CN104293753A - 重组酰胺酶Dt-Ami 7、编码基因、载体、工程菌及应用 - Google Patents

重组酰胺酶Dt-Ami 7、编码基因、载体、工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于代尔夫特菌Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的重组酰胺酶Dt-Ami 7、编码基因、重组载体及工程菌。该酰胺酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有重组酰胺酶，可以利用重组大肠杆菌或纯化的重组酰胺酶为催化剂催化系列酰胺化合物的水解。

Description

重组酰胺酶Dt-Ami 7、编码基因、载体、工程菌及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种酰胺酶Dt-Ami 7及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该酰胺酶Dt-Ami 7或含有该酶的重组细胞为催化剂在催化一系列脂肪族酰胺中的应用。
(二)背景技术
酰胺酶(Amidase,EC 3.5.1.4)能水解酰胺生成相应的羧酸和氨，若在羟胺或者肼存在的条件下则生成相应的氧肟酸和酰肼。作为腈转化酶家族中的重要一员，酰胺酶具有良好的立体选择性，在动力学水解外消旋酰胺或前手性化合物的去对称作用中发挥重要作用。在化学工业中，酰胺酶通常与腈水合酶耦联用于制备各类有机酸，如苯甲酸、丙烯酸、吡嗪酸及烟酸等；同时也被应用于药物合成、废水处理等。在近几年，酰胺酶已成为绿色合成化学的一类关键生物催化剂，日益受到工业界的重视。
酰胺酶的来源十分广泛，包括细菌、酵母、真菌，甚至植物和动物。根据划分标准的不同，酰胺酶可以分为很多种。如根据酰胺酶基因的上下游是否存在有编码腈水合酶基因，可以分为与腈水合酶耦联的酰胺酶和非耦联的酰胺酶；根据它们立体选择性的不同，可以划分为S-型酰胺酶和R-型酰胺酶；根据它们的底物专一性可分为短链和中链脂肪族酰胺水解酶；还可以根据氨基酸序列保守区域的不同，划分为酰胺酶标签家族(Amidase Signature Family，AS)和腈水解酶家族(Nitrilase Family，NF)两大类。
目前，国内外报道克隆的酰胺酶多以AS家族为主，关于其酶学特性的表征和研究也较为系统。相对于AS家族酰胺酶，NF家族的酰胺酶研究较少。通常NF家族酰胺酶底物谱较窄，一般只能催化短链脂肪族酰胺水解。克隆该家族的酰胺酶并对其进行表征，可为完善酰胺酶的应用和系统研究，为其分子水平上的分类定义提供坚实的理论基础。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174的酰胺酶Dt-Ami 7及编码基因、载体，工程菌，以及该酰胺酶的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174的重组酰胺酶Dt-Ami 7，所述酰胺酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
酰胺酶Dt-Ami 7通过基因挖掘的方法获得，所设计的挖掘方法具体为：根据NF家族酰胺酶保守序列有针对性地寻找NCBI收录的基因编码的氨基酸序列，进一步筛选可匹配催化三联体Cys-Glu-Lys的目的序列。选定一批预测的酰胺酶，将所选的酰胺酶进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。通过本实验室方法(ZL200510062182)进行酰胺酶活力的筛选，最终获得催化性能较佳的酰胺酶Dt-Ami 7。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO：2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明还提供一种所述重组酰胺酶Dt-Ami 7在水解酰胺制备羧酸中的应用，所述的应用为：将含重组酰胺酶Dt-Ami 7基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH 8.0Tris-HCl缓冲液悬浮后进行超声破碎，取上清液纯化(优选Ni-NTA柱层析)后为催化剂，以式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示化合物为底物，以pH 6～9的Tris-HCl缓冲液为反应介质构成反应体系，在25～45℃下进行水解反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得羧酸产物；
式(Ⅰ)中R1为C1～C4烷基，式(Ⅱ)中R2为C1～C4烷基，优选所述脂肪族酰胺化合物为丙酰胺，正丁酰胺，丙烯酰胺，戊酰胺，己酰胺，(S)-乳酰胺或(R)-乳酰胺。
其特征在于所述催化剂的用量以破碎前湿菌体重量计为1～10g/L反应体系，所述底物初始浓度为20mmol/L反应体系。
本发明所述催化剂按如下方法制备：(1)将含重组酰胺酶Dt-Ami 7基因的工程菌(优选工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7)接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体；(2)将含重组酰胺酶Dt-Ami 7基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH 8.0Tris-HCl缓冲液悬浮后进行超声破碎，将破碎混合液离心，取上清液进行Ni-NTA柱层析，以洗脱缓冲液洗脱，收集目标蛋白，将收集的目标蛋白在20mM，pH 8.0的Tris-HCl中透析过夜，取透过液即获得催化剂；所述洗脱缓冲液为含终浓度500mM咪唑和终浓度500mM NaCl的20mM、pH 8.0Tris-HCl的缓冲液。
本发明所述上清液纯化方法为：以Ni-NTA为纯化柱，装柱体积为20mL，先用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 8.0)平衡Ni-NTA柱，以1.5mL/min的速率上样粗酶液，用平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 8.0)洗脱，收集目标蛋白，将收集的目标蛋白在20mM，pH 8.0的Tris-HCl中透析过夜(更换2次缓冲液)，透过液即为纯化后的酶液。
本发明还涉及一种编码所述重组酰化酶Dt-Ami 7的基因，优选所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明的酰胺酶Dt-Ami 7基因来源于Delftia tsuruhatensis CCTCCNo.M 205115，具体制备方法为：根据Genbank中收录的预测为酰胺酶的基因序列设计合成引物，较佳的，上游引物为：CATATGAGACACGGAGATATTTCCAGC；下游引物为：GAATTCTCAGCGGTGCTTGGGCG；然后以Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M205115基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得全长1038bp的酰胺酶Dt-Ami 7基因序列。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，该序列编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQID No.2所示。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO：1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
本发明还涉及一种由所述编码基因构建的重组载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的酰胺酶Dt-Ami 7核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的酰胺酶基因产物Dt-Ami 7与载体pMD-18T连接形成克隆载体。该克隆载体经限制性内切酶NdeI/EcoRI双酶切，切胶回收后与同样经酶切处理回收的pET-28a连接，构建本发明的酰胺酶基因重组表达质粒pET28a-dt-ami 7。
此外，本发明还提供一种含所述编码Dt-Ami 7基因或所述重组载体的基因工程菌。所述工程菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的酰胺酶Dt-Ami 7基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒pET28a-dt-ami 7转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7。
本发明涉及一种所述编码基因在构建能够生物催化酰胺制备羧酸的重组酰胺酶Dt-Ami 7中的应用，所述的应用为：构建含有所述重组酰胺酶Dt-Ami 7基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有重组酰胺酶Dt-Ami 7的菌体细胞。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明所述酰胺酶Dt-Ami 7的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生酰胺酶Dt-Ami 7即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7接种至含卡那霉素(终浓度50μg/mL)的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，加入终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃下进行诱导培养，即可高效表达本发明的重组酰胺酶Dt-Ami 7。
本发明所述代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 205115，已在专利申请(申请号为CN 200510061680)中披露。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于D.tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的酰胺酶Dt-Ami 7、编码基因、重组载体及工程菌，该酰胺酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有重组酰胺酶Dt-Ami 7，可以利用重组大肠杆菌或纯化的重组酰胺酶为催化剂催化系列酰胺化合物的水解。
(四)附图说明
图1为酰胺酶基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为DL2000DNA Marker(从上至下条带大小分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道2为利用引物1和引物2扩增得到的酰胺酶基因片段；
图2为pET28a-dt-ami 7重组质粒物理图谱；
图3为工程菌诱导表达SDS-PAGE图；泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7，泳道3为IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7；
图4为酰胺酶分离纯化SDS-PAGE图；泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7，泳道3为IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7，泳道4为破碎上清，泳道5为纯化后的Dt-Ami 7。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：Delftia tsuruhatensis ZJB-05174酰胺酶基因的获得
用DNA提取试剂盒提取Delftia tsuruhatensis ZJB-05174菌体的全基因组DNA，以该DNA为模板，引物1(CATATGAGACACGGAGATATTTCCAGC)、引物2(GAATTCTCAGCGGTGCTTGGGCG)为作用引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL)：10×Pfu DNA Polymerase Buffer 5μL，10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度为50μM的克隆引物1、引物2各1μL，基因组DNA 1μL，Pfu DNAPolymerase 1μL，无核酸水40μL。
采用Biorad PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃5min，然后进入温度循环94℃30s，56℃30s，72℃1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。
取50μL PCR反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收该片段并纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。利用TaKaRa公司的PMD18-T试剂盒将该片段同T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18-T-dt-ami 7。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，随机挑取单菌落测序，利用软件分析测序结果：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为1038bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。利用软件对该基因序列进行分析，推知所述酰胺酶基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
实施例2：重组表达载体pET28a-dt-ami 7的构建
根据实施例1分析结果，利用质粒提取试剂盒提取质粒pMD18-T-dt-ami 7，经过限制性内切酶Nde Ⅰ/EcoR Ⅰ(Fermentas)进行双酶切，切胶回收后用T4连接酶(Promega)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET-28a(Novagen)过夜连接，构建重组表达质粒pET28a-dt-ami 7。
实施例3：工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7的构建
将实施例2中构建的重组表达载体pET28a-dt-ami 7转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序验证，结果表明重组表达载体pET28a-dt-ami 7成功转化表达宿主E.coli BL21(DE3)，构建了工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7，且酰胺酶基因已成功克隆至pET-28a的NdeI和EcoRI位点。
实施例4：重组酰胺酶Dt-Ami 7的诱导表达
实施例3构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体，冷冻干燥备用。
以未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-dt-ami 7作为对照，分别取20μL培养液与2×SDS-PAGE上样缓冲液混合后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图3所示，从图3可以看出经IPTG诱导后在38kD附近出现明显表达条带，与目的蛋白大小吻合，进一步证明工程菌构建成功。
实施例5：重组酰胺酶Dt-Ami 7的分离纯化
实施例4收集的湿菌体4g悬浮于50mL Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)中，振荡摇匀后置超声波下破碎(350W，15min)。破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)30mL用于酶的后续的分离纯化。
纯化柱为Ni-NTA，装柱体积为20mL，先用平衡缓冲液(20mMTris-HCl，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 8.0)平衡Ni-NTA柱，以1.5mL/min的速率上样粗酶液，用平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,和500mM咪唑，pH8.0)洗脱，收集目标蛋白，将收集的目标蛋白在20mM，pH 8.0的Tris-HCl中透析过夜(更换2次缓冲液)，纯化后的酶液(即透过液)用SDS-PAGE进行分析。SDS-PAGE电泳见图4，结果表明经Ni-NTA亲和层析，得到电泳纯的重组酰胺酶(Dt-Ami 7)20mL。
实施例6～12重组酰胺酶Dt-Ami 7催化脂肪族酰胺的水解
(1)转化反应：向Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.0)中加入实施例5方法制备的纯化后酶液，加入量见表1(50μL相对于以破碎前湿菌体质量计1g/L反应体系，500μL相对于以破碎前湿菌体质量计10g/L反应体系)。于45℃保温20min后添加脂肪族酰胺，使其终浓度为20mM，反应体系总体积为10mL。45℃摇床150r/min条件下反应15min测定酶活力。酶活(U)定义：在45℃，pH 8.0的条件下，每分钟生成1微摩尔羧酸所需的酶量。比酶活是指每毫克酶蛋白所具有的酶活，U/mg。
(2)产物浓度具体分析条件如下：
实施例6，9，10，11，12采用谷氨酸脱氢酶法，具体为：
谷氨酸脱氢酶检测母液(100mL)：43mg NADH，116mgα-酮戊二酸，11.8mg ADP(二磷酸腺苷)及1200U谷氨酸脱氢酶溶于100mLTris-HCl缓冲液(150mM,pH 8.0)。
转化反应结束后，用1M HCl终止反应，取5μL转化反应液加至95μL谷氨酸脱氢酶检测母液(含谷氨酸脱氢酶)中，酶标仪读取A340nm的减少量。根据不同浓度的NH4 +标准曲线计算反应液中的氨含量，从而根据产物和氨摩尔比1:1测定产物的生成量。
标准曲线方程为：y＝0.055x+0.0079(R2＝0.999)
其中，y为A340nm的减少量，x为NH4 +的浓度。
实施例7，8采用气相色谱法。色谱柱为FFAP；进样口及检测器温度为250℃；柱温150℃保持5min；载气：高纯氮气；载气流量：1.2mL/min；进样量：0.2μL；分流比：50:1；结果见表1所示。
表1重组酰胺酶催化脂肪族酰胺水解结果
实施例13重组酰胺酶Dt-Ami 7催化2，2-二甲基环丙甲酰胺的水解
以实施例5中获得的重组酰胺酶Dt-Ami 7的纯酶作为生物催化剂，催化2,2-二甲基环丙甲酰胺水解。转化体系组成及转化操作如下：20mMTris-HCl(pH 8.0)5.96mL加入纯酶液500μL(相对于以破碎前湿菌体质量计10g/L反应体系)，于45℃保温20min后添加4mL 2,2-二甲基环丙甲酰胺(浓度为50mM)，总体系10mL。45℃摇床150r/min条件下反应。采用手性气相色谱测定2,2-二甲基环丙甲酰胺及2,2-二甲基环丙甲酸的含量及对映体过量值。气相检测方法：色谱柱为BGB-174；进样口及检测器温度为220℃；柱温135℃保持5min，5℃/min程序升温至170℃；载气：高纯氦气；载气流量：1.2mL/min；进样量：1μL；分流比：30:1；酶活(U)定义：在45℃，pH 8.0的条件下，每分钟生成1微摩尔产物所需的酶量。经测定，重组酰胺酶Dt-Ami 7对2,2-二甲基环丙甲酰胺不具备催化活力。

Claims (10)

1.一种来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174的重组酰胺酶Dt-Ami 7，其特征在于所述酰胺酶Dt-Ami 7的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.一种权利要求1所述重组酰胺酶Dt-Ami 7在水解酰胺制备羧酸中的应用，其特征在于所述的应用为：将含重组酰胺酶Dt-Ami 7基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH 8.0Tris-HCl缓冲液悬浮后进行超声破碎，取上清液纯化后作为催化剂，以式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示化合物为底物，以pH 6～9的Tris-HCl缓冲液为反应介质构成反应体系，在25～45℃下进行水解反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得羧酸产物；
式(Ⅰ)中R1为C1～C4烷基，式(Ⅱ)中R2为C1～C4烷基。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述催化剂的用量以破碎前湿菌体重量计为1～10g/L反应体系，所述底物初始浓度为20mmol/L反应体系。
4.如权利要求2所述应用，其特征在于所述底物为丙酰胺、正丁酰胺、丙烯酰胺、戊酰胺、己酰胺、(S)-乳酰胺或(R)-乳酰胺。
5.如权利要求2所述应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含重组酰胺酶Dt-Ami 7基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH 8.0Tris-HCl缓冲液悬浮后进行超声破碎，将破碎混合液离心，取上清液进行Ni-NTA柱层析，以洗脱缓冲液洗脱，收集目标蛋白，将收集的目标蛋白在20mM，pH 8.0的Tris-HCl中透析过夜，取透过液即获得催化剂；所述洗脱缓冲液为含终浓度500mM咪唑和终浓度500mM NaCl的20mM、pH 8.0Tris-HCl的缓冲液。
6.一种编码权利要求1所述重组酰胺酶Dt-Ami 7的基因。
7.如权利要求6所述编码基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
8.一种由权利要求6所述编码基因构建的重组载体。
9.一种含权利要求6所述编码基因或权利要求8所述重组载体的基因工程菌。
10.一种权利要求6所述编码基因在构建能够生物催化酰胺制备羧酸的重组酰胺酶Dt-Ami 7中的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述重组酰胺酶Dt-Ami 7基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有重组酰胺酶Dt-Ami 7的菌体细胞。
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