CN101691574A

CN101691574A - 一种腈水解酶基因、载体、工程菌及其应用

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Publication number: CN101691574A
Application number: CN200910152434A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 柳志强; 薛亚平; 郑仁朝; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2009-09-08
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2010-04-07
Anticipated expiration: 2029-09-08
Also published as: CN101691574B

Abstract

本发明提供了一种编码腈水解酶的腈水解酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组腈水解酶中的应用。该腈水解酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒或分泌表达重组质粒，再分别对应转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有重组腈水解酶，可以重组大肠杆菌为酶源进行生物催化与转化。重组腈水解酶重组腈水解酶作为转化用酶，分别以外消旋扁桃腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈或2，2-二甲基环丙烷甲腈等为底物，进行转化反应制备相应的R-扁桃酸、丙烯酸、亚氨基二乙酸或手性2，2-二甲基环丙烷甲酸等。

Description

一种腈水解酶基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种编码腈水解酶的腈水解酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组腈水解酶中的应用。

(二)背景技术

腈水解酶(EC 3.5.5)能够催化腈水解生成相应的羧酸和氨，是一类在自然界中广泛存在的水解酶。腈水解酶是具有广泛的底物适应性的生物催化剂，由于天然腈化合物的广泛存在，为发现和利用这种具有降解腈化合物的酶提供和创造了有利的条件。腈水解酶具有立体选择性，利用这一特点，它可以催化合成各种光学纯的酸。腈水解酶高效单一的反应，优良的选择性使之在有机合成中表现出巨大的应用潜力，不仅具有广泛的工业应用前景，而且也可以发展为合成手性分子及手性化合物的有力工具。

腈水解酶在自然界广泛存在。植物中主要有大麦科、十字花科、香蕉科以及萝卜、燕麦、小麦的秧苗等。最近发现昆虫和人体内也存在腈水解酶。腈水解酶最多的来源是微生物，第一个能产腈水解酶的微生物菌种是可以利用天然腈化合物蓖麻碱(N-甲基-3-氰基-4-甲氧基-2-吡啶酮)作为唯一碳源筛选得到的假单孢菌(Pseudomonas)。可以产生腈水解酶的微生物菌株还有红球菌属(Rhodococcus)、杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、食酸菌属(Acinetobacter)、以及曲霉菌属(Aspergillus)和青霉菌属(Penicillium)等。在不同底物的诱导下，同一微生物来源的腈水解酶有不同的活性。

腈水解酶活性中心含有Glu-Lys-Cys三个残基，腈水解酶中的半胱氨酸残基上的巯基有强亲核性，使整个催化水解反应过程类似于一般化学反应中碱催化下的氰基水解，巯基首先亲核进攻腈中的碳原子形成酶-亚胺中间体，再水合产生四面体中间体，该中间体除去氨转变为酰基-酶中间体，后者水解产生羧酸，并使酶恢复原形。腈水解酶的活性部位不含金属离子，因此绝大多数金属离子及金属离子螯合剂如氰基、重氮基、EDTA等对酶活力都没有抑制作用。

目前已经有多种腈水解酶基因被克隆和测序，并且实现了在不同宿主中的表达。为了进一步研究腈水解酶的结构、探索酶的功能、并对酶进行改良，国内外不少研究者尝试利用基因突变技术对腈水解酶基因进行改造。1992年，Michihiko等克隆了Rhodococcus rhodochrous K22的腈水解酶并利用定点突变的方法对该酶进行了研究，结果发现，cys170位于该酶的活性位点上。张锐等人在进行腈水解酶bxn基因克隆和改造时发现：4处突变中2处突变能使基因表达产物丧失功能，1处使基因表达产物活性降低，1处对基因表达产物活性基本无影响。进一步将完全回复突变的bxn基因转化烟草，获得的转基因烟草具有抗溴苯腈除草剂特性，结果证明结构中的3处突变与活性中心功能有关。但由于定点突变位点的选择比较困难，再加上研究周期长、效率低，因此在腈水解酶的应用方面尚没有突破。

在腈水解酶家族中，由于目前发现的腈水解酶存在酶活较低，而且稳定性较差等问题，利用腈水解酶进行大规模的工业化生产存在一定的难度，这使得构建腈水解酶基因工程菌具有重要意义，利用基因工程的手段来改善野生型产腈水解酶菌株的不足，为腈水解酶的工业化应用提供了新思路并奠定了基础。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种腈水解酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组腈水解酶中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种腈水解酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

该腈水解酶基因由如下方法得到：利用PCR技术，在引物1(ATGGATCACCCGAAATTCAAAGC)、引物2(AATACCTTCTTGGTCAGTCGGC)的作用下，以来源于节杆菌(Arthrobacternitroguajacolicus)CCTCCM208252菌株中的总基因组DNA为模板克隆长约0.8kb的腈水解酶基因片段。将该片段连接到pMD18-T载体上获得克隆载体pMD18-T-NIT和转化了pMD18-T-NIT的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为819bp的开放阅读框。该基因核苷酸序列为：

1 ATGGATCACC CGAAATTCAA AGCAGCTGCT ATCCAGGCCG CACCGGTCTT CCTGAACCTG

61 GACGCGACCA TTGATAAAGC GGTTGCCCTG ATCGAAGAAG CCAGCAGCAA TGGTGCTGAA

121 GTTATCGCGT TCCCGGAGAC TTGGCTGCCG GGCTACCCTT GGTACGCATG GCTGGACGCG

181 CCTGCCCTGT GGCTGGCTAA ATTCGGCCAG CGTTATTATG ATAACTCTCT GGAGTACGGC

241 ACGCCGCAGG CTGAACGCCT GGCAAAAGCA GCAAAGGATA ACAACATTAT GGTAGGTATG

301 GGTCTGTCTG AGCGCTCTGG TAGCTCCCTG TACATTGCGC AGTGGATCAT TGGCAACGAC

361 GGTAAAACCA TCGCGCAGCG TCGTAAGCTG AAGCCGACGC ACGTGGAACG TACCATCTAC

421 GGTGAAGGCG ATGGTTCTGA CCTGTCCGTA TGGGACACGA AACTGGGTCG TGTTGGCGGT

481 CTGTGTTGTT GGGAACATCT GCAGCCACTG TCCAAGTACG CGATGTATGC CCAAAACGAA

541 CAGGTGCACT TCGCGGCGTG GCCGTCCTTC AGCATTTATG AAGGTGGTGC TTACGCACTG

601 TCTGGCGAAG CAAACGTTGC AGCGTCCCGT GTATACGCTC TGGAGGGTTC CTGTTATGTC

661 CTGGCACCTA CTGCCATTGT TAGCCAGGAG ATGCAGGACG AAATGTGCGA GACTGATCTG

721 CAGAAAGCTC TGCTGAAAAC TGGTGGTGGC TATTCCCGTA TTTTCGGTCC GGACGGCAAA

781 CAGCTGCACG AATCTCTGCC GACTGACCAA GAAGGTATT

利用软件对该基因序列进行分析，推知所述腈水解酶基因编码SEQID NO：2所示的氨基酸序列：

1 MDHPKFKAAA IQAAPVFLNL

21 DATIDKAVAL IEEASSNGAE

41 VIAFPETWLP GYPWYAWLDA

61 PALWLAKFGQ RYYDNSLEYG

81 TPQAERLAKA AKDNNIMVGM

101 GLSERSGSSL YIAQWIIGND

121 GKTIAQRRKL KPTHVERTIY

141 GEGDGSDLSV WDTKLGRVGG

161 LCCWEHLQPL SKYAMYAQNE

181 QVHFAAWPSF SIYEGGAYAL

201 SGEANVAASR VYALEGSCYV

221 LAPTAIVSQE MQDEMCETDL

241 QKALLKTGGG YSRIFGPDGK

261 QLHESLPTDQ EGI

所述腈水解酶基因源自节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)CCTCC No：M 208252。该节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)(菌株编号ZJUTB06-99)保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 208252，保藏日期2008年12月21日，已在在先申请200910100875.8中提交了相关菌种保藏信息。

本发明还涉及一种含有所述腈水解酶基因的重组载体，以及用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本申请发明人根据测序结果设计胞内表达引物3(cgcgaattcatggatcacccgaaattcaaagcagc)和引物4(gttgtcgacttaaa taccttcttggtcagtcggcag)、分泌表达引物5(cgcgaattcgatcacccgaaattcaaagcagc)和引物6(attgtcgacaataccttcttggt cagtcggcag)，以克隆载体pMD18-T-NIT为模板，获得了用于胞内表达和分泌表达的腈水解酶基因。本发明将腈水解酶基因同胞内表达载体pTrc99a(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway)或分泌表达载体pET20b(Initrogen company)连接，构建了含有腈水解酶基因的胞内表达重组质粒pTrc99a-NIT或分泌表达重组质粒pET20b-NIT。

将胞内表达重组质粒pTrc99a-NIT转化至大肠杆菌JM109菌株中，获得含有胞内表达重组质粒pTrc99a-NIT的重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT，或将分泌表达重组质粒pET20b-NIT转化至大肠杆菌BL21菌株中，获得含有分泌表达重组质粒pET20b-NIT的重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT。以重组菌为酶源，进行生物催化与转化。

本发明还涉及所述的腈水解酶基因在制备重组腈水解酶中的应用。

具体的，所述的应用为：构建含有所述腈水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组腈水解酶的菌体细胞。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种来源于节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)CCTCC No：M 208252的腈水解酶基因核苷酸序列；该腈水解酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒或分泌表达重组质粒，再分别对应转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有重组腈水解酶，可以利用重组大肠杆菌为酶源进行生物催化与转化。重组腈水解酶作为转化用酶，分别以外消旋扁桃腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈或2，2-二甲基环丙烷甲腈等为底物，可以进行转化反应制备相应的R-扁桃酸、丙烯酸、亚氨基二乙酸或手性2，2-二甲基环丙烷甲酸等。

(四)附图说明

图1为克隆载体pMD18-T-NIT物理图谱；

图2为pTrc99a-NIT重组质粒物理图谱；

图3为pET20b-NIT重组质粒物理图谱；

图4为腈水解酶基因PCR扩增argrose电泳图；其中，1～4为利用引物1和引物2扩增得到的腈水解酶基因片段；5为DL2000DNAMarker；图5阳性重组质粒pTrc99a-NIT的酶切结构图；其中，1为腈水解酶基因片段；2为pTrc99a-NIT/EcoRI and SalI样品；3为pTrc99a样品；4为pTrc99a-NIT/EcoRI样品；5为pTrc99a-NIT/SalI样品；6为λDNA/HindIIIDNA Marker；

图6阳性重组质粒pET20b-NIT的酶切结构图；其中，1为腈水解酶基因片段；2为pET20b-NIT/EcoRI and SalI样品；3为pET20b样品；4为pET20b-NIT/EcoRI样品；5为pET20b-NIT/SalI样品；6为λDNA/HindIIIDNA Marker。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

用核酸快速提取仪提取节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)CCTCC No：M 208252菌体的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1(ATGGATCACCCGAAATTCAAAGC)、引物2(AATACCTTCTTGGTCAGTCGGC)的作用下进行PCR扩增。PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL)：10×Pfu DNA Polymerase Buffer 5μL，10mM dNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度为50μM的克隆引物1、引物2各1μL，基因组DNA 1μL，Pfu DNA Polymerase 1μL，无核酸水40μL。

采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃5min，然后进入温度循环94℃30s，53℃1min，72℃1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为8℃。

取5μL PCR反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收该片段并纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMDT-18-NIT见图1。将该重组质粒电转化至大肠杆菌JM109中，利用篮白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为819bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。

实施例2：

根据实施例1分析结果设计引物3(cgcgaattcatggatcacccgaaattcaaagcagc)、引物4(gttgtcgacttaaataccttcttggtcagtcggcag)，并分别在引物3和引物4中引入了EcoRI和SalI限制性酶切位点。在引物3和引物4的引发下，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa)进行扩增，获得长为819bp的腈水解酶基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，测序后利用EcoRI和SalI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pTrc99a(Invitrogen)进行连接，构建表达载体pTrc99a-NIT。将构建的胞内表达载体pTrc99a-NIT电转化至大肠杆菌JM109(Invitrogen)中，涂平板37℃下培养过夜，随机挑取克隆抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图5。

实施例3：

根据实施例1分析结果设计引物5(cgcgaattcgatcacccgaaattcaaagcagc)、引物6(attgtcgacaataccttcttggtcagtcggcag)，并分别在引物5和引物6中引入了EcoRI和SalI限制性酶切位点。在引物5和引物6的引发下，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa)进行扩增，获得长为819bp的腈水解酶基因片段，测序后利用EcoRI和SalI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET20b进行连接，构建分泌表达载体pET20b-NIT。将构建的表达载体pET20b-NIT电转化至大肠杆菌BL21(Invitrogen)中，涂平板37℃下培养过夜，随机挑取克隆并抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图6。

实施例4：

将实施例2、实施例3验证后的含有胞内表达重组质粒pTrc99a-NIT的重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表达重组质粒pET20b-NIT的重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT分别用含有50μg/ml氨苄青霉素抗性的LB液体培养基培养12h，再以1％接种量(v/v)接种到新鲜的含有50μg/ml氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导培养8h后，4℃、5000rpm离心10min，收集含有重组腈水解酶的菌体细胞。

实施例5：

以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒pTrc99a-LAC的重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表达重组质粒pET20b-NIT的重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT湿菌体作为转化用酶，以丙烯腈为底物，进行转化反应制备丙烯酸。转化体系组成及转化操作如下：在250mL三角瓶中加入5g湿菌体和底物浓度为2％(v/v)的50mL反应液，30℃摇床150r/min条件下反应60min，离心去除菌体，上清液为含有丙烯酸的水溶液。采用外标定量法来测定转化液中丙烯腈、丙烯酸的含量。各成分的量用气相色谱Agilent 6890N测定，色谱柱类型：FFAP毛细管柱；色谱条件：柱温150℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，N₂流量为60mL/min；分流比为30∶1。酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 7.0条件下，在1min内催化丙烯腈生成1μmo1丙烯酸所需要的酶量定义为1U。根据体系中丙烯酸的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表1和表2。

表1：以重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT为酶源测定的腈水解酶酶活力测定结果

菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))
菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))	大肠杆菌JM109	0
大肠杆菌JM109/pTrc99a	0	大肠杆菌JM109	0
大肠杆菌JM109/pTrc99a	0	大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT-1	87
大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT-2	92	大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT-1	87

表2：以重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT为酶源测定的腈水解酶酶活力测定结果

菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))
菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))	大肠杆菌JM109	0
大肠杆菌JM109/pET20b	0	大肠杆菌JM109	0
大肠杆菌JM109/pET20b	0	大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-1	185
大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-2	174	大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-1	185

实施例6：

以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒pTrc99a-NIT的重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表达重组质粒pET20b-NIT的重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT湿菌体作为转化用酶，以外消旋扁桃腈为底物，进行转化反应制备R-扁桃酸。转化体系组成及转化操作如下：在250mL三角瓶中加入5g湿菌体和底物浓度为1％(v/v)的50mL反应液，30℃摇床150r/min条件下反应30min，离心去除菌体，清液为含有R-扁桃酸的水溶液。采用高效液相色谱法检测扁桃酸和扁桃腈浓度，具体色谱条件为：色谱柱为C18硅胶柱(250mm×4.60mm)；流动相组成为10mM磷酸二氢铵∶甲醇(v/v)＝4∶1。柱温为室温；检测波长228nm；流动相流速1ml/min。酶活定义(U)：在30℃，pH 8.0的条件下，1min生成1μmol扁桃酸所需要的酶量定义为1U。根据体系中R-扁桃酸的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表3和表4。

表3：以重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT为酶源测定的腈水解酶酶活力测定结果

菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))
菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))	大肠杆菌JM109	0
大肠杆菌JM109/pTrc99a	0	大肠杆菌JM109	0
大肠杆菌JM109/pTrc99a	0	大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT-1	369
大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT-2	365	大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT-1	369

表4：以重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT为酶源测定的腈水解酶酶活力测定结果

菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))
		大肠杆菌BL21	0
大肠杆菌BL21/pET20b	0
		大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-1	520
大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-2	488

实施例7：

以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒pTrc99a-NIT的重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表达重组质粒pET20b-NIT的重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT湿菌体作为转化用酶，以亚氨基二乙腈为底物，进行转化反应制备亚氨基二乙酸。转化体系组成及转化操作如下：在100mL 3％(w/w)的亚氨基二乙腈水溶液中加入5g湿菌体进行水解反应，控制温度30℃、搅拌转速200r/min，氨水自动流加调节pH 7.0，水解12h后离心去除菌体，清液为含有亚氨基二乙酸的水溶液。采用液相测定亚氨基二乙酸含量：取0.1mL水解液，加1mL 0.5M的NaHCO₃溶液、0.4mL 1％(w/w)的2，4-二硝基氟苯-乙腈溶液和1mL蒸馏水，在60℃下避光反应30min，衍生化完后，再加7.5mL 0.2M pH 7.0的磷酸缓冲液，然后进行HPLC分析检测，色谱柱为Elite C18色谱柱(250nm×4.6nm)；流动相为甲醇：0.05M的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.5)(55∶45，v/v)；流速为1.0mL/min；检测波长为365nm；柱温为30℃。酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 7.0条件下，在1min内催化亚氨基二乙腈生成1μmol亚氨基二乙酸所需要的酶量定义为1U。根据体系中亚氨基二乙酸的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表5和表6。

表5：以重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT为酶源测定的腈水解酶酶活力测定结果

表6：以重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT为酶源测定的腈水解酶酶活力测定结果

菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))
菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))	大肠杆菌BL21	0
大肠杆菌BL21/pET20b	0	大肠杆菌BL21	0
大肠杆菌BL21/pET20b	0	大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-1	226
大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-2	247	大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-1	226

实施例8：

以实施例4中获得的含有胞内表达重组质粒pTrc99a-NIT的重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT或含有分泌表达重组质粒pET20b-NIT的重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT湿菌体作为转化用酶，以外消旋2，2-二甲基环丙烷甲腈为底物，进行转化反应制备(R)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。转化体系组成及转化操作如下：在500mL三角瓶中加入8g湿菌体和底物浓度为0.7％(v/v)的100mL反应液，30℃摇床150r/min条件下反应70min，离心去除菌体。采用手性气相色谱法测定2，2-二甲基环丙烷甲腈及2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度和光学纯度。具体色谱条件为：BGB-175手性气相色谱柱；载气为氦气，流速1ml/min；进样口、检测器温度均为220℃，柱温130℃；分流比50∶1。酶活定义(U)：在30℃，pH 7.0的条件下，1min生成1μmol 2，2-二甲基环丙烷甲酸所需的酶量定义为1U。测定结果见表7和表8。

表7：以重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT为酶源测定的腈水解酶酶活力测定结果

菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))
菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))	大肠杆菌JM109	0
大肠杆菌JM109/pTrc99a	0	大肠杆菌JM109	0
大肠杆菌JM109/pTrc99a	0	大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT-1	97
大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT-2	93	大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT-1	97

表8：以重组大肠杆菌BL21/pET20b-NIT为酶源测定的腈水解酶酶活力测定结果

菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))
菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))	大肠杆菌BL21	0
大肠杆菌BL21/pET20b	0	大肠杆菌BL21	0
大肠杆菌BL21/pET20b	0	大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-1	155
大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-2	149	大肠杆菌BL21/pET20b-NIT-1	155

结论：由上述实验结果可知，将本发明腈水解酶基因转化大肠杆菌得到重组大肠杆菌具有较强产腈水解酶能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或转化反应。重组腈水解酶作为转化用酶，可以分别以外消旋扁桃腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈或2，2-二甲基环丙烷甲腈等为底物，进行转化反应制备相应的R-扁桃酸、丙烯酸、亚氨基二乙酸或手性2，2-二甲基环丙烷甲酸等。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

<120>一种腈水解酶基因、载体、工程菌及其应用

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>819

<212>DNA

<213>Arthrobacter sp.

<400>1

atggatcacc cgaaattcaa agcagctgct atccaggccg caccggtctt cctgaacctg 60

gacgcgacca ttgataaagc ggttgccctg atcgaagaag ccagcagcaa tggtgctgaa 120

gttatcgcgt tcccggagac ttggctgccg ggctaccctt ggtacgcatg gctggacgcg 180

cctgccctgt ggctggctaa attcggccag cgttattatg ataactctct ggagtacggc 240

acgccgcagg ctgaacgcct ggcaaaagca gcaaaggata acaacattat ggtaggtatg 300

ggtctgtctg agcgctctgg tagctccctg tacattgcgc agtggatcat tggcaacgac 360

ggtaaaacca tcgcgcagcg tcgtaagctg aagccgacgc acgtggaacg taccatctac 420

ggtgaaggcg atggttctga cctgtccgta tgggacacga aactgggtcg tgttggcggt 480

ctgtgttgtt gggaacatct gcagccactg tccaagtacg cgatgtatgc ccaaaacgaa 540

caggtgcact tcgcggcgtg gccgtccttc agcatttatg aaggtggtgc ttacgcactg 600

tctggcgaag caaacgttgc agcgtcccgc gtatacgctc tggagggttc ctgttatgtc 660

ctggcaccta ctgccattgt tagccaggag atgcaggacg aaatgtgcga gactgatctg 720

cagaaagctc tgctgaaaac tggtggtggc tattcccgta ttttcggtcc ggacggcaaa 780

cagctgcacg aatctctgcc gactgaccaa gaaggtatt 819

<210>2

<211>273

<212>PRT

<213>Arthrobacter sp.

<400>2

Met Asp His Pro Lys Phe Lys Ala Ala Ala Ile Gln Ala Ala Pro Val

1 5 10 15

Phe Leu Ash Leu Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ala Val Ala Leu Ile Glu

20 25 30

Glu Ala Ser Ser Asn Gly Ala Glu Val Ile Ala Phe Pro Glu Thr Trp

35 40 45

Leu Pro Gly Tyr Pro Trp Tyr Ala Trp Leu Asp Ala Pro Ala Leu Trp

50 55 60

Leu Ala Lys Phe Gly Gln Arg Tyr Tyr Asp Asn Ser Leu Glu Tyr Gly

65 70 75 80

Thr Pro Gln Ala Glu Arg Leu Ala Lys Ala Ala Lys Asp Asn Asn Ile

85 90 95

Met Val Gly Met Gly Leu Ser Glu Arg Ser Gly Ser Ser Leu Tyr Ile

100 105 110

Ala Gln Trp Ile Ile Gly Asn Asp Gly Lys Thr Ile Ala Gln Arg Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly Asp

130 135 140

Gly Ser Asp Leu Ser Val Trp Asp Thr Lys Leu Gly Arg Val Gly Gly

145 150 155 160

Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Gln Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Met Tyr

165 170 175

Ala Gln Asn Glu Gln Val His Phe Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Ile

180 185 190

Tyr Glu Gly Gly Ala Tyr Ala Leu Ser Gly Glu Ala Asn Val Ala Ala

195 200 205

Ser Arg Val Tyr Ala Leu Glu Gly Ser Cys Tyr Val Leu Ala Pro Thr

210 215 220

Ala Ile Val Ser Gln Glu Met Gln Asp Glu Met Cys Glu Thr Asp Leu

225 230 235 240

Gln Lys Ala Leu Leu Lys Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Arg Ile Phe Gly

245 250 255

Pro Asp Gly Lys Gln Leu His Glu Ser Leu Pro Thr Asp Gln Glu Gly

260 265 270

Ile

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

atggatcacc cgaaattcaa agc 23

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

aataccttct tggtcagtcg gc 22

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>5

cgcgaattca tggatcaccc gaaattcaaa gcagc 35

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

gttgtcgact taaatacctt cttggtcagt cggcag 36

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>7

cgcgaattcg atcacccgaa attcaaagca gc 32

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>8

attgtcgaca ataccttctt ggtcagtcgg cag 33

Claims

1.一种腈水解酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于所述腈水解酶基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于所述腈水解酶基因源自节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)CCTCC No：M 208252。

4.一种含有权利要求1所述腈水解酶基因的重组载体。

5.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.如权利要求1所述的腈水解酶基因在制备重组腈水解酶中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述腈水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组腈水解酶的菌体细胞。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述重组腈水解酶作为转化用酶，分别以外消旋扁桃腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈或2，2-二甲基环丙烷甲腈为底物，进行转化反应制备相应的R-扁桃酸、丙烯酸、亚氨基二乙酸或手性2，2-二甲基环丙烷甲酸。