CN114574418A - 一种重组大肠杆菌及产氢应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌及其产氢应用，所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示的来源于莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的[FeFe]‑氢酶基因hyd1和SEQ ID NO.2所示的磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因pfkA转入大肠杆菌DNA染色体上获得的。本发明筛选的产氢重组大肠杆菌能够在胞内高效产氢，并以葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉以及甘油为底物。本发明筛选产氢的重组大肠杆菌株具有不添加IPTG等诱导剂和可克服高浓度葡萄糖干扰的优势，为绿氢制取带来的成本下降及环境友好，具备实应价值，可实现绿色能源“安全、清洁、经济、持续”规模化生产。

Description

一种重组大肠杆菌及产氢应用

技术领域

本发明涉及一种在染色体上含有[FeFe]-氢酶基因和磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因的重组大肠杆菌及其产氢的应用，属于微生物制氢技术领域。

背景技术

氢气是一种清洁能源，但传统的氢气是通过煤炭、石油等不可再生的化石能源制备的，除了会造成环境污染以外还消耗了大量的能源。以生物制氢为代表的可再生能源制“绿氢”技术被认为是属于未来的、最为理想的能源解决方案之一。生物制氢是利用生物自身的代谢作用将水、有机废物或生物基质等转化为氢气，其在生产过程中减少了能源消耗并且没有污染，是“绿氢”研究的重要方向。

实现高效、低成本的生物制氢技术开发是氢能源推广应用的关键。大肠杆菌是一种兼性厌氧菌，使用基因工程的手段提高其产氢能力，将其应用于产业化已经越来越受到人们重视。厌氧发酵生物产氢技术与其它产氢技术相比具有反应条件温和、反应器设计简单和产氢效率相对较高等的优点，因此成为当前制氢方法的研究热点。厌氧发酵产氢关键在于目的菌种具有相对较高的产氢效率，然而通过简单的菌种选育无法满足当前需求。利用基因工程手段来改造产氢代谢途径，构建高效的工程菌种已成为提高微生物产氢效率的重要研究方向。

发明内容

发明目的：提供一株在染色体上含有[FeFe]-氢酶基因和磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因重组大肠杆菌及其产氢的应用，实现高效生物制氢。

技术方案：第一方面，本发明提供一种大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将SEQ IDNO.1所示来源于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的[FeFe]-氢酶基因hyd1和SEQID NO.2所示的磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因pfkA转入大肠杆菌DNA染色体上获得的。

进一步地，所述重组大肠杆菌出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

进一步地，所述重组大肠杆菌按如下方法构建的：将SEQ ID No.1所示的[FeFe]-氢酶基因hyd1克隆到CRISPR-B质粒上，电转质粒到大肠杆菌感受态细胞中，筛选到阳性克隆后，消除质粒；再将SEQ ID No.2所示的磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因pfkA克隆到CRISPR-B质粒上，电转质粒到已经敲入hyd1基因的大肠杆菌感受态细胞中，筛选到阳性克隆后，消除质粒，得到重组大肠杆菌。

第二方面，

本发明提供一种所述重组大肠杆菌在生物制氢中的应用，具体所述的应用是将重组大肠杆菌在产氢培养基中厌氧发酵制取氢气。

进一步地，所述的产氢培养基包括以下组分及重量份含量：胰蛋白胨0.8-2.6份、酵母提取物0.5-2.0份、氯化钠0.2-1.5份和碳源1.5-5.0份。

进一步地，所述的产氢培养基中碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油等以及葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油等混合碳源。

进一步地，所述的产氢培养基中无需添加镍、钴、锰、铜、铝等微量金属离子及亚硒酸钠和硼酸。

进一步地，所述重组大肠杆菌的厌氧发酵温度为20-40℃、pH值5-7.5，无需添加IPTG等诱导剂。

附图说明

图1为[FeFe]-氢酶基因hyd1敲入的示意图；

图2为磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因pfkA敲入的示意图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中如无特殊说明所使用的方法均为常规方法，所使用试剂均可从商业途径获取。

实施例1含[FeFe]-氢酶基因和磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因的重组大肠杆菌的构建

1.抗性实验

将大肠杆菌BL21(DE3)分别划线接种在常用抗生素(如：Amp、Kana、Chl和Str)的LB固体平板，在37℃恒温培养箱中过夜培养，第二天观察是否有菌落生长，如有则判定为对该抗生素不敏感，反之则为敏感。得到对抗生素kana和Str不敏感的大肠杆菌。

2.构建CRISPR-B质粒

以莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)[FeFe]-氢酶基因hyd1为主体，用阿拉伯糖启动子(araBAD promoter)驱动hyd1基因的表达，使用两个终止子rrnB T1terminator和rrnB T2 terminator终止hyd1基因的表达。如图1中KI所示。最终敲入核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。使用PCR扩增敲入序列和大肠杆菌BL21(DE3)attTn7位点上下游的同源臂，并克隆到CRISPR-B质粒上。

以磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因pfkA为主体，使用J23119(SpeI)promoter启动子驱动pfkA基因的表达，使用两个终止子rrnB T1 terminator和rrnB T2 terminator终止pfkA基因的表达。如图2中KI所示。最终敲入核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。使用PCR扩增敲入序列和大肠杆菌BL21(DE3)attB位点上下游的同源臂，并克隆到CRISPR-B质粒上。

3.制备感受态细胞

平板划线活化经过抗性实验的大肠杆菌BL21(DE3)；挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600＝0.6；将菌液迅速置于冰上。将培养好的菌液分装至50ml离心管中，在冰上冷却10分钟；4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；弃去上清，加入10ml冰冷的10％甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；弃去上清，加入10ml冰冷的10％甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；加入250μl冰冷10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

4.电转[FeFe]-氢酶基因

将构建的含[FeFe]-氢酶基因的CRISPR-B质粒加入感受态中，混匀，冰上静置10min。将感受态细胞全部转移到1mm的电极杯中，冰上静置10min。设置电转条件为1.8kV，5ms，1pulse，开始电击。电转完成后，立刻往电极杯中加入1mL相应的培养基，重悬，将所有重悬液转移到1.5mL EP管中，并放置于摇床中复苏2h。复苏后，立刻将EP管离心，在生物安全柜内吸去部分上清，重悬剩余部分的菌液，全部用来涂板，过夜培养。

5.筛选阳性克隆菌株

从板上挑取克隆，做菌落PCR鉴定。PCR反应体系如下：

引物如下：

JD-HYD1-F:GGAATGTTAACAGCCAGCAC

JD-HYD1-R:GCTGTCTCGCCTGAAAGGTC

PCR反应程序如下：

电泳观察PCR结果，筛选出有编辑效果的阳性克隆。选择测序正确的克隆，将CRISPR-B质粒消去，获得敲入阳性克隆菌株。

6.电转磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因

将已敲入[FeFe]-氢酶基因的大肠杆菌按照步骤3制备感受态细胞，按照步骤4电转含有磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因的CRISPR-B质粒，电转条件为1.8kV，5ms，1pulse。按照步骤5筛选阳性克隆，PCR反应体系和PCR反应程序与步骤5一致，PCR引物如下：

JD-pfkA-F:TTGGCGGCAACACAGGATC

JD-pfkA-R:TTTCACCGCATCTGGCGTG

电泳观察PCR结果，筛选出有编辑效果的阳性克隆。选择测序正确的克隆，将CRISPR-B质粒消去，获得敲入阳性克隆菌株。

实施例2重组大肠杆菌产氢的应用

配置固体培养基，在含50μg/mL卡拉霉素的LB培养基中加入琼脂粉，配置成固体培养基。将解冻活化后的重组大肠杆菌接种到LB固体培养基中。37℃恒温培养箱中过夜培养。

将在LB固体培养基中长出的单菌落重组大肠杆菌接种到含50μg/mL卡拉霉素的LB培养基中，在37℃恒温培养箱中扩大培养。

将扩大培养的重组大肠杆菌接种在含50μg/mL卡拉霉素的200ml产氢培养基中，产氢培养基包含1.6份胰蛋白胨、1份酵母提取物和0.5份氯化钠，添加蔗糖2份，将产氢培养基的pH值为6.0，在37℃的恒温培养箱中培养8-48h内，产生氢气27mL。

序列表

<110> 成都理工大学

<120> 一种重组大肠杆菌及其产氢应用

<130> 2020

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcggcgc tcgtgctgaa gccctgcgcg gccgtgtcta ttcgcggcag ctcctgcagg 60

gcgcggcagg tcgccccccg cgctccgctc gcagccagca ccgtgcgtgt agcccttgca 120

acacttgagg cgcccgcacg ccgcctaggc aacgtcgctt gcgcggctgc cgcacccgct 180

gcggaggcgc ctttgagtca tgtccagcag gcgctcgccg agcttgccaa gcccaaggac 240

gaccccacgc gcaagcacgt ctgcgtgcag gtggctccgg ccgttcgtgt cgctattgcc 300

gagaccctgg gcctggcgcc gggcgccacc acccccaagc agctggccga gggcctccgc 360

cgcctcggct ttgacgaggt gtttgacacg ctgtttggcg ccgacctgac catcatggag 420

gagggcagcg agctgctgca ccgcctcacc gagcacctgg aggcccaccc gcactccgac 480

gagccgctgc ccatgttcac cagctgctgc cccggctgga tcgctatgct ggagaaatct 540

tacccggacc tgatccccta cgtgagcagc tgcaagagcc cccagatgat gctggcggcc 600

atggtcaagt cctacctagc ggaaaagaag ggcatcgcgc caaaggacat ggtcatggtg 660

tccatcatgc cctgcacgcg caagcagtcg gaggctgacc gcgactggtt ctgtgtggac 720

gccgacccca ccctgcgcca gctggaccac gtcatcacca ccgtggagct gggcaacatc 780

ttcaaggagc gcggcatcaa cctggccgag ctgcccgagg gcgagtggga caatccaatg 840

ggcgtgggct cgggcgccgg cgtgctgttc ggcaccaccg gcggtgtcat ggaggcggcg 900

ctgcgcacgg cctatgagct gttcacgggc acgccgctgc cgcgcctgag cctgagcgag 960

gtgcgcggca tggacggcat caaggagacc aacatcacca tggtgcccgc gcccgggtcc 1020

aagtttgagg agctgctgaa gcaccgcgcc gccgcgcgcg ccgaggccgc cgcgcacggc 1080

acccccgggc cgctggcctg ggacggcggc gcgggcttca ccagcgagga cggcaggggc 1140

ggcatcacac tgcgcgtggc cgtggccaac gggctgggca acgccaagaa gctgatcacc 1200

aagatgcagg ccggcgaggc caagtacgac tttgtggaga tcatggcctg ccccgcgggc 1260

tgtgtgggcg gcggcggcca gccccgctcc accgacaagg ccatcacgca gaagcggcag 1320

gcggcgctgt acaacctgga cgagaagtcc acgctgcgcc gcagccacga gaacccgtcc 1380

atccgcgagc tgtacgacac gtacctcgga gagccgctgg gccacaaggc gcacgagctg 1440

ctgcacaccc actacgtggc cggcggcgtg gaggagaagg acgagaagaa gtga 1494

<210> 2

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgattaaga aaatcggtgt gttgacaagc ggcggtgatg cgccaggcat gaacgccgca 60

attcgcgggg ttgttcgttc tgcgctgaca gaaggtctgg aagtaatggg tatttatgac 120

ggctatctgg gtctgtatga agaccgtatg gtacagctag accgttacag cgtttctgac 180

atgatcaacc gtggcggtac gttcctcggt tctgcgcgtt tcccggaatt ccgcgacgag 240

aacatccgcg ccgtggctat cgaaaacctg aaaaaacgtg gtatcgacgc gctggtggtt 300

atcggcggtg acggttccta catgggtgca atgcgtctga ccgaaatggg cttcccgtgc 360

atcggcctgc cgggcactat cgacaacgac atcaaaggca ctgactacac tatcggtttc 420

ttcactgcgc tgagcaccgt tgtagaagcg atcgaccgtc tgcgtgacac ctcttcttct 480

caccagcgta tttccgtggt ggaagtgatg ggccgttatt gtggcgatct gacgttggct 540

gcggccattg ccggtggctg tgaattcgtt gtggttccgg aagttgaatt cagccgtgaa 600

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atcgaaaaca tgaagcgtcc gttcaaaggc gactggctag actgcgcgaa aaaactgtat 960

taa 963

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是将来源于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的[FeFe]-氢酶基因hyd1和磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因pfkA转入大肠杆菌DNA染色体上获得的。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述来源于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的[FeFe]-氢酶基因hyd1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因pfkA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌按以下方法构建：将SEQ ID No.1所示的[FeFe]-氢酶基因hyd1克隆到CRISPR-B质粒上，电转质粒到大肠杆菌感受态细胞中，筛选到阳性克隆后，消除质粒；再将SEQ ID No.2所示的磷酸果糖激酶同工酶Ⅰ基因pfkA克隆到CRISPR-B质粒上，电转质粒到已经敲入hyd1基因的大肠杆菌感受态细胞中，筛选到阳性克隆后，消除质粒，得到重组大肠杆菌。

5.一种权利要求1所述重组大肠杆菌在生物制氢中的应用。

6.根据权利要求6所述重组大肠杆菌在生物制氢中的应用，其特征在于，所述的应用是将重组大肠杆菌在产氢培养基中厌氧发酵制取氢气。

7.根据权利要求7所述生物制氢的应用，其特征在于，所述的产氢培养基包括以下组分及重量份含量：胰蛋白胨0.8-2.6份、酵母提取物0.5-2.0份、氯化钠0.2-1.5份和碳源1.5-5.0份。

8.根据权利要求7所述生物制氢的应用，其特征在于，所述的产氢培养基中碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油等以及葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油等混合碳源。

9.根据权利要求7所述生物制氢的应用，其特征在于，所述的产氢培养基中无需添加镍、钴、锰、铜、铝等微量金属离子及亚硒酸钠和硼酸。

10.根据权利要求7所述生物制氢的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌的厌氧发酵温度为20-40℃、pH值5-7.5，无需添加IPTG等诱导剂。

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