CN105296411A - 一株利用单糖发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，敲除保藏号为CGMCC？NO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在aceBA基因的位置处插入L-天冬氨酸酶基因，得到大肠杆菌AS12；将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌AS13。本发明实现了完全采用可再生生物质资源(如葡萄糖、木糖等)为原料发酵制备L-天冬氨酸的路线，该路线绿色、环保。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株利用葡萄糖或木糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
L-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门冬氨酸；尤其在食品工业方面，L-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生产原料。具有良好的市场前景。
目前L-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成，而目前富马酸主要采用化学法制备，因此从全周期分析，天冬氨酸的制备仍然依赖化石资源。葡萄糖、木糖等单糖可来源于可再生的生物质资源，其产量丰富，筛选或构建获得一株能够直接利用单糖发酵制备L-天冬氨酸的生产菌株具有重要的意义，目前尚未有相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一株利用葡萄糖或木糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，敲除保藏号为CGMCCNO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在aceBA基因的位置处插入L-天冬氨酸酶基因，得到大肠杆菌AS12，所述苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA的GenBank登记号为EU889415.1；
将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌AS13。所述的大肠杆菌CGMCCNO：2301为一株高产富马酸的基因工程菌，该菌株的具体信息在申请号为200810019216.7的专利中已经公开。
其中，所述L-天冬氨酸酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，L-天冬氨酸酶基因的GenBank登记号为X03629.1。
其中，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的EcoGene登记号为EG10742。
其中，所述的表达质粒为pTrc99a。
上述利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的核苷酸序列为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到线性片段1；
以SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的核苷酸序列为引物，SEQIDNO：1所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段2；
以SEQIDNO：3和SEQIDNO：6所示的核苷酸序列为引物，线性片段1和线性片段2为模板扩增得到基因敲除片段；
(2)将pKD46质粒转化CGMCCNO：2301菌株，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态；
(3)将步骤(1)中基因敲除片段转化步骤(2)得到的感受态中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子；
(4)将pCP20转化到步骤(3)得到的阳性重组子中，42℃热激使其表达FLP重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为大肠杆菌AS12；
(5)将SEQIDNO：2所示pncB基因的核苷酸序列克隆至pTrc99a质粒的NcoI和HindIII酶切位点处，得到pTrc99a-pncB重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌大肠杆菌AS13。
上述利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌在发酵制备L-天冬氨酸中的应用在本发明的保护范围之内。
其中，种子液培养过程如下：
(S1)按体积分数为1～2％从冻存管转接到LB培养基中，有氧培养10～12h；
(S2)按体积分数为1～2％转接到种子发酵罐的LB培养基中；
(S3)待菌体OD600至2.5～4时，按体积比为5～10％接种发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：JSP培养基，烟酸0.1mM；柠檬酸3.0g/L；Na2HPO4·7H2O3.00g/L；KH2PO48.00g/L；(NH4)2HPO420.00g/L；NH4Cl10g/L；(NH4)2SO45g/L；MgSO4·7H2O1.00g/L；CaCl2·2H2O10.0mg/L；ZnSO4·7H2O0.5mg/L；CuCl2·2H2O0.25mg/L；MnSO4·H2O2.5mg/L；CoCl2·6H2O1.75mg/L；H3BO30.12mg/L；Al2(SO4)3·xH2O1.77mg/L；Na2MoO4·2H2O0.5mg/L；Fe(III)citrate16.1mg/L，溶剂为水，灭菌后用氨水调节pH为8.0，其中葡萄糖单独灭菌后分为3次加入。
步骤(S1)和(S2)中，培养温度为35～37℃。
步骤(S3)中，采用两阶段发酵模式，当菌体OD600为20以下时，通氧气进行有氧发酵，溶解氧为5～40％；当菌体OD600至20以上时改通二氧化碳气体进行厌氧发酵。
其中，两阶段发酵过程中温度为30～32℃，培养过程pH用氨水调节为7.8～8.1。
有益效果：
本发明创新性地替代了原有L-天冬氨酸采用酶转化的方法，彻底摆脱了依赖于石油基富马酸的问题，实现了完全采用可再生生物质资源(如葡萄糖、木糖等)为原料发酵制备L-天冬氨酸的路线，该路线绿色、环保。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
本实施例说明利用重叠PCR技术和同源重组技术敲除亲本大肠杆菌JM125中aceBA基因(SEQIDNO：2)的同时插入L-天冬氨酸酶基因(SEQIDNO：1)的过程。
(1)利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌JM125至OD600＝0.4～0.6，制备成电转感受态；
(2)将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌CGMCCNO：2301。电击条件为：200Ω，25μF，电击电压2.3kv，电击时间4～5ms。电击后迅速将菌体加入预冷1mL的SOC培养基，150r/min、30℃培养1h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子CGMCCNO：2301(pKD46)；
(3)在LB培养基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态；
(4)以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因(pIJ773)和L-天冬氨酸酶基因的(GenBank：X03629.1)为模板设计引物F1，R1和F2，R2，具体序列为：
F1(SEQIDNO：3)：
CCTTCGTTCACAGTGGGGAAGTTTTCGGATCCATGACGAGGAGCTGCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAG
R1(SEQIDNO：4)：ATTCCGGGGATCCGTCGACTACAAACTCTTGTAATGGCGGCG
F2(SEQIDNO：5)：TAAGGCCCCTAGGCAGCTGATGTTTGAGAACATTACCGCCGC
R2(SEQIDNO：6)：
TGCGGCGTGAACGCCTTATCCGGCCTACAGTCAGCAACGGTTGTTGTTGCCGGGCTTCATTGTTTTTAATGCTTACAGCA
(5)以F1，R1和F2，R2分别扩增出安普霉素抗性基因(线性片段1)和L-天冬氨酸酶基因(线性片段2)，再以F1和R2为引物扩增出两端带有aceBA基因同源臂的DNA敲除片段；
(6)电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌CGMCCNO：2301(pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了PCR鉴定；
(7)阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌落即为已经敲除抗性的菌株，命名为AS12。
实施例2
本实施例说明构建超量表达烟酸转磷酸核糖激酶的表达质粒，提高菌株在厌氧条件下辅酶NAD+的消耗与再生速率，维持辅因子的平衡，得到菌株AS13的过程。
1、构建超量表达烟酸转磷酸核糖激酶的表达质粒，其过程包括：
(1)合成带有NcoI和HindIII酶切位点的引物，
上游引物(SEQIDNO：7)：5’-CGCCATGGATGACACAATTCGCTTCTCCTG-3’
下游引物(SEQIDNO：8)：5’-CCCAAGCTTCACTTGTCCACCCGTAAATGG-3’
(2)以大肠杆菌K12为模板，菌落PCR，反应条件为95℃，45秒，54℃，45秒，72℃，1.2分钟，共30个循环。纯化扩增出的pncB基因后，表达质粒pTrc99a分别用NcoI和HindIII双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB。
2、将质粒pTrc99a-pncB导入实施例1中消除安普霉素抗性菌株的AS12感受态。获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株AS13。
实施例3
本实施例说明新构建的重组大肠杆菌AS12，AS13与出发菌株CGMCCNO：2301发酵产天冬氨酸能力的对比。
1、采用LB培养基按1～2％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养10～12h，进一步按1～2％(v/v)接种量接种至种子发酵罐(培养基也为LB)，培养4～6h后待菌体OD600至2.5～4之间，按5～10％接种发酵培养基(JSP培养基，葡萄糖为碳源分批补加)；
2、种子培养过程温度控制在35～37℃，培养中不需调节pH，溶氧控制在5～40％。发酵过程采用两阶段发酵模式，当菌体OD600至20左右时改通二氧化碳气体进行厌氧发酵，发酵过程温度控制在30～32℃，培养过程pH用氨水控制在7.8～8.1。
三个菌株的厌氧发酵48h后的结果见表1。
表1出发菌株及两株重组菌发酵产酸情况
Claims (10)
1.一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，敲除保藏号为CGMCCNO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在aceBA基因的位置处插入L-天冬氨酸酶基因，得到大肠杆菌AS12；
将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌AS13。
2.根据权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述L-天冬氨酸酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
3.根据权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
4.根据权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述的表达质粒为pTrc99a。
5.权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的核苷酸序列为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到线性片段1；
以SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的核苷酸序列为引物，SEQIDNO：1所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段2；
以SEQIDNO：3和SEQIDNO：6所示的核苷酸序列为引物，线性片段1和线性片段2为模板扩增得到基因敲除片段；
(2)将pKD46质粒转化CGMCCNO：2301菌株，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态；
(3)将步骤(1)中基因敲除片段转化步骤(2)得到的感受态中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子；
(4)将pCP20转化到步骤(3)得到的阳性重组子中，42℃热激使其表达FLP重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为大肠杆菌AS12；
(5)将SEQIDNO：2所示pncB基因的核苷酸序列克隆至pTrc99a质粒的NcoI和HindIII酶切位点处，得到pTrc99a-pncB重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌大肠杆菌AS13。
6.权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌在发酵制备L-天冬氨酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，种子液培养过程如下：
(S1)按体积分数为1～2％从冻存管转接到LB培养基中，有氧培养10～12h；
(S2)按体积分数为1～2％转接到种子发酵罐的LB培养基中；
(S3)待菌体OD600至2.5～4时，按体积比为5～10％接种发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：JSP培养基，烟酸0.1mM；柠檬酸3.0g/L；Na2HPO4·7H2O3.00g/L；KH2PO48.00g/L；(NH4)2HPO420.00g/L；NH4Cl10g/L；(NH4)2SO45g/L；MgSO4·7H2O1.00g/L；CaCl2·2H2O10.0mg/L；ZnSO4·7H2O0.5mg/L；CuCl2·2H2O0.25mg/L；MnSO4·H2O2.5mg/L；CoCl2·6H2O1.75mg/L；H3BO30.12mg/L；Al2(SO4)3·xH2O1.77mg/L；Na2MoO4·2H2O0.5mg/L；Fe(III)citrate16.1mg/L，溶剂为水，灭菌后用氨水调节pH为8.0，其中葡萄糖单独灭菌后分为3次加入。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，种子液培养过程中，步骤(S1)和(S2)中，培养温度为35～37℃。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(S3)中采用两阶段发酵模式，当菌体OD600为20以下时，通氧气进行有氧发酵，溶解氧为5～40％；当菌体OD600至20以上时改通二氧化碳气体进行厌氧发酵。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，两阶段发酵过程中温度为30～32℃，培养过程pH用氨水调节为7.8～8.1。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434510A (zh) * | 2016-10-26 | 2017-02-22 | 常茂生物化学工程股份有限公司 | 一株发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌 |
| CN106755038A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-31 | 合肥工业大学 | 一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达应用 |
| CN106834128A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-06-13 | 南京工业大学 | 一株利用葡萄糖发酵产β‑丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN107022515A (zh) * | 2017-05-19 | 2017-08-08 | 南京工业大学 | 一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN109337941A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-02-15 | 宿州学院 | 一种l-天冬氨酸的质控生产方法及其应用 |
| CN109370971A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-02-22 | 南京工业大学 | 一株发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
| CN115247144A (zh) * | 2021-04-27 | 2022-10-28 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 生产l-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994028154A1 (en) * | 1993-05-27 | 1994-12-08 | The Nutrasweet Company | Methods for increasing carbon conversion efficiency in microorganisms |
| WO2005103275A1 (ja) * | 2004-04-26 | 2005-11-03 | Ajinomoto Co., Ltd. | 発酵法によるｌ－トリプトファンの製造法 |
| CN101240259A (zh) * | 2008-01-16 | 2008-08-13 | 南京工业大学 | 新构建的高产富马酸基因工程菌及其生产富马酸的方法 |
| EP2275529A2 (en) * | 2005-08-11 | 2011-01-19 | Metabolic Explorer | Process for the preparation of aspartate and derived amino acids employing a microorganism with enhanced glyoxylate shunt |
| CN102016053A (zh) * | 2008-02-15 | 2011-04-13 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 生产二羧酸的方法 |
| CN102618570A (zh) * | 2012-03-20 | 2012-08-01 | 南京工业大学 | 构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法 |
-
2015
- 2015-11-24 CN CN201510822797.8A patent/CN105296411B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994028154A1 (en) * | 1993-05-27 | 1994-12-08 | The Nutrasweet Company | Methods for increasing carbon conversion efficiency in microorganisms |
| WO2005103275A1 (ja) * | 2004-04-26 | 2005-11-03 | Ajinomoto Co., Ltd. | 発酵法によるｌ－トリプトファンの製造法 |
| EP2275529A2 (en) * | 2005-08-11 | 2011-01-19 | Metabolic Explorer | Process for the preparation of aspartate and derived amino acids employing a microorganism with enhanced glyoxylate shunt |
| CN101240259A (zh) * | 2008-01-16 | 2008-08-13 | 南京工业大学 | 新构建的高产富马酸基因工程菌及其生产富马酸的方法 |
| CN102016053A (zh) * | 2008-02-15 | 2011-04-13 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 生产二羧酸的方法 |
| CN102618570A (zh) * | 2012-03-20 | 2012-08-01 | 南京工业大学 | 构建产富马酸大肠杆菌基因工程菌的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FOTHERINGHAM,I.G. ET AL.: "E.coli aspC gene for aspartate aminotransferase", 《GENBANK》 * |
| 刘嵘明等: "过量表达烟酸转磷酸核糖激酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响", 《生物工程学报》 * |
| 周长林: "《微生物学》", 31 August 2015, 中国医药科技出版社 * |
| 盛晓燕等: "利用富马酸发酵废液培养L-天冬氨酸转化菌策略的研究", 《食品科技》 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434510A (zh) * | 2016-10-26 | 2017-02-22 | 常茂生物化学工程股份有限公司 | 一株发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌 |
| CN106434510B (zh) * | 2016-10-26 | 2019-05-21 | 常茂生物化学工程股份有限公司 | 一株发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌 |
| CN106755038A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-31 | 合肥工业大学 | 一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达应用 |
| CN106755038B (zh) * | 2016-12-12 | 2019-12-27 | 合肥工业大学 | 一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法及其表达应用 |
| CN106834128A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-06-13 | 南京工业大学 | 一株利用葡萄糖发酵产β‑丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN107022515A (zh) * | 2017-05-19 | 2017-08-08 | 南京工业大学 | 一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN107022515B (zh) * | 2017-05-19 | 2020-11-06 | 南京工业大学 | 一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN109337941A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-02-15 | 宿州学院 | 一种l-天冬氨酸的质控生产方法及其应用 |
| CN109370971A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-02-22 | 南京工业大学 | 一株发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
| CN115247144A (zh) * | 2021-04-27 | 2022-10-28 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 生产l-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用 |
| CN115247144B (zh) * | 2021-04-27 | 2023-07-11 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 生产l-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用 |
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