CN103952382B - 一种维生素c磷酸化酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种维生素C磷酸化酶及其应用，包括有a)序列为SEQ ID NO：1酶；b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本发明提供的维生素C磷酸化酶能特异性作用于维生素C的C₂位上进行磷酸化，生成相应的维生素C‑2磷酸酯。因此可以利用维生素C磷酸化酶应用于工业化生产维生素C‑2磷酸酯，具有很大的商业价值。

Description

一种维生素C磷酸化酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种维生素C磷酸化酶及其应用。

背景技术

维生素C磷酸化酶(L-ascorbic acid phosphorylase)又称为维生素C-2磷酸激酶，属于酸性磷酸化酶类，是一类可以在亲核之间可以催化转移磷酸基团的酶。维生素C磷酸化酶能立体特异性作用于维生素C的C₂位上进行磷酸化，生成相应的维生素C-2磷酸酯。维生素C-2磷酸酯作为维生素C的高附加值产品，克服了维生素C见光、受热易分解的缺陷，随着国内维生素C价格的持续走低，开发维生素C的高附加值产品成为了企业发展的新方向，其中维生素C-2磷酸酯就是其典型代表。目前，国内工业化生产维生素C-2磷酸酯主要是通过化学合成法，此法副产物多，产品的后提取资金投入大，而且还伴随着环境的污染等问题。利用维生素C磷酸化酶转化维生素C生产维生素C-2磷酸酯具有重要的工业应用价值。

1993年，Tastsuro Fujio等首次在Pseudomonas azotocolligans ATCC12417(即黄质杆菌)中发现了维生素C磷酸化酶从而实现了酶法生产维生素C-2磷酸酯的可能，但由于原菌产酶能力低，从而限制了其利用，因此利用基因工程策略构建维生素C磷酸化酶菌株，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种维生素C磷酸化酶，即一种具有工业应用价值的酶，为工业化生产维生素C磷酸酯提供了新的路径。

本发明获得的维生素C磷酸化酶基因，包含有756bp的基因，编码一个由252个氨基酸组成的蛋白质。

本发明包含的维生素C磷酸化酶，包括有：

a)序列为SEQ ID NO：1的酶；

b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a)中所述酶的活性的，由a)衍生的酶

编码上述维生素C磷酸化酶的核苷酸，其序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供用于表达上述维生素C磷酸化酶的重组表达质粒，是将序列为SEQ IDNO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。所述的原核表达载体为pET20b^-。

本发明还涉及携带有表达上述维生素C磷酸化酶的重组表达质粒的重组菌。

本发明的维生素C磷酸化酶用于维生素C-2磷酸酯的应用。

附图说明

附图1为本发明的维生素C磷酸化酶基因DNA电泳图谱；

附图2为利用维生素C磷酸化酶能催化维生素C合成维生素C-2磷酸酯；

具体实施方式

一、维生素C磷酸化酶筛选及检测

1、黄质杆菌(Sphingomonas trueperi)总DNA提取

(1)将黄质杆菌(Sphingomonas trueperi)接种到MM培养基中，于30℃培养过夜。

(2)按细菌基因组提取试剂盒上的方法提取。

2、编码维生素C磷酸化酶基因的扩增

通过BLAST比对得到了来黄质杆菌编码维生素C磷酸化酶的基因序列，即SEQ ID NO：1所示序列，设计一对寡核苷酸序列引物P1和P2，其序列为：

P1：5′-CATGCCATGGCAATGATCCGCGGTGGCATCTTCG-3′；

P2：5′-CCCAAGCTTTCACCAGGGGCGGACGCGAA-3′

以实例1提取的基因组DNA作为模板，扩增维生素C磷酸化酶基因。反应程序如下：95℃预变性3min；95℃0.5min、60℃退火0.5min、72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图1。

3、表达载体及重组菌的构建

用限制性内切酶Hind III和NocI分别对载体pET20b^-和质粒T-asp进行双酶切，胶回收pET20b^-线性载体和目标基因，用T4DNA Ligase在16℃条件下连接线性载体和目标基因过夜，连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布氨苄抗生素抗性平板，通过对转化子菌落PCR和酶切验证，确认获得阳性克隆E.coli BL21(DE3)/pET20b^--asp。

4、重组菌的诱导表达和酶活力测定

接种实施例3中的重组子于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm条件下培养至菌体OD值达到0.6时，添加0.4mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养3h。取发酵液1mL于1.5mL离心管中于8000rpm下离心5min后分离上清和沉淀，沉淀用500uL的去离子水重悬并利用超声波破碎仪破碎(超4s间歇4s)，然后分别取200uL的破碎液和上清液作为粗酶液加入到800uL的酶活力测定液中，于42℃、200rpm条件下反应30min后测定菌体酶活力。

二、维生素C磷酸化酶用于合成维生素C-2磷酸酯

取30mL实施例4中培养的发酵液于50mL离心管中，于8000×g条件下离心5min，并收集菌体，菌体用无菌水洗涤两次后直接加入到10mL转化液中(转化液成分为：0.4mol/L维生素C、0.2mol/L的焦磷酸钠，pH4.2)，于37℃条件下反应2.5h，每隔0.5h取样测定维生素C和维生素C-2磷酸酯的产量，结果如图2。

Claims (5)

1.一种维生素C磷酸化酶，其特征在于，所述的维生素C磷酸化酶是核苷酸序列为SEQ ID NO：1的序列所编码的酶。

2.一种核苷酸，其特征在于所述核苷酸用于编码权利要求1所述的维生素C磷酸化酶。

3.一种用于表达权利要求1所述的维生素C磷酸化酶的重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒是将序列为SEQ ID NO：1的基因插入到原核表达载体pET20b^-上构建的。

4.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌含有权利要求3中所述的重组表达质粒。

5.权利要求1中的维生素C磷酸化酶在工业化生产维生素C-2磷酸酯方面的应用。