CN105296411B

CN105296411B - 一株利用单糖发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN105296411B
Application number: CN201510822797.8A
Authority: CN
Inventors: 马江锋; 陈娟; 陈可泉; 姜岷; 吴昊
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2015-11-24
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: CN105296411A

Abstract

本发明公开了一株利用单糖发酵产L‑天冬氨酸的基因工程菌，敲除保藏号为CGMCC NO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在aceBA基因的位置处插入L‑天冬氨酸转氨酶基因，得到大肠杆菌AS12；将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L‑天冬氨酸的基因工程菌AS13。本发明实现了完全采用可再生生物质资源（如葡萄糖、木糖等）为原料发酵制备L‑天冬氨酸的路线，该路线绿色、环保。

Description

一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株利用葡萄糖或木糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门冬氨酸；尤其在食品工业方面，L-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生产原料。具有良好的市场前景。

目前L-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成，而目前富马酸主要采用化学法制备，因此从全周期分析，天冬氨酸的制备仍然依赖化石资源。葡萄糖、木糖等单糖可来源于可再生的生物质资源，其产量丰富，筛选或构建获得一株能够直接利用单糖发酵制备L-天冬氨酸的生产菌株具有重要的意义，目前尚未有相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株利用葡萄糖或木糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，敲除保藏号为CGMCC NO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在aceBA基因的位置处插入L-天冬氨酸转氨酶基因，得到大肠杆菌AS12，所述苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA的GenBank登记号为EU889415.1；

将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌AS13。所述的大肠杆菌CGMCC NO：2301为一株高产富马酸的基因工程菌，该菌株的具体信息在申请号为200810019216.7的专利中已经公开。

其中，所述L-天冬氨酸转氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，L-天冬氨酸转氨酶基因的GenBank登记号为X03629.1。

其中，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的EcoGene登记号为EG10742。

其中，所述的表达质粒为pTrc99a。

上述利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到线性片段1；

以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列为引物，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段2；

以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列为引物，线性片段1和线性片段2为模板扩增得到基因敲除片段；

(2)将pKD46质粒转化CGMCC NO：2301菌株，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态；

(3)将步骤(1)中基因敲除片段转化步骤(2)得到的感受态中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子；

(4)将pCP20转化到步骤(3)得到的阳性重组子中，42℃热激使其表达FLP重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为大肠杆菌AS12；

(5)将SEQ ID NO：2所示pncB基因的核苷酸序列克隆至pTrc99a质粒的Nco I和Hind III酶切位点处，得到pTrc99a-pncB重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌大肠杆菌AS13。

上述利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌在发酵制备L-天冬氨酸中的应用在本发明的保护范围之内。

其中，菌种培养过程如下：

(S1)按体积分数为1～2％从冻存管转接到LB培养基中，有氧培养10～12h；

(S2)按体积分数为1～2％转接到种子发酵罐的LB培养基中；

(S3)待菌体OD₆₀₀至2.5～4时，按体积比为5～10％接种发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：JSP培养基，烟酸0.1mM；柠檬酸3.0g/L；Na₂HPO₄·7H₂O 3.00g/L；KH₂PO₄ 8.00g/L；(NH₄)₂HPO₄ 20.00g/L；NH₄Cl 10g/L；(NH₄)₂SO₄ 5g/L；MgSO₄·7H₂O 1.00g/L；CaCl₂·2H₂O10.0mg/L；ZnSO₄·7H₂O 0.5mg/L；CuCl₂·2H₂O 0.25mg/L；MnSO₄·H₂O 2.5mg/L；CoCl₂·6H₂O1.75mg/L；H₃BO₃ 0.12mg/L；Al₂(SO₄)₃·xH₂O 1.77mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/L；柠檬酸铁16.1mg/L，溶剂为水，灭菌后用氨水调节pH为8.0，其中葡萄糖单独灭菌后分为3次加入。

步骤(S1)和(S2)中，培养温度为35～37℃。

步骤(S3)中，采用两阶段发酵模式，当菌体OD₆₀₀为20以下时，通氧气进行有氧发酵，溶解氧为5～40％；当菌体OD₆₀₀至20以上时改通二氧化碳气体进行厌氧发酵。

其中，两阶段发酵过程中温度为30～32℃，培养过程pH用氨水调节为7.8～8.1。

有益效果：

本发明创新性地替代了原有L-天冬氨酸采用酶转化的方法，彻底摆脱了依赖于石油基富马酸的问题，实现了完全采用可再生生物质资源(如葡萄糖、木糖等)为原料发酵制备L-天冬氨酸的路线，该路线绿色、环保。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

本实施例说明利用重叠PCR技术和同源重组技术敲除亲本大肠杆菌JM125中aceBA基因(SEQ ID NO：2)的同时插入L-天冬氨酸转氨酶基因(SEQ ID NO：1)的过程。

(1)利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌JM125至OD₆₀₀＝0.4～0.6，制备成电转感受态；

(2)将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌CGMCC NO：2301。电击条件为：200Ω，25μF，电击电压2.3kv，电击时间4～5ms。电击后迅速将菌体加入预冷1mL的SOC培养基，150r/min、30℃培养1h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子CGMCCNO：2301(pKD46)；

(3)在LB培养基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态；

(4)以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因(pIJ773)和L-天冬氨酸转氨酶基因的(GenBank：X03629.1)为模板设计引物F1，R1和F2，R2，具体序列为：

F1(SEQ ID NO：3)：

CCTTCGTTCACAGTGGGGAAGTTTTCGGATCCATGACGAGGAGCTGCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAG

R1(SEQ ID NO：4)：ATTCCGGGGATCCGTCGACTACAAACTCTTGTAATGGCGGCG

F2(SEQ ID NO：5)：TAAGGCCCCTAGGCAGCTGATGTTTGAGAACATTACCGCCGC

R2(SEQ ID NO：6)：

TGCGGCGTGAACGCCTTATCCGGCCTACAGTCAGCAACGGTTGTTGTTGCCGGGCTTCATTGTTTTTAATGCTTACAGCA

(5)以F1，R1和F2，R2分别扩增出安普霉素抗性基因(线性片段1)和L-天冬氨酸转氨酶基因(线性片段2)，再以F1和R2为引物扩增出两端带有aceBA基因同源臂的DNA敲除片段；

(6)电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌CGMCC NO：2301(pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了PCR鉴定；

(7)阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌落即为已经敲除抗性的菌株，命名为AS12。

实施例2

本实施例说明构建超量表达烟酸转磷酸核糖激酶的表达质粒，提高菌株在厌氧条件下辅酶NAD⁺的消耗与再生速率，维持辅因子的平衡，得到菌株AS13的过程。

1、构建超量表达烟酸转磷酸核糖激酶的表达质粒，其过程包括：

(1)合成带有Nco I和Hind III酶切位点的引物，

上游引物(SEQ ID NO：7)：5’-CGCCATGGATGACACAATTCGCTTCTCCTG-3’

下游引物(SEQ ID NO：8)：5’-CCCAAGCTTCACTTGTCCACCCGTAAATGG-3’

(2)以大肠杆菌K12为模板，菌落PCR，反应条件为95℃，45秒，54℃，45秒，72℃，1.2分钟，共30个循环。纯化扩增出的pncB基因后，表达质粒pTrc99a分别用Nco I和Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB。

2、将质粒pTrc99a-pncB导入实施例1中消除安普霉素抗性菌株的AS12感受态。获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株AS13。

实施例3

本实施例说明新构建的重组大肠杆菌AS12，AS13与出发菌株CGMCC NO：2301发酵产天冬氨酸能力的对比。

1、采用LB培养基按1～2％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养10～12h，进一步按1～2％(v/v)接种量接种至种子发酵罐(培养基也为LB)，培养4～6h后待菌体OD₆₀₀至2.5～4之间，按5～10％接种发酵培养基(JSP培养基，葡萄糖为碳源分批补加)；

2、种子培养过程温度控制在35～37℃，培养中不需调节pH，溶氧控制在5～40％。发酵过程采用两阶段发酵模式，当菌体OD₆₀₀至20左右时改通二氧化碳气体进行厌氧发酵，发酵过程温度控制在30～32℃，培养过程pH用氨水控制在7.8～8.1。

三个菌株的厌氧发酵48h后的结果见表1。

表1出发菌株及两株重组菌发酵产酸情况

序列表

<120> 一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1191

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60

cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg 120

ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180

accaccaaaa attacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240

ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300

ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360

aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420

ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480

gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540

tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600

tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660

ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt 720

gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780

gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840

gctaactact ctaacccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900

gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960

atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020

atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080

ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140

acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191

<210> 2

<211> 1203

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

atgacacaat tcgcttctcc tgttctgcac tcgttgctgg atacagatgc ttataagttg 60

catatgcagc aagccgtgtt tcatcactat tacgatgtgc atgtcgcggc ggagtttcgt 120

tgccgaggtg acgatctgct gggtatttat gccgatgcta ttcgtgaaca ggttcaggcg 180

atgcagcacc tgcgcctgca ggatgatgaa tatcagtggc tttctgccct gcctttcttt 240

aaggccgact atcttaactg gttacgcgag ttccgcttta acccggaaca agtcaccgtg 300

tccaacgata atggcaagct ggatattcgt ttaagcggcc cgtggcgtga agtcatcctc 360

tgggaagttc ctttgctggc ggttatcagt gaaatggtac atcgctatcg ctcaccgcag 420

gccgacgttg cgcaagccct cgacacgctg gaaagcaaat tagtcgactt ctcggcgtta 480

accgccggtc ttgatatgtc gcgcttccat ctgatggatt ttggcacccg tcgccgtttt 540

tctcgcgaag tacaagaaac catcgttaag cgtctgcaac aggaatcctg gtttgtgggc 600

accagcaact acgatctggc gcgtcggctt tccctcacgc cgatgggaac acaggcacac 660

gaatggttcc aggcacatca gcaaatcagc ccggatctag ccaacagcca gcgagctgca 720

cttgctgcct ggctggaaga gtatcccgac caacttggca ttgcattaac cgactgcatc 780

actatggatg ctttcctgcg tgatttcggt gtcgagttcg ctagtcggta tcagggcctg 840

cgtcatgact ctggcgaccc ggttgaatgg ggtgaaaaag ccattgcaca ttatgaaaag 900

ctgggaattg atccacagag taaaacgctg gttttctctg acaatctgga tttacgcaaa 960

gcggttgagc tataccgcca cttctcttcc cgcgtgcaat taagttttgg tattgggact 1020

cgcctgacct gcgatatccc ccaggtaaaa cccctgaata ttgtcattaa gttggtagag 1080

tgtaacggta aaccggtggc gaaactttct gacagccctg gcaaaactat ctgccatgat 1140

aaagcgtttg ttcgggcgct gcgcaaagcg ttcgaccttc cgcatattaa aaaagccagt 1200

taa 1203

<210> 3

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccttcgttca cagtggggaa gttttcggat ccatgacgag gagctgcacg tgtaggctgg 60

agctgcttcg aag 73

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attccgggga tccgtcgact acaaactctt gtaatggcgg cg 42

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taaggcccct aggcagctga tgtttgagaa cattaccgcc gc 42

<210> 6

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcggcgtga acgccttatc cggcctacag tcagcaacgg ttgttgttgc cgggcttcat 60

tgtttttaat gcttacagca 80

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgccatggat gacacaattc gcttctcctg 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccaagcttc acttgtccac ccgtaaatgg 30

Claims

1.一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，敲除保藏号为CGMCCNO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在aceBA基因的位置处插入L-天冬氨酸转氨酶基因，得到大肠杆菌AS12；

将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌AS13。

2.根据权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述L-天冬氨酸转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述的表达质粒为pTrc99a。

5.权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到线性片段1；

(2) 将pKD46质粒转化CGMCC NO：2301菌株，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态；

(3) 将步骤(1)中基因敲除片段转化步骤(2)得到的感受态中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子；

(4) 将pCP20转化到步骤(3)得到的阳性重组子中，42℃热激使其表达FLP重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为大肠杆菌AS12；

(5) 将SEQ ID NO：2所示pncB基因的核苷酸序列克隆至pTrc99a质粒的Nco I和HindIII酶切位点处，得到pTrc99a-pncB重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌大肠杆菌AS13。

6.权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌在发酵制备L-天冬氨酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，菌种培养过程如下：

(S1) 按体积分数为1~2%从冻存管转接到LB培养基中，有氧培养10～12h；

(S2) 按体积分数为1~2%转接到种子发酵罐的LB培养基中；

(S3) 待菌体OD₆₀₀至2.5~4时，按体积比为5~10%接种发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：JSP培养基，烟酸0.1mM；柠檬酸 3.0 g/L；Na₂HPO₄∙7H₂O 3.00 g/L；KH₂PO₄ 8.00 g/L；(NH₄)₂HPO₄ 20.00 g/L；NH₄Cl 10 g/L；(NH₄)₂SO₄ 5 g/L；MgSO₄∙7H₂O 1.00 g/L；CaCl₂∙2H₂O10.0 mg/L；ZnSO₄∙7H₂O 0.5 mg/L；CuCl₂∙2H₂O 0.25 mg/L；MnSO₄∙H₂O 2.5 mg/L；CoCl₂∙6H₂O1.75 mg/L；H₃BO₃ 0.12 mg/L；Al₂(SO₄ )₃∙xH₂O 1.77 mg/L；Na₂MoO₄∙2H₂O 0.5 mg/L；柠檬酸铁 16.1 mg/L，溶剂为水，灭菌后用氨水调节pH为8.0，其中葡萄糖单独灭菌后分为3次加入。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，种子液培养过程中，步骤(S1)和(S2)中，培养温度为35~37℃。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(S3)中采用两阶段发酵模式，当菌体OD₆₀₀为20以下时，通氧气进行有氧发酵，溶解氧为5~40%；当菌体OD₆₀₀至20以上时改通二氧化碳气体进行厌氧发酵。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，两阶段发酵过程中温度为30~32℃，培养过程pH用氨水调节为7.8～8.1。