CN101921785A

CN101921785A - 一种醛脱氢酶基因、载体、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN101921785A
Application number: CN2010102175731A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 柳志强; 平立英; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2010-07-05
Filing date: 2010-07-05
Publication date: 2010-12-22

Abstract

本发明提供了一种来源于酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的醛脱氢酶基因及其重组表达载体、基因工程菌，及其在制备重组醛脱氢酶中的应用。本发明提供了一种来源于酿酒酵母菌株中的醛脱氢酶基因核苷酸序列；并将该基因与表达载体连接构建的到含该基因的表达重组质粒pET28b-aldH，再转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠杆菌BL21/pET28b-aldH。可应用本发明构建的重组大肠杆菌为酶源进行生物催化与转化，将乙醛、丙醛或3-羟基丙醛转化为相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸。

Description

一种醛脱氢酶基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及来源于酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的醛脱氢酶基因及其重组表达载体、基因工程菌，及其在制备重组醛脱氢酶中的应用。

(二)背景技术

醛脱氢酶能催化3-羟基丙醛、丙醛和乙醛分别生成3-羟基丙酸、丙酸和乙酸，在化工领域及人体乙醛代谢中发挥着重要作用。醛脱氢酶广泛存在于植物、动物及微生物中，其微生物来源主要有酿酒酵母及大肠杆菌。醛脱氢酶是一种复合体，含有三个亚基，分子量分别为54KD、49KD和12KD。

目前不同来源的醛脱氢酶基因已经被克隆和测序，并且实现了在不同宿主中的表达。然而野生型醛脱氢酶活力较低，限制了其大规模的生产，因此，构建具有工业用途的醛脱氢酶基因工程菌意义重大。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种醛脱氢酶基因及其重组表达载体、基因工程菌，及其在制备重组醛脱氢酶中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醛脱氢酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

该序列由如下方法获得：

利用PCR技术，在引物1(ATGTCACACCTTCCTATGACAGTGCC)、引物2(GTCCAATTTGGCACGGACCGC)的作用下，以来源于酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的总基因组DNA为模板，克隆得到约1.5kb的醛脱氢酶的基因片段。将该片段连接到pMD18-T载体上获得克隆载体pMD18-T-aldH和转化了pMD18-T-aldH的重组大肠杆菌JM109/pMD18-T-aldH。

对重组质粒进行测序，并利用软件对测序结果进行分析，分析表明该序列含有一个长为1488bp的开发阅读框。该基因核苷酸序列为(SEQ IDNO：1)：

1 ATGTCACACC TTCCTATGAC AGTGCCTATC AAGCTGCCCA ATGGGTTGGA ATATGAGCAA

61 CCAACGGGGT TGTTCATCAA CAACAAGTTT GTTCCTTCTA AACAGAACAA GACCTTCGAA

121 GTCATTAACC CTTCCACGGA AGAAGAAATA TGTCATATTT ATGAAGGTAG AGAGGACGAT

181 GTGGAAGAGG CCGTGCAGGC CGCCGACCGT GCCTTCTCTA ATGGGTCTTG GAACGGTATC

241 GACCCTATTG ACAGGGGTAA GGCTTTGTAC AGGTTAGCCG AATTAATTGA ACAGGACAAG

301 GATGTCATTG CTTCCATCGA GACTTTGGAT AACGGTAAAG CTATCTCTTC CTCGAGAGGA

361 GATGTTGATT TAGTCATCAA CTATTTGAAA TCTTCTGCTG GCTTTGCTGA TAAAATTGAT

421 GGTAGAATGA TTGATACTGG TAGAACCCAT TTTTCTTACA CTAAGAGACA GCCTTTGGGT

481 GTTTGTGGGC AGATTATTCC TTGGAATTTC CCACTGTTGA TGTGGGCCTG GAAGATTGCC

541 CCTGCTTTGG TCACCGGTAA CACCGTCGTG TTGAGGACTG CCGAATCCAC CCCATTGTCC

601 GCTTTGTATG TGTCTAAATA CATCCCACAG GCGGGTATTC CACCTGGTGT GATCAACATT

661 GTATCCGGGT TTGGTAAGAT TGTGGGTGAG GCCATTACAA ACCATCCAAA AATCAAAAAG

721 GTTGCCTTCA CAGGGTCCAC GGCTACGGGT AGACACATTT ACCAGTCCGC AGCCGCAGGC

781 TTGAAAAAAG TGACTTTGGA GCTGGGTGGT AAATCACCAA ACATTGTCTT CGCGGACGCC

841 GAGTTGAAAA AAGCCGTGCA AAACATTATC CTTGGTATCT ACTACAATTC TGGTGAGGTC

901 TGTTGTGCGG GTTCAAGGGT GTATGTTGAA GAATCTATTT ACGACAAATT CATTGAAGAG

961 TTCAAAGCCG CTTCTGAATC CATCAAGGTG GGCGACCCAT TCGATGAATC TACTTTCCAA

1021 GGTGCACAAA CCTCTCAAAT GCAACTAAAC AAAATCTTGA AATACGTTGA CATTGGTAAG

1081 AATGAAGGTG CTACTTTGAT TACCGGTGGT GAAAGATTAG GTAGCAAGGG TTACTTCATT

1141 AAGCCAACTG TCTTTGGTGA CGTTAAGGAA GACATGAGAA TTGTCAAAGA GGAAATCTTT

1201 GGCCCTGTTG TCACTGTAAC CAAATTCAAA TCTGCCGACG AAGTCATTAA CATGGCGAAC

1261 GATTCTGAAT ACGGGTTGGC TGCTGGTATT CACACCTCTA ATATTAATAC CGCCTTAAAA

1321 GTGGCTGATA GAGTTAATGC GGGTACGGTC TGGATAAACA CTTATAACGA TTTCCACCAC

1381 GCAGTTCCTT TCGGTGGGTT CAATGCATCT GGTTTGGGCA GGGAAATGTC TGTTGATGCT

1441 TTACAAAACT ACTTGCAAGT TAAAGCGGTC CGTGCCAAAT TGGACATT

利用软件对该基因序列进行分析，并推知其编码的氨基酸序列为(SEQ ID NO：2)：

MSHLPMTVPI KLPNGLEYEQ PTGLFINNKF VPSKQNKTFE VINPSTEEEI CHIYEGREDD

VEEAVQAADR AFSNGSWNGI DPIDRGKALY RLAELIEQDK DVIASIETLD NGKAISSSRG

DVDLVINYLK SSAGFADKID GRMIDTGRTH FSYTKRQPLG VCGQIIPWNF PLLMWAWKIA

PALVTGNTVV LRTAESTPLS ALYVSKYIPQ AGIPPGVINI VSGFGKIVGE AITNHPKIKK

VAFTGSTATG RHIYQSAAAG LKKVTLELGG KSPNIVFADA ELKKAVQNII LGIYYNSGEV

CCAGSRVYVE ESIYDKFIEE FKAASESIKV GDPFDESTFQ GAQTSQMQLN KILKYVDIGK

NEGATLITGG ERLGSKGYFI KPTVFGDVKE DMRIVKEEIF GPVVTVTKFK SADEVINMAN

DSEYGLAAGI HTSNINTALK VADRVNAGTV WINTYNDFHH AVPFGGFNAS GLGREMSVDA

LQNYLQVKAV RAKLDI

本发明还涉及含有所述醛脱氢酶基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

根据测序结果设计表达引物3(GTTGTCGACTCACACCTTCCTATGACAGTGCC，下划线部分为Sal I酶切位点)和引物4(GTTAAGCTTGTCCAATTTGGCACGGACCGC，下划线部分为Hind III酶切位点)，以重组质粒pMD18-T-aldH为模板，通过PCR扩增得到了用于表达的醛脱氢酶基因。本发明将醛脱氢酶基因同表达载体pET28b连接，构建了含有醛脱氢酶基因的表达重组质粒pET28b-aldH。将表达重组质粒pET28b-aldH转化至大肠杆菌BL21菌株中，获得含有表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠杆菌BL21/pET28b-aldH，以重组菌为酶源，进行生物催化与转化。

本发明还涉及所述的醛脱氢酶基因在制备重组醛脱氢酶中的应用。

具体的，所述的应用为：构建含有所述醛脱氢酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组醛脱氢酶的菌体细胞。

所述重组醛脱氢酶作为转化用酶，可分别以乙醛、丙醛或3-羟基丙醛为底物，进行转化反应制备相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的醛脱氢酶基因核苷酸序列；并将该基因与表达载体连接构建的到含该基因的表达重组质粒pET28b-aldH，再转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠杆菌BL21/pET28b-aldH。可应用本发明构建的重组大肠杆菌为酶源进行生物催化与转化，将乙醛、丙醛或3-羟基丙醛转化为相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸。

(四)附图说明

图1为克隆载体pMD18-T-aldH物理图谱；

图2为pET28b-aldH重组质粒物理图谱；

图3为醛脱氢酶基因PCR扩增argrose电泳图；1：DL2000DNAMarker；2～5：利用引物1和引物2扩增得到的醛脱氢酶基因片段；图4阳性重组质粒pET28b-aldH的酶切结构图；1：DL2000DNA Marker；2：醛脱氢酶基因片段；3：pET28b-aldH/Sal I样品；4：pET28b-aldH/HindIII样品；5：pET28b-aldH/Sal I and Hind III样品；6：λDNA/HindIII DNAMarker。

图5为醛脱氢酶酶SDS-PAGE图；1：蛋白分子量Marker；2：E.coli BL21；3：未诱导的E.coli BL21/pET28b-aldH；4：0.1mM IPTG诱导的E.coli BL21/pET28b-aldH；5：0.5mM IPTG诱导的E.coli BL21/pET28b-aldH；6：1mM IPTG诱导的E.coli BL21/pET28b-aldH。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

用核酸快速提取仪提取酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株(中国普通微生物保藏管理中心(北京)，编号2.1543)的总基因组DNA，以该基因组DNA 为模板，在引物1(ATGTCACACCTTCCTATGACAGTGCC)、引物2(GTCCAATTTGGCACGGACCGC)的作用下进行PCR扩增。PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL)：10×Pfu DNAPolymerase Buffer 5μL，10mM dNTP mixture 1μL(20mM)，克隆引物1、引物2各1μL(50μM)，基因组DNA 1μL，Pfu DNAPolymerase 1μL，无核酸水40μL。采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃5min，然后进入温度循环94℃30s，55℃1.5min，72℃2min，共35个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为8℃。取5μL用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收该片段并纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18-T-aldH见图1。将该重组质粒电转化至大肠杆菌JM109中，利用篮白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：利用引物1、引物2扩增得到得片段含有一个开放阅读框，长度为1488bp。

实施例2：

根据实施例1分析结果设计表达引物3和引物4，并分别在引物3和引物4中引入了Sal I和Hind III限制性酶切位点。在引物3(GTTGTCGACTCACACCTTCCTATGACAGTGCC，下划线部分为Sal I酶切位点)和引物4(GTTAAGCTTGTCCAATTTGGCACGGACCGC，下划线部分为Hind III酶切位点)的引发下，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，获得长为1488bp的醛脱氢酶基因片段(SEQ ID NO：1)，测序后利用Sal I和Hind III限制性内切酶对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的表达载体pET28b进行连接，构建表达载体pET28b-aldH。将构建的表达载体pET28b-aldH电转化至大肠杆菌BL21中，涂平板37℃下培养过夜，随机挑取克隆抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图4。

实施例3：

将实施例2验证后的含有表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠杆菌BL21/pET28b-aldH用含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基培养12h，再以1％接种量接种到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导培养8h后，4℃、9000rpm离心8min，收集含有重组醛脱氢酶的菌体细胞。

实施例4：

以实施例3中获得的含有表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠杆菌BL21/pET28b-aldH湿菌体超声破碎后(350W，破碎2s，间隔2s，共80次)作为转化用酶，以乙醛为底物，进行转化反应制备乙酸。转化体系及转化操作如下：在50ml转化瓶中加入超声破碎后的菌体和底物浓度为1％的10ml反应液，30℃下，150r/min转化10min，离心去除菌体，上清液中即含有乙酸。

在340nm处测定醛脱氢酶催化乙醛生成乙酸所用的酶量，酶活定义：30℃、每分钟A₃₄₀处吸光度值增加0.001为1个活力单位(U)。

表1：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-aldH为酶源测定的醛脱氢酶酶活力测定结果

由上述实验结果可知，将本发明醛脱氢酶基因转化大肠杆菌得到重组大肠杆菌具有较强产醛脱氢酶能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或转化反应。醛脱氢酶酶作为转化用酶，可以分别以乙醛、丙醛或3-羟基丙醛等为底物，进行转化反应制备相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸等。

<110> 浙江工业大学

<120> 一种醛脱氢酶基因、载体、工程菌及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

atgtcacacc ttcctatgac agtgcctatc aagctgccca atgggttgga atatgagcaa 60

ccaacggggt tgttcatcaa caacaagttt gttccttcta aacagaacaa gaccttcgaa 120

gtcattaacc cttccacgga agaagaaata tgtcatattt atgaaggtag agaggacgat 180

gtggaagagg ccgtgcaggc cgccgaccgt gccttctcta atgggtcttg gaacggtatc 240

gaccctattg acaggggtaa ggctttgtac aggttagccg aattaattga acaggacaag 300

gatgtcattg cttccatcga gactttggat aacggtaaag ctatctcttc ctcgagagga 360

gatgttgatt tagtcatcaa ctatttgaaa tcttctgctg gctttgctga taaaattgat 420

ggtagaatga ttgatactgg tagaacccat ttttcttaca ctaagagaca gcctttgggt 480

gtttgtgggc agattattcc ttggaatttc ccactgttga tgtgggcctg gaagattgcc 540

cctgctttgg tcaccggtaa caccgtcgtg ttgaggactg ccgaatccac cccattgtcc 600

gctttgtatg tgtctaaata catcccacag gcgggtattc cacctggtgt gatcaacatt 660

gtatccgggt ttggtaagat tgtgggtgag gccattacaa accatccaaa aatcaaaaag 720

gttgccttca cagggtccac ggctacgggt agacacattt accagtccgc agccgcaggc 780

ttgaaaaaag tgactttgga gctgggtggt aaatcaccaa acattgtctt cgcggacgcc 840

gagttgaaaa aagccgtgca aaacattatc cttggtatct actacaattc tggtgaggtc 900

tgttgtgcgg gttcaagggt gtatgttgaa gaatctattt acgacaaatt cattgaagag 960

ttcaaagccg cttctgaatc catcaaggtg ggcgacccat tcgatgaatc tactttccaa 1020

ggtgcacaaa cctctcaaat gcaactaaac aaaatcttga aatacgttga cattggtaag 1080

aatgaaggtg ctactttgat taccggtggt gaaagattag gtagcaaggg ttacttcatt 1140

aagccaactg tctttggtga cgttaaggaa gacatgagaa ttgtcaaaga ggaaatcttt 1200

ggccctgttg tcactgtaac caaattcaaa tctgccgacg aagtcattaa catggcgaac 1260

gattctgaat acgggttggc tgctggtatt cacacctcta atattaatac cgccttaaaa 1320

gtggctgata gagttaatgc gggtacggtc tggataaaca cttataacga tttccaccac 1380

gcagttcctt tcggtgggtt caatgcatct ggtttgggca gggaaatgtc tgttgatgct 1440

ttacaaaact acttgcaagt taaagcggtc cgtgccaaat tggacatt 1488

<210> 2

<211> 496

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

Met Ser His Leu Pro Met Thr Val Pro Ile Lys Leu Pro Asn Gly Leu

1 5 10 15

Glu Tyr Glu Gln Pro Thr Gly Leu Phe Ile Asn Asn Lys Phe Val Pro

20 25 30

Ser Lys Gln Asn Lys Thr Phe Glu Val Ile Asn Pro Ser Thr Glu Glu

35 40 45

Glu Ile Cys His Ile Tyr Glu Gly Arg Glu Asp Asp Val Glu Glu Ala

50 55 60

Val Gln Ala Ala Asp Arg Ala Phe Ser Asn Gly Ser Trp Asn Gly Ile

65 70 75 80

Asp Pro Ile Asp Arg Gly Lys Ala Leu Tyr Arg Leu Ala Glu Leu Ile

85 90 95

Glu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ser Ile Glu Thr Leu Asp Asn Gly

100 105 110

Lys Ala Ile Ser Ser Ser Arg Gly Asp Val Asp Leu Val Ile Asn Tyr

115 120 125

Leu Lys Ser Ser Ala Gly Phe Ala Asp Lys Ile Asp Gly Arg Met Ile

130 135 140

Asp Thr Gly Arg Thr His Phe Ser Tyr Thr Lys Arg Gln Pro Leu Gly

145 150 155 160

Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Trp Ala

165 170 175

Trp Lys Ile Ala Pro Ala Leu Val Thr Gly Asn Thr Val Val Leu Arg

180 185 190

Thr Ala Glu Ser Thr Pro Leu Ser Ala Leu Tyr Val Ser Lys Tyr Ile

195 200 205

Pro Gln Ala Gly Ile Pro Pro Gly Val Ile Asn Ile Val Ser Gly Phe

210 215 220

Gly Lys Ile Val Gly Glu Ala Ile Thr Asn His Pro Lys Ile Lys Lys

225 230 235 240

Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Ala Thr Gly Arg His Ile Tyr Gln Ser

245 250 255

Ala Ala Ala Gly Leu Lys Lys Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser

260 265 270

Pro Asn Ile Val Phe Ala Asp Ala Glu Leu Lys Lys Ala Val Gln Asn

275 280 285

Ile Ile Leu Gly Ile Tyr Tyr Asn Ser Gly Glu Val Cys Cys Ala Gly

290 295 300

Ser Arg Val Tyr Val Glu Glu Ser Ile Tyr Asp Lys Phe Ile Glu Glu

305 310 315 320

Phe Lys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Lys Val Gly Asp Pro Phe Asp Glu

325 330 335

Ser Thr Phe Gln Gly Ala Gln Thr Ser Gln Met Gln Leu Asn Lys Ile

340 345 350

Leu Lys Tyr Val Asp Ile Gly Lys Asn Glu Gly Ala Thr Leu Ile Thr

355 360 365

Gly Gly Glu Arg Leu Gly Ser Lys Gly Tyr Phe Ile Lys Pro Thr Val

370 375 380

Phe Gly Asp Val Lys Glu Asp Met Arg Ile Val Lys Glu Glu Ile Phe

385 390 395 400

Gly Pro Val Val Thr Val Thr Lys Phe Lys Ser Ala Asp Glu Val Ile

405 410 415

Asn Met Ala Asn Asp Ser Glu Tyr Gly Leu Ala Ala Gly Ile His Thr

420 425 430

Ser Asn Ile Asn Thr Ala Leu Lys Val Ala Asp Arg Val Asn Ala Gly

435 440 445

Thr Val Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Asp Phe His His Ala Val Pro Phe

450 455 460

Gly Gly Phe Asn Ala Ser Gly Leu Gly Arg Glu Met Ser Val Asp Ala

465 470 475 480

Leu Gln Asn Tyr Leu Gln Val Lys Ala Val Arg Ala Lys Leu Asp Ile

485 490 495

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

gttgtcgact cacaccttcc tatgacagtg cc 32

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

gttaagcttg tccaatttgg cacggaccgc 30

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

gttgtcgact cacaccttcc tatgacagtg cc 32

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

gttaagcttg tccaatttgg cacggaccgc 30

Claims

1.一种来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醛脱氢酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的醛脱氢酶基因，其特征在于所述醛脱氢酶基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种含有权利要求1所述醛脱氢酶基因的重组载体。

4.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

5.如权利要求1所述的醛脱氢酶基因在制备重组醛脱氢酶中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述醛脱氢酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组醛脱氢酶的菌体细胞。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述重组醛脱氢酶作为转化用酶，分别以乙醛、丙醛或3-羟基丙醛为底物，进行转化反应制备相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸。