CN103382464A - 来源于超嗜热古菌的酰胺酶及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种来源于超嗜热古菌的酰胺酶及其编码基因与应用，所述酰胺酶为如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有酰胺酶活性的由（a）衍生的蛋白质。所述编码基因为编码所述蛋白质的核酸序列。所述酰胺酶的应用为分别以乙酰胺、丙烯酰胺、L-谷氨酰胺、己酰胺和L-天冬酰胺为底物，进行转化反应相应制备得到乙酸、丙烯酸、L-谷氨酸、己酸和L-天冬氨酸。所述编码基因在制备重组酰胺酶中的应用。本发明提供的酰胺酶能高效转化脂肪族酰胺类物质，具有工业化生产潜力和经济价值。

Description

来源于超嗜热古菌的酰胺酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种酰胺酶及其编码基因与应用，具体涉及一种来源于超嗜热古菌的酰胺酶及其编码基因与应用。
背景技术
腈类化合物是一类含腈基功能团的化学物质(R-CN)，是一种重要的化工和化纤工业合成原料。传统的化学水解方法需要在较为苛刻的条件（强酸、强碱）下完成，并且会伴随大量杂质产生，给后续的分离纯化带来困难，增加了成本。而酶法水解具有高效性、高选择性、环境污染小、成本低等优点，有着传统的化学水解方法无可比拟的优越性。腈类化合物酶促水解有两条途径：一是通过腈水解酶(nitrilase,EC3.5.5.1)使用两个水分子将腈化物直接转化成羧酸；二是先通过腈水合酶(nitrile hydratase,EC4.2.1.84,NHase)使用一分子的水将腈化物转化成酰胺,再通过酰胺酶(amidase，EC3.5.1.4)将酰胺转化成羧酸，并释放出氨气。由腈化合物出发可以获得酰胺、羧酸、酯、羰基以及杂环化等价值更高、应用范围更广的一类化合物，它们被广泛的应用于化工原料、医药中间体、维生素的前体。因此，多年以来一直受国内外研究者的广泛关注。其中酰胺酶（EC3.5.1.4）是腈化合物转化酶家族的重要成员，能催化酰胺生成羧酸并释放氨气。
酰胺酶根据氨基酸序列特征又可以分成属于腈水解酶家族（nitrilase superfamily）的酰胺酶和指纹特征性酰胺酶（amidase signature family(AS酰胺酶)）。AS家族酰胺酶都具有一段大约130个氨基酸组成的指纹序列，同时还具有一段高度保守的motif：GGSS。这类酶一般都具有较广的底物作用范围并表现出立体选择性。R.rhodochrousJ1、Rhodococcus sp.R312、Sulfolobus solfataricus、Geobacillus pallidus RAPc8等菌株中酰胺酶均属于AS家族。腈水解酶家族酰胺酶是由活性中心为Glu-Cys-Lys构成的同源二聚体、四聚体或者六聚体。腈水解酶家族可以被划分为13个分支，其中已经可以预知底物特异性的分支有9个，尽管这9个分支的酶在结构上都与腈水解酶相似，但是只有第1支具有腈水解酶活力，其余8支则分别具有酰胺酶活力或者氨基转移酶活力。Nesterenkonia、Thermococcus、Pyrococcus等菌株中含有这类家族的酰胺酶成员。
在生物体内，酰胺酶参与细胞内氮的代谢，维持生命活动；在体外，这些产物广泛应用于医药、农药和化工产品等领域。此外，酰胺酶的立体选择性使得该酶在制备手性中间体以及光学纯的氨基酸中具有巨大的潜力而备受工业界的重视。由于多数情况下，酰胺酶催化不同的底物进行手性拆分反应时的立体选择性相差很大，随着目前对医药、化工产品的高效开发，对高光学纯手性化合物的需求越来越大，这就对酰胺酶的立体选择性提出了更高的要求。
目前酰胺酶在工业上大规模应用的例子还不多，Colby等人利用固定化和细胞包埋技术对Rhodococcus AJ270转化丙烯酞胺生产丙烯酸过程及反应器放大方面进行了研究，实现了较高的丙烯酸产率(22h内大于97%)；瑞士Lonza公司已实现了利用微生物手性拆分生产S-哌嗪-2-甲酸，（R）-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。
酰胺酶酶源丰富，目前国内外学者已经从Bacillus、Arthrobacter、Rhodococcus、Geobacillus、Pseudomnas、Ochrobactrum、Methylophilus、超嗜热古菌Sulfolobussolfataricus以及工程菌Rhodococcus sp.R312等菌株中分离纯化出酰胺酶，并对其生化性质、结构以及催化反应机理做了详细的研究。尽管如此，关于超嗜热古菌中酰胺酶的研究则相对较少，而针对超嗜热古菌来源的腈水解酶超家族中的酰胺酶的分离纯化则未见报道。因此，有必要研究开发出一种来源于超嗜热古菌的酰胺酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于超嗜热古菌的酰胺酶及其编码基因与应用，该酰胺酶属于腈水解酶超家族，能有效的将脂肪族酰胺底物转化为相应的脂肪酸，催化效率高，而且该酰胺酶为超嗜热酶，适合用于需要较高反应温度的工业生产中。
本发明的第一个目的通过以下技术方案实现：一种如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有酰胺酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
本发明的第二个目的通过以下技术方案实现：上述蛋白质为重组酰胺酶，能够分别以乙酰胺、丙烯酰胺、L-谷氨酰胺、己酰胺和L-天冬酰胺为底物，进行转化反应，相应制备得到乙酸、丙烯酸、L-谷氨酸、己酸和L-天冬氨酸。
本发明的第三个目的通过以下技术方案实现：一种编码上述蛋白质的核酸序列。
优选的，所述核酸序列具体为：核酸序列如SEQ ID NO.1所示；或能与SEQ ID NO.1所示的核酸进行杂交的序列。
优选的，所述核酸序列来源自超嗜热古菌（Thermococcus sp.）LMOA501CGMCCNo.7834。
本发明还提供了一种含有上述核酸序列的重组载体。
本发明还提供了一种上述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
本发明还提供了一种上述的核酸序列在制备重组酰胺酶中的应用。
优选的，所述应用包括如下步骤：构建含所述核酸序列的重组载体，将所述的重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌，诱导培养，得到重组酰胺酶。
所述酰胺酶完整基因序列的克隆方法如下：设计含NdeI和XhoI酶切位点的引物1和引物2，以Thermococcus sp.LMOA501总DNA为模板克隆酰胺酶全长基因序列，引物1的序列如SEQ ID NO.3所示，引物2的序列如SEQ ID NO.4所示；PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30循环后，最后72℃延伸10min。扩增产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测并按OMEGA生物小量胶回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物的纯化，命名PCR产物为amiE。
所述酰胺酶基因的工程菌的构建和表达方法如下：对回收的amiE片段及载体pET-28a（+）分别进行双酶切（NdeI和XhoI）后割胶回收，割胶回收后的amiE片段连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。在含卡那霉素抗性的LB平板上培养过夜，挑取单菌落接入含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，培养10～14h后提取质粒，进行酶切验证插入目的片段的质粒进行序列测定，测序正确的质粒命名为pET-28a（+）-amiE。将重组质粒pET-28a（+）-amiE转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得含有重组质粒pET-28a（+）-amiE的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-28a（+）-amiE。将重组菌体BL21（DE3）/pET-28a（+）-amiE接入含卡那霉素抗性的LB液体培养基中37℃培养过夜，转接至含卡那霉素抗性的新鲜LB液体培养基37℃培养至OD600约为0.8～1.2，添加终浓度0.5mM的IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷），在30℃条件下进行诱导4h，重组菌株表现出酰胺酶活性。
所述酰胺酶的纯化及酶学性质如下：将上述活得的重组菌株的发酵液离心后收集菌体，用5倍体积binding buffer(含20mmol/L咪唑，0.3mol/L NaCl，50mmol/L KH2PO4，pH7.6)重悬菌体，冰上超声破碎菌体，裂解的菌体在13000rpm，4℃离心20min，取上清过Ni-NTA亲和层析柱，依次用含有20mM，100mM咪唑的洗涤缓冲液(含0.3mol/LNaCl，50mmol/L KH2PO4，pH7.6)洗涤层析柱，再用250mM咪唑的洗脱缓冲液(含0.3mol/LNaCl，50mmol/L KH2PO4，pH7.6)洗脱目的蛋白。活力组分在50mM磷酸缓冲液（pH7.6）中透析后，得到纯化的酰胺酶。通过SDS-PAGE分析纯化后的酰胺酶的纯度和分子量大小，并测定纯化酰胺酶的酶活及最适反应温度、最适反应pH以及有机试剂和金属离子对酶活的影响。
本发明还涉及一种超嗜热古菌（Thermococcus）LMOA501CGMCC No.7834。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的来源于深海热液口超嗜热古菌（Thermococcus）LMOA501中的酰胺酶作为超嗜热酶，能以乙酰胺为底物，有效的将脂肪族酰胺底物转化为相应的脂肪酸，催化效率高，该酰胺酶的最适反应pH为6.0，最适反应温度为90℃，其最适反应温度较现有技术中的大多数酰胺酶要高，非常适合用于需要较高反应温度的工业生产中。
本发明涉及的超嗜热古菌（Thermococcus）LMOA501，该菌株已于2013年6月28日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7834。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为pET-28a（+）-amiE重组质粒物理图谱。
图2为酰胺酶基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱，其中1为1kb DNA Marker；2为用引物1和引物2扩增得到的酰胺酶基因片段。
图3为重组质粒pET-28a（+）-amiE的酶切结构图，其中1为1kb DNA Marker；2为pET-28a（+）-amiE（NdeI+XhoI）样品。
图4为重组酰胺酶基因表达图谱，泳道1为标准蛋白分子量Marker；泳道2为阴性对照，不加IPTG培养的BL21（DE3）/pET-28a（+）-amiE菌株；泳道3为加入0.5mMIPTG培养的BL21（DE3）/pET-28a（+）-amiE菌株。
图5为重组酰胺酶分离纯化图谱，泳道1为标准蛋白分子量Marker；泳道2为纯化后的酰胺酶。
图6为重组酰胺酶最适反应温度结果图（以乙酰胺为底物反应）。
图7为重组酰胺酶的最适合反应pH结果图（以乙酰胺为底物反应）。
图8为1mM金属离子对重组酰胺酶酶活的影响结果图（以乙酰胺为底物反应）。
图9为有机试剂对重组酰胺酶酶活的影响结果图（以乙酰胺为底物反应）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、聚合酶链式反应(PCR)扩增amiE基因及扩增产物的纯化
超嗜热古菌（Thermococcus sp.）LMOA501，采集地点：瓜伊马斯热液口；分离源：瓜伊马斯热液喷口富油塔状样品；球形、直径为0.5-2.6μm、常压下生长温度范围为50℃-100℃、最适生长温度为85℃、压力生长范围为0.1-80MPa，保藏编号为CGMCCNo.7834。
获取超嗜热古菌（Thermococcus）LMOA501CGMCC No.7834，提取Thermococcussp.LMOA501总DNA，以该基因组DNA（SEQ ID NO.1）为模板，在引物1（碱基序列如SEQID NO.3所示）和引物2（碱基序列如SEQ ID NO.4所示）作用下进行PCR。
PCR扩增体系为：10×pfu Buffer5μL，DMSO2.5μL，2.5mmol/L dNTP4μL，引物1(20μmol/L)1μL，引物2(20μmol/L)1μL，5ng/μL Thermococcus sp.LMOA501总DNA基因组DNA1μL，1μL pfu DNA polymerase，用灭菌水补足至50μL，混匀；
PCR扩增反应的参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30循环后，最后72℃延伸10min。
扩增产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，发现明显阳性扩增带，即大小与理论大小相近的DNA片段，切下含目的基因的凝胶块，放入一洁净1.5mL EP管中，按OMEGA生物小量胶回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物的纯化，纯化后的产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果，如图2所示。
实施例2、表达载体的构建
对回收的amiE片段及载体pET-28a用NdeI和XhoI37℃酶切过夜，酶切完全后回收载体和片段。片段酶切体系为12μL水，5μL amiE片段，2μL buffer H，NdeI和XhoI各0.5μL，37℃反应过夜；载体酶切体系为15μL水，8μL pET28a质粒，3μL bufferH，NdeI和XhoI各1μL，37℃反应过夜；
根据amiE酶切产物和载体回收片段摩尔量比为3：1比例，加入1μL T4连接酶和连接酶buffer，混匀后22℃静置连接2小时。连接产物转化到感受态细胞大肠杆菌DH5α中；
在含有30mg/L Kan的LB平板上挑取10个转化子培养并提取质粒进行鉴定，质粒抽提方法见附录。重组质粒经NdeI和XhoI酶切鉴定，得到约800bp大小的基因片段，并将理论正确的质粒测序，利用软件分析证明amiE基因(SEQ ID NO.1)已成功重组到质粒pET28a上，如图1和图3所示。
实施例3、重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
挑取含重组质粒的单个DH5α大肠杆菌分别接种于3mL LB液体培养基中(含Kan30μg/L)，置37℃摇床振荡培养过夜，次日提取质粒，并将重组质粒转化入表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞中，分别取100μL菌液用玻棒均匀地涂布到含Kan(终浓度为30μg/L)的LB平板的表面，37℃倒置培养过夜。
然后待菌长出，随机挑取含重组质粒的单菌落，接种于3mL含Kan的LB培养液中37℃过夜培养，次日按1%的接种量分别转接到3mL含Kan的LB培养液中，37℃培养至OD600为1.2，一根含重组质粒培养管中不加诱导剂做阴性对照，另外1根培养管中加入终浓度为0.5mM IPTG，于30℃继续培养3h。
各取0.5mL培养物，10000rpm室温离心1min，收集菌体，加60μL的无菌水悬菌，然后再加入20μL4×SDS上样缓冲液，震荡处理，蛋白纯化时的样液直接取30μL加10μL4×SDS上样缓冲液，混匀后于100℃水浴5min，10000rpm室温离心5min，取上清液进行SDS-PAGE电泳，如图4所示。
实施例4、重组酰胺酶的纯化
挑取能够表达目的蛋白的AmiE BL21(DE3)单菌落接种于含Kan的3ml LB培养液中，37℃培养约12h后按1%的接种量转接到100mL含Kan的LB培养液中，37℃过夜培养，次日再按1%的接种量接种到1L含Kan的LB培养液中，37℃培养至OD600为1.0，加入终浓度为0.5mM IPTG，30℃诱导3h后，以5000rpm，常温下离心10min收集菌体；
用5倍体积binding buffer(含5mmol/L咪唑，0.3mol/L NaCl，50mmol/L KH2PO4，pH7.6)重悬菌体，冰上超声破碎菌体，裂解的菌体在13000rpm，4℃离心20min，取上清过Ni-NTA亲和层析柱，依次用含有5mM，100mM咪唑的洗涤缓冲液(含0.3mol/LNaCl，50mmol/L KH2PO4，pH7.6)洗涤层析柱，再用250mM咪唑的洗脱缓冲液(含0.3mol/L NaCl，50mmol/L KH2PO4，pH7.6)洗脱目的蛋白，纯化蛋白过程中的各组分经12%SDS－PAGE电泳鉴定，如图5所示,其中35KDa处对应的条件为目的蛋白条带，所述蛋白为AmiE，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例5、重组酰胺酶酶活测定
酰胺酶活性测定是根据水解酰胺类化合物释放出氨气的含量来测定酶活。具体步骤：在灭菌的Eppendorf管中加入终浓度为50mM KH2PO4-K2HPO4(pH7.6)、150mM NaCl、10mM底物以及10μg AmiE，用灭菌的水补足至100μL。立即在相应温度下水浴，开始计时。反应20分钟后，加入350μL试剂A(0.59M苯酚和1mM硝普钠)以终止反应。然后加入100μL试剂B(2.0M氢氧化钠和0.11M次氯酸钠)，混匀后置60℃处理5分钟，然后在595nm处测定其光吸收值。每个反应做3个平行对照。酶活力根据以下方法进行计算：1个酶活力单位是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量。
实施例6、反应温度对AmiE活性的影响
以10mM乙酰胺为底物，按照实施实例5所述酶活测定方法将反应物分别置于4℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃和100℃条件下反应20分钟。终止反应并进行显色，检测反应液在595nm处光吸收值，如图6所示，可见最适反应温度为90℃。
实施例7、反应pH对AmiE活性的影响
以10mM乙酰胺为底物，在95℃条件下按照实施例5所述酶活测定方法将反应物在不同pH(pH3.0～10.0）的缓冲液中进行反应，缓冲系统如下：pH3.0为50mMglycine-HCl，pH4.0到6.0为50mM HAc-NaAc缓冲液，pH6.0到8.0为50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0到9.0为50mM Tris-HCl，pH9.0到10.0为50mM glycine-NaOH。反应完成后，终止反应并进行显色，检测反应液在595nm处光吸收值，如图7所示。
实施例8、金属离子对AmiE酶活的影响
选择pH6.0磷酸钠缓冲液，在95℃条件下，按照实施例5所述酶活测定方法在反应体系中分别加入终浓度1mM的不同金属离子(Ca2+，Cu2+，Al3+，Co2+，Fe3+，Ni2+，Zn2+，Mg2+)于室温处理1小时后再加入10mM乙酰胺，于90℃反应20min，再检测酶活，如图8所示。
实施例9、有机试剂对AmiE酶活的影响
反应缓冲液选择pH6的磷酸钠缓冲液，按照实施例5所述酶活测定方法在反应体系中分别加入5-10%(v/v)的甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮；1-5mM EDTA；0.1-0.5mM PMSF；0.1%-0.5%TritonX114以及1%-5%SDS，于室温处理1小时后再加入10mM乙酰胺，于90℃反应20min后再检测酶活，如图9所示。
可见，本发明提供的来源于深海热液口超嗜热古菌Thermococcus sp.LMOA501中的酰胺酶作为超嗜热酶，能以乙酰胺为底物，有效的将脂肪族酰胺底物转化为相应的脂肪酸，催化效率高，该酰胺酶的最适反应pH为6.0，最适反应温度为90℃，其最适反应温度较现有技术中的大多数酰胺酶要高，非常适合用于需要较高反应温度的工业生产中。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Figure IDA00003548514800011
Figure IDA00003548514800031

Claims (10)

1.一种如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有酰胺酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
2.一种如权利要求1所述蛋白质的用途，其特征在于，所述蛋白质为重组酰胺酶，能够分别以乙酰胺、丙烯酰胺、L-谷氨酰胺、己酰胺和L-天冬酰胺为底物，进行转化反应，相应制备得到乙酸、丙烯酸、L-谷氨酸、己酸和L-天冬氨酸。
3.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
4.如权利要求3所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为：核酸序列如SEQ ID NO.1所示；或能与SEQ ID NO.1所示的核酸进行杂交的序列。
5.如权利要求3所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列来源自超嗜热古菌（Thermococcus sp.）LMOA501CGMCC No.7834。
6.一种含有权利要求3所述核酸序列的重组载体。
7.一种利用权利要求6所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
8.一种如权利要求3所述的核酸序列在制备重组酰胺酶中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：构建含所述核酸序列的重组载体，将所述的重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌，诱导培养，得到重组酰胺酶。
10.一种超嗜热古菌（Thermococcus sp.）LMOA501CGMCC No.7834。
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