAEKLKEAF
按照以上氨基酸序列通过化学合成DNA序列，并克隆至质粒pET-22b(+)等到质粒pET-22b(+)/AP
实施例2：重组质粒pET-22b(+)/AP-enzyme的构建
将目的酶基因克隆至表达载体pET-22b(+)/AP的Nco I和Hind III位点。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下：
(1)无菌状态下取感受态细胞200μL置于无菌的微量离心管中；
(2)每管加入1-2μL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min；
(3)42℃热休克90s(准确),不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800μL；
(6)用无菌铺菌器将200μL菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37℃平放20min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。
挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。
实施例3：融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建
感受态大肠杆菌BL21(DE3)进行转化。转化方法如下：
(1)无菌状态下取感受态细胞200μL置于无菌的微量离心管中；
(2)每管加入1-2μL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min；
(3)42℃热休克90s（准确）,不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800μL；
(6)用无菌铺菌器将200μL菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37℃平放20min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。
挑选阳性转化子，提取质粒验证，证明转化成功。
实施例4：发酵生产融合双亲短肽的脂肪氧合酶
脂肪氧合酶基因序列如Genebank NO:PA119所示，根据实施例2，实施例3所述方法得到融合双亲短肽的重组脂肪氧合酶的表达菌株，以该菌株作为种子发酵生产重组脂肪氧合酶。
培养基组成(g/L)：
种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。
发酵培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。
各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g K2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL。高压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)。
培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD600达到0.6时，将培养温度降为16℃，同时加入终浓度为1.0mM的诱导剂IPTG，发酵24h。
将发酵液15000rpm离心10min得到菌体，将菌体溶解于150mM Tris-Hcl，pH7.5的缓冲液中，并依次通过疏水层析、离子交换层析得到电泳纯的重组酶。在50℃下测定重组酶的热稳定性，如表1所示：
表1.融合双亲短肽提高脂肪氧合酶的热稳定性，以未融合双亲短肽的为对照
对照 1 2 3 4 5 6
T1/2min(50℃) 10 18 39 38 22 252 187
实施例5：发酵生产融合双亲短肽的碱性淀粉酶
以实施例2，实施例3所述方法得到融合双亲短肽的重组碱性淀粉酶的表达菌株，以该菌株作为种子发酵生产重组碱性淀粉酶。碱性淀粉酶基因序列如Genebank NO:HV220894.1所示。
培养基组成(g/L)：
种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。
发酵培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。
各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL。高压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)。
培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD600达到0.6时，将培养温度降为16℃，同时加入终浓度为1.0mM的诱导剂IPTG，发酵24h。
将发酵液15000rpm离心10min得到菌体，将菌体溶解于150mM Tris-Hcl，pH7.5的缓冲液中，并依次通过疏水层析、离子交换层析得到电泳纯的重组酶。在50℃下测定重组酶的热稳定性，如表2所示：
表2.融合双亲短肽提高碱性淀粉酶的热稳定性，以未融合双亲短肽的为对照
对照 1 2 3 4 5 6
T1/2min(60℃) 25 40 60 57 80 350 300
实施例6：发酵生产融合双亲短肽的谷氨酰胺转肽酶
以实施例2，实施例3所述方法得到融合双亲短肽的重组谷氨酰胺转肽酶的表达菌株，以该菌株作为种子发酵生产重组谷氨酰胺转肽酶。谷氨酰胺转肽酶基因序列如Genebank NO:AF531437所示。
培养基组成(g/L)：
种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。
发酵培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。
各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL。高压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)。
培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD600达到0.6时，将培养温度降为16℃，同时加入终浓度为1.0mM的诱导剂IPTG，发酵24h。
将发酵液15000rpm离心10min得到菌体，将菌体溶解于150mM Tris-Hcl，pH7.5的缓冲液中，并依次通过疏水层析、离子交换层析得到电泳纯的重组酶。在50℃下测定重组酶的热稳定性，如表2所示：
表3.融合双亲短肽提高谷氨酰胺转肽酶的热稳定性，以未融合双亲短肽的为对照
对照 1 2 3 4 5 6
T1/2min(50℃) 12 21 40 45 100 328 298
本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种提高酶热稳定性的方法，其特征在于将双亲短肽与重组酶进行融合表达，所述双亲短肽融合在重组酶的N端或者C端，双亲短肽的序列为：
DWLKAFYDKVAEKLKEAFGLLPVLEDWLKAFYDKVAEKLKEAF。
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