CN104498516A - 高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用 - Google Patents
高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104498516A CN104498516A CN201410647807.4A CN201410647807A CN104498516A CN 104498516 A CN104498516 A CN 104498516A CN 201410647807 A CN201410647807 A CN 201410647807A CN 104498516 A CN104498516 A CN 104498516A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- petd
- subunit
- hydrogen
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高效产氢功能基因载体pETD-SL，及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。pETD-SL基因载体为包含有[NiFe]氢酶基因的pETDuet-1质粒。其构建是通过设计引物扩增[NiFe]氢酶基因片段的大亚基hupL和小亚基hupS基因，并把上述两个基因片段用限制性内切酶酶切并用DNA连接酶将其相继连接到还有对应连接末端的pETDuet-1片段中，进行基因测序，验证基因的完整性。将pETD-SL质粒转化到细菌中，在产氢培养基中培养此细菌生产氢气。pETD-SL能够应用于不同细菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。也能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用。
背景技术
随着石油等化石能源的消耗速度加快及其储备不断减少的情况下，急需发展新型能源，而氢能源作为一种既高效又清洁的能源而备受关注。氢能源即可通过化学方法得到，但因其成本高且可能导致的环境污染问题而备受争议，而生物产氢即能解决这个问题。生物产氢的微生物有很多，其中大肠杆菌产氢无论从成本还是从效率来看都是最佳选择之一。目前来看，野生的大肠杆菌不产氢或者产氢较少，无法满足人类对能源的需求，因此，基因工程或者代谢工程就需要应用于改造大肠杆菌使其产氢性能大量增加。现有的产氢大肠杆菌消耗底物多，但是产生的氢气比较少，效率还比较低，急需通过改造引入外源基因使其产氢效率大幅度提高，而不同的外源基因的产氢效率也有所差别。
发明内容
本发明的目的是提供一个高效产氢功能基因载体pETD-SL，及其构建方法。其能够应用于不同细菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种高效产氢功能基因载体pETD-SL，其为包含有沼泽红假单胞菌的[NiFe]氢酶基因中大亚基基因片段和小亚基基因片段的pETDuet-1质粒。
本发明还提供了高效产氢功能基因载体pETD-SL的构建方法，包括以下步骤：
(1)设计[NiFe]氢酶基因中大亚基hupL和小亚基hupS的引物，并扩增[NiFe]氢酶基因片段的大亚基hupL和小亚基hupS基因。
(2)回收[NiFe]氢酶的大亚基hupL和小亚基hupS的基因片段，进行测序验证扩增基因的完整性。
(3)外源基因的克隆主要借助PCR技术，通过查找沼泽红假单胞菌[NiFe]氢酶基因的同源序列，利用DNAman或Primer设计DNA引物，克隆沼泽红假单胞菌[NiFe]氢酶基因，且通过DNA测序验证了序列的完整性。
(4)根据pETDuet-1上的酶切点设计引物，PCR扩增大亚基hupL和小亚基hupS基因片段，其中，作为优选，所述大亚基酶切位点为BamH I，AscI；所述小亚基酶切位点为BgI II，Knp I。
(5)切割回收扩增好的带有限制性酶切点的大亚基和小亚基基因片段，并用克隆载体pMD19-T质粒分别将大、小亚基基因片段连接起来，得到含大亚基和小亚基基因片段的重组载体。
(5)将重组载体中小亚基和pETDuet-1质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应，然后用DNA连接酶将酶切后的pETDuet-1片段与的酶切好的小亚基片段连接得到pETD-S质粒；其中，此步骤中所述限制性内切酶为酶BgI II，Knp I。
(6)将重组载体中大亚基和(5)中pETD-S质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应，然后用DNA连接酶将酶切后的pETD-S片段与的酶切好的大亚基片段连接，得到含有大、小亚基片段的pETD-SL质粒；其中，此步骤中所述限制性内切酶为酶BamH I，AscI。
作为优选，上述步骤中还包括将基因扩增后测序，验证基因的完整性。
pETDuet-1质粒有2个多克隆位点，每个多克隆位点各有一个抗体标签和12个内切酶位点。本发明通过BamH I和Sal I位点插入了大亚基基因，通过BgI II和Kpn I位点插入了小亚基基因。
本发明还提供高效产氢功能基因载体pETD-SL的应用：将pETD-SL质粒转化到大肠杆菌中，在产氢培养基中培养此大肠杆菌生产氢气。
本发明中沼泽红假单胞菌，来源于专利保藏菌株。菌种保藏单位为位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种名称沼泽红假单胞菌，拉丁文为Rhodopeseudomonaspalustris，菌种保藏号为CGMCC NO.9276，菌种保藏日期为2014.06.06。
本发明的有益效果是pETD-SL能够应用于大肠杆菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明：
图1是载体pETD-SL的构建方案示意图；
图2是pETD-SL质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中随时间的产氢曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)在NCBI上查找关于沼泽红假单胞菌NiFe氢酶的同源基因序列，利用DNAman软件结合NCBI上查找的同源基因序列一同设计，分别设计大亚基hupL和小亚基hupS引物。将设计好的引物交给基因测序公司进行引物合成，引物合成的方法是固相亚磷酰胺三酯法。
设计出来的引物为：
hupLu:AACGGCAAGTCGGCTTAA；hupLd:TGATAGACATAGACCGTCTGCAAC；
hupSu:GGCTTATCACCTCGTCGTCGTTT；hupSd:AGTCGTGACGTTGGTCATG；
(2)根据设计好的引物，利用PCR技术扩增NiFe氢酶基因片段，即大亚基hupL和小亚基hupS。PCR条件设置：变性95℃30s，复性55℃30s，延伸72摄氏度1.5分钟，35个循环；20uL体系：2uL 10*Taq buffer，2uL MgCl2，1uL 10mmdNTP，12uL ddH2O，1uLDAN模板，1uL上引物，1uL下引物，0.2uLTaq DNA酶。
(3)将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割回收大小亚基片段，最后将切割片段用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)回收，各35uL的大小亚基片段。
(4)将胶回收的片段送往基因测序公司测序，以验证扩增基因的完整性。
(5)经过验证后，根据pETDuet-1上的酶切位点设计引物，并再次使用PCR技术扩增NiFe氢酶基因片段。PCR条件设置，变性95℃30s，复性55℃30s，延伸72℃1.5分钟，35个循环。此时得到的片段带有限制性酶切位点，用于与载体的连接；(大亚基酶切位点BamH I,AscI；小亚基酶切位点BgI II，Knp I)引物序列为：hupLu:cgggatcccgTAACGGCAAGTCGGCTTA；
hupLd:aggcgcgcctTGATAGACATAGACCGTCTGCAAC；
hupSu:gaagatcttcGGCTTATCACCTCGTCGTTT；
hupSd:ggggtaccccAGTCGTGACGTTGGTCATG；
(6)将(5)扩增好的带有限制性酶切位点的大亚基和小亚基用用琼脂糖凝胶电泳分离，并凝胶成像仪下切割回收，最后用pMD19-T质粒分别将大小亚基连接起来，得到含有大亚基和小亚基基因片段的pMD19-T质粒各30uL；①连接体系：1uL pMD19-T Vector，3uL DNA模板，1uL dH2O,5uL SolutionI；②16℃反应30分钟；③将连接好的质粒加入100uL的DH5α感受态中，冰中放置30分钟；④42℃加热45秒，再在冰中放置1分钟；⑤加入400uL LB培养基，37℃振荡培养40分钟；⑥将培养液倒入含有氨苄的固体LB培养基培养过夜；挑选单菌落放入100mL含有氨苄的液体LB培养基扩大培养，最后用质粒提取试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)提取质粒。
(7)将(6)中的小亚基用酶BgI II，Knp I作分步酶切反应，得到含有BgI II，Knp I的粘性末端的小亚基片段，酶切步骤为：①反应温度37℃，缓冲液5*NEBuffer 3.15uL，酶BgI II 1uL,小亚基基因20uL，无菌水24uL反应时间3h；②利用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)回收①的酶切片段；③反应温度37℃，缓冲液5*NEBuffer 1.11uL，酶Knp I 1uL，①切片段20uL，无菌水24uL，反应时间3h；最后酶切片段用胶回收试剂盒回收，回收后含有BgIII，Knp I的粘性末端的小亚基片段10uL。
(8)分别将20uL pETDuet-1质粒用酶BgI II，Knp I作分步酶切反应，得到含有BgI II，Knp I的粘性末端的小亚基片段，酶切步骤及体系为：①反应温度37℃，缓冲液5*NEBuffer 3.15uL，酶BgI II 1uL,小亚基基因20uL，无菌水24uL反应时间3h；②利用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)回收①的酶切片段；③反应温度37℃，缓冲液5*NEBuffer 1.11uL，酶Knp I 1uL，①切片段20uL，无菌水24uL，反应时间3h；最后酶切片段用胶回收试剂盒回收，回收后含有BgI II，Knp I的粘性末端的小亚基片段10uL；最后得到含有BgI II，Knp I粘性末端的pETDuet-1质粒10uL。
(9)将(8)中酶切好的pETDuet-1质粒与(7)的酶切好的小亚基片段作酶连反应，得到含有小亚基片段的pETDuet-1质粒，即pETD-S质粒；酶连反应体系：T4DNA连接酶1uL，10*T4DNA连接酶反应缓冲液1uL，(7)中的小亚基片段3uL，(8)中酶切好的pETDuet-1质粒1uL，无菌水4uL，反应温度16℃，反应时间15分钟。
(10)将(6)中的大亚基用酶BamH I,AscI作双酶切反应，得到含有BamHI,AscI的粘性末端大亚基片段，酶切体系是：温度37℃，缓冲液5*Cutsmrat 5uL，酶BamH I,AscI各1uL，大亚基基因20uL，无菌水23uL，酶切时间3h；最后酶切片段用胶回收试剂盒回收，回收后含有BamH I,AscI的粘性末端的大亚基片段10uL。
(11)将分别将(9)中的pETD-S质粒用酶BamH I,AscI作双酶切反应，得到含有BamH I,AscI的粘性末端大亚基片段，酶切体系是：温度37℃，缓冲液5*Cutsmrat 5uL，酶BamH I,AscI各1uL，大亚基基因20uL，无菌水23uL，酶切时间3h；最后酶切片段用胶回收试剂盒回收(Omega Bio-Tek,USA)，最后得到含有BamH I,AscI粘性末端的pETD-S质粒10uL；
(12)将(11)中酶切好的pETD-S质粒与(7)的酶切好的大亚基片段作酶连反应，得到含有大，小亚基片段的pETDuet-1质粒，即pETD-SL质粒10uL；酶连反应体系：T4DNA连接酶1uL，10*T4DNA连接酶反应缓冲液1uL，(10)中的大亚基片段3uL，(11)中酶切好的pETD-S质粒1uL，无菌水4uL，反应温度16℃，反应时间15分钟。
(13)将(12)中的质粒在扩增后送往基因公司测序，以验证基因的完整性；
(14)将(13)中已验证后的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，利用产氢培养基检验其产氢特性。
在含有100μg/mL氨苄的250mL的LB中培养，培养条件：37℃，200rpm，培养时间：20小时，得到富集后的大肠杆菌；
将LB培养基中的大肠杆菌按1％v/v的量接种到含有200mL产氢培养基的无菌厌氧瓶中发酵，发酵条件：①37℃，200rpm培养到OD600nm＝0.6；②加入IPTG诱导剂至浓度为1mM，37℃，静置培养。当加入IPTG后，每隔一小时从厌氧瓶抽取500uL的气体样品，使用GC7900气相色谱仪进行样本分析。分析条件，80/100目的5A分子筛，TCD检测器温度120℃，进样口温度100℃，柱温85℃，载气为氩气。产氢实验时间一共持续14小时。
在产氢实验进行14小时后，总共产生122.9mL的氢气，产氢曲线如图2所示，产氢效率为每消耗1mol的葡萄糖能产生0.32mol的氢气。实验效果显示，与不产氢的大肠杆菌BL21(DE3)比较，pETD-SL能使不产氢的大肠杆菌产生氢气，且效果良好。实验也证明，本发明所构建的产氢质粒pETD-SL能用于改良产氢细菌，使产氢效率大幅度提高。转化细菌种类仅限于通过镍铁氢酶产氢的原核微生物。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.高效产氢功能基因载体pETD-SL，其特征在于，所述基因载体为包含有沼泽红假单胞菌的[NiFe]氢酶基因中大亚基基因片段和小亚基基因片段的pETDuet-1质粒。
2.根据权利要求1所述的高效产氢功能基因载体pETD-SL，其特征在于所述沼泽红假单胞菌的菌种保藏号为CGMCC NO.9276。
3.如权利要求1或2所述的高效产氢功能基因载体pETD-SL的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计沼泽红假单胞菌中[NiFe]氢酶基因中大亚基hupL和小亚基hupS的引物，并扩增[NiFe]氢酶基因片段的大亚基hupL和小亚基hupS基因；
(2)回收[NiFe]氢酶的大亚基hupL和小亚基hupS的基因片段，进行测序验证扩增基因的完整性；
(3)根据pETDuet-1质粒上的酶切位点设计引物，PCR扩增大亚基hupL和小亚基hupS基因片段；
(4)切割回收扩增好的带有限制性酶切点的大亚基和小亚基基因片段，并用克隆载体pMD19-T分别将大、小亚基基因片段连接起来，得到含大亚基和小亚基基因片段的重组载体；
(5)将重组载体中小亚基和pETDuet-1质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应，然后用DNA连接酶将酶切后的pETDuet-1质粒片段与的酶切好的小亚基片段连接得到pETD-S质粒；
(6)将重组载体中大亚基和(5)中pETD-S质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应，然后用DNA连接酶将酶切后的pETD-S片段与的酶切好的大亚基片段连接，得到含有大、小亚基片段的pETD-SL质粒。
4.根据权利要求3所述的高效产氢功能基因载体pETD-SL的构建方法，其特征在于，还包括将pETD-SL基因扩增后测序，验证基因的完整性。
5.根据权利要求3所述的高效产氢功能基因载体pETD-SL的构建方法，其特征在于，所述大亚基酶切位点为BamH I，AscI；所述小亚基酶切位点为BgI II，Knp I。
6.高效产氢功能基因载体pETD-SL的应用，其特征在于，将权利要求1或2所述高效产氢功能基因载体pETD-SL转化到大肠杆菌中，在产氢培养基中培养此大肠杆菌生产氢气。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410647807.4A CN104498516B (zh) | 2014-11-14 | 2014-11-14 | 高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410647807.4A CN104498516B (zh) | 2014-11-14 | 2014-11-14 | 高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104498516A true CN104498516A (zh) | 2015-04-08 |
| CN104498516B CN104498516B (zh) | 2018-05-15 |
Family
ID=52939967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410647807.4A Active CN104498516B (zh) | 2014-11-14 | 2014-11-14 | 高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104498516B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249373A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-13 | 成都理工大学 | 一种直流电场刺激重组大肠杆菌提高氢气效率的方法 |
| CN114574418A (zh) * | 2022-04-08 | 2022-06-03 | 成都理工大学 | 一种重组大肠杆菌及产氢应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101041832A (zh) * | 2007-04-20 | 2007-09-26 | 重庆大学 | 一种利用沼泽红假单胞菌制氢的方法 |
-
2014
- 2014-11-14 CN CN201410647807.4A patent/CN104498516B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101041832A (zh) * | 2007-04-20 | 2007-09-26 | 重庆大学 | 一种利用沼泽红假单胞菌制氢的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| SOO YOUN LEE ET AL.: "Bacterial hydrogen production in recombinant Escherichia coli harboring a HupSL hydrogenase isolated from Rhodobacter sphaeroides under anaerobic dark culture", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF HYDROGEN ENERGY》 * |
| SYLVIE ELSEN ET AL.: "The hupTUV operon is involved in negative control of hydrogenase synthesis in Rhodobacter capsulatus.", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 * |
| 傅春蓉等: "B族维生素对沼泽红假单胞菌产氢以及降解废水的影响", 《食品与发酵工业》 * |
| 刘冰峰: "光发酵细菌的选育及其与暗发酵细菌耦合产氢研究", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249373A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-13 | 成都理工大学 | 一种直流电场刺激重组大肠杆菌提高氢气效率的方法 |
| CN114574418A (zh) * | 2022-04-08 | 2022-06-03 | 成都理工大学 | 一种重组大肠杆菌及产氢应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104498516B (zh) | 2018-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chang et al. | Molecular detection of the clostridia in an anaerobic biohydrogen fermentation system by hydrogenase mRNA-targeted reverse transcription-PCR | |
| CN110358720B (zh) | 一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用 | |
| CN110055204B (zh) | 一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用 | |
| CN105802985A (zh) | 一种快速实现地衣芽孢杆菌基因敲除的方法 | |
| CN102260699B (zh) | 极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法 | |
| CN106755044A (zh) | 高效产氢功能基因载体pET32a‑fdhF及其构建和应用 | |
| CN106967159A (zh) | iolT1和iolT2蛋白在木糖转运中的应用 | |
| Sakai et al. | Complete genome sequence of the Sulfodiicoccus acidiphilus strain HS-1 T, the first crenarchaeon that lacks polB3, isolated from an acidic hot spring in Ohwaku-dani, Hakone, Japan | |
| US20050053955A1 (en) | Nucleic acid-based assay and kit for the detection of methanogens in biological samples | |
| Kaewchana et al. | Improved high-temperature ethanol production from sweet sorghum juice using Zymomonas mobilis overexpressing groESL genes | |
| CN102660570A (zh) | 一种提高酶热稳定性的方法 | |
| Morsy et al. | Dark and photofermentation H2 production from hydrolyzed biomass of the potent extracellular polysaccharides producing cyanobacterium Nostoc commune and intracellular polysaccharide (glycogen) enriched Anabaena variabilis NIES-2095 | |
| CN104498516A (zh) | 高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用 | |
| Ramachandran et al. | Isolation and characterization of a hydrogen-and ethanol-producing Clostridium sp. strain URNW | |
| CN104726435A (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株 | |
| CN103992992A (zh) | 硫磺矿硫化叶菌中（+）γ-内酰胺酶的编码基因及应用 | |
| KR20110012170A (ko) | 로도박터 스페로이드의 하이드로게나제 또는 니트로게나제로 형질전환된 숙주세포 및 이들을 이용한 수소 생산방법 | |
| CN103966249A (zh) | 一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用 | |
| CN104403969A (zh) | 一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶及其制备方法 | |
| CN104130998B (zh) | 定点突变获得的恶臭假单胞菌腈水解酶突变株及其构建方法 | |
| CN113061563B (zh) | 一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成l-苹果酸的方法 | |
| WO2015154209A1 (zh) | 一种高产l-丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法 | |
| CN103232994A (zh) | 一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法 | |
| Xiao et al. | Archaea, the tree of life, and cellular evolution in eukaryotes | |
| Vikromvarasiri et al. | Bioethanol production from glycerol by mixed culture system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |