CN102925465A

CN102925465A - 一种具有重要药物代谢活性的猪醛氧化酶（SsAOX1）的编码基因及其应用

Info

Publication number: CN102925465A
Application number: CN2012103859450A
Authority: CN
Inventors: 邓诣群; 郑鸣; 唐先青; 母培强
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2032-10-12
Also published as: CN102925465B

Abstract

本发明提供了猪醛氧化酶1基因的核苷酸序列，以及利用猪醛氧化酶1基因构建的载体和由这些载体转染的宿主系统的应用。本发明还提供了一种制备猪醛氧化酶1基因的方法，并通过体外表达获得该基因编码的具有生物活性的蛋白，有利于研究醛氧化酶的生理作用和酶学功能，设计针对性的定向药物治疗相关疾病，具有极大的市场价值。

Description

一种具有重要药物代谢活性的猪醛氧化酶(SsAOX1)的编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及一种猪醛氧化酶基因及其制备方法和应用。

背景技术

猪是国内养殖量与消费量最大的畜类动物代表，在蓄养和繁殖过程中，给猪口服各种饲料添加剂已成为养殖业中提高肉质产量的一个重要手段，但各种饲料添加剂可能会由于代谢不完全，而在猪体内残留不完全代谢物并进一步在体内富集累积。肝脏作为最大的代谢器官，存在着丰富的药物代谢酶系。从肝脏中分离纯化或通过基因工程手段重组表达关键代谢酶并研究其药物代谢能力，是研究猪体内药物的代谢途径和相关代谢酶的重要方法。醛氧化酶（aldehyde oxidase，AO）是一类具有催化醛类氧化成相应的羧酸并释放出活性氧功能的催化酶，它属于钼-黄素酶（molybdo-flavoenzyme，MFE）家族，分类号为EC 1.2.3.1。醛氧化酶广泛存在于各动物物种，在动物体内又以肝脏为最丰富的分布场所。醛氧化酶是新陈代谢不可缺少的酶类，它参与多种生理调节，可以将体内形成的有毒醛氧化为无毒酸，从而缓解醛类对机体的毒害作用；也参与细胞内电子传递，在与代谢和繁殖相关的生理活动中起着非常重要的作用。在动物体内，醛氧化酶参与代谢产物和外源化合物的氧化降解、视黄酸合成、药物代谢及肝脏中有毒化合物代谢，还与一些人类疾病的病理相关，其活性水平已成为医学上临床用药及治疗效果评估的一个重要参数。

随着分子生物学的快速发展，一些新的技术与方法也被用在醛氧化酶的研究上，例如在小鼠中已成功借助基因敲出、定点突变和原核表达等分子生物学手段来研究醛氧化酶的生理作用和酶学功能。利用蛋白表达和纯化技术获得有活性的动物醛氧化酶，进而分析其酶学及生物学特性也是值得深入探索的研究途径。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供猪醛氧化酶1基因及其制备方法。

本发明的上述目的通过如下方案予以实现：

本发明提供一种猪醛氧化酶1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明还提供一种所述醛氧化酶1基因所编码的具有生物活性的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

一种重组表达载体，包含所述猪醛氧化酶1基因。

一种包含所述重组表达载体的宿主系统。

一种催化组合剂，包含所述醛氧化酶1基因所编码的具有生物活性的蛋白。

所述催化组合剂在催化醛类氧化成相应羧酸中的应用。

一种所述猪醛氧化酶1基因的制备方法，以猪肝组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的3对上、下游引物及相应序列分别为：F1：SEQ ID NO：3； R1：SEQ ID NO：4；F2：SEQ ID NO：5； R2：SEQ ID NO：6；F3：SEQ ID NO：7；R3：SEQ ID NO：8。

所述PCR扩增反应的条件为：98℃预变性2 min，然后98℃变性30 s，55℃退火15 s，68℃延伸30 s，共35个循环，最后68℃复延伸10 min，得如SEQ ID NO:1所示猪醛氧化酶1基因。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：通过PCR扩增得到一个猪醛氧化酶基因，并通过体外重组表达及纯化体系，获得该基因编码的具有生物活性的蛋白，能更加有效的了解醛氧化酶的生理作用和酶学功能，从而将其更好的应用于醛类和杂环类化合物的催化合成；另一方面可针对猪体内该蛋白质的特性，设计针对性的定向药物治疗相关疾病，具有极大的市场价值。

附图说明

图1猪醛氧化酶1基因（SsAOX1）所编码的蛋白与同家族种其他物种的醛氧化酶和黄嘌呤氧化酶的功能性结构域的相似性比较。

图2猪醛氧化酶1基因（SsAOX1）序列已报道的脊椎动物醛氧化酶基因的系统进化树

图3猪醛氧化酶1基因（SsAOX1）的全长PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳图。

图4猪醛氧化酶的重组表达与纯化SDS-PAGE电泳图。M: broad range protein marker, 1:诱导前菌体样品总蛋白, 2: 诱导后菌体样品总蛋白, 3: 诱导后菌体样品上清组分蛋白, 4: 诱导后菌体样品沉淀组分蛋白, 5: Ni2+亲和层析纯化后蛋白样品

图5 重组猪醛氧化酶代谢视黄醛的酶动力活性实验

具体实施方式

本发明将通过下列实施例得到更清楚的说明，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1 克隆猪醛氧化酶1基因（SsAOX1）

（1）猪肝脏总cDNA的分离提取

1. 取4~5月龄杜长白大三元杂交猪，颈部放血致死。

2. 剪去肝脏，用滤纸吸干肝脏的水分，剪成小块分装在2 ml冻存管中，于液氮中保存。

3. 从液氮罐中小心取出鸡和猪肝脏各三份，分别用玻璃匀浆器（0.1% DEPC处理24h后灭菌并烘干），加1ml预冷的TRIzol试剂(Sigma-Aldrich公司)冰上研磨充分。

4. 转移液体至1.5ml去RNA酶的EP离心管中，加200 μl三氯甲烷，振荡10秒，室温放置2~3min。

5. 以12000g离心力于4℃离心15min。将约500 μl上清液转移至新的1.5 ml EP管。

6. 加500 μl异丙醇，摇匀后于室温放置10min，12000g，4℃离心10min。

7. 小心倒掉上清，加1ml 75%乙醇，漂洗沉淀1次，7500g，4℃离心5min。

8. 倒掉上清，室温风干后，加30 μl DEPC处理的去离子水溶解沉淀，即得肝脏总RNA原液，琼脂糖凝胶电泳鉴定，测定OD260值并计算浓度。

9. 按下表配制模板RNA/引物混合液，全量6μl。

溶液	用量
		肝脏总RNA	1ng-1μg
Oligo(dT)12-18 Primer(50μM)	1μl
		Random Primer(25μM)	0.5μl
Rnase-free ddH₂O	up to 6μl

10. 70℃保温10min，冰上冷却2min。离心数秒，将溶液甩至管底。

11. 按下表配制反转录反应液，于PCR仪42℃反应1 h。

溶液	用量（μl）
		RNA/引物变性溶液	6
5xM-MLV buffer	2
		dNTP mixture(10μM each)	0.5
RNase Inhibitor(40U/μl)	0.25
		Rtase M-MLV(200U/μl)	0.25-1
Rnase-free ddH₂O	up to 10 μl

12. 70℃保温15min后，冰上冷却，即得猪肝总cDNA原液，保存于-80℃备用。

（2）猪醛氧化酶1基因（SsAOX1）的克隆

1. 根据已报道的人、牛、大鼠、小鼠的醛氧化酶基因的核苷酸序列，利用Genefishe2（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/ genefisher2）进行序列的比对和兼并引物的设计，设计了3对扩增猪醛氧化酶1基因片段的序列，具体如下表所示：

引物名称	序列
		F1	SEQ ID NO：3
R1	SEQ ID NO：4
		F2	SEQ ID NO：5
R2	SEQ ID NO：6
		F3	SEQ ID NO：7
R3	SEQ ID NO：8

2. 分别用F1、R1引物扩增片段一，F2、R2引物扩增片段二，F3、R3引物扩增片段三，以下表配制PCR反应液：

组分	用量（μl）
		10×PCR buffer	5
dNTP(2mM Each)	5
		MgSO₄(25mM)	3
primer F(10μM)	1.5
		primer R(10μM)	1.5
KOD-plus(1U/μl)	1
		plasmid DNA(10ng/μl)	1
ddH₂O	32

3. 弹匀溶液，离心数秒，放入PCR仪，设定如下程序进行扩增：

98℃预变性 2min

98℃变性 30sec

55℃退火 15sec

68℃延伸 30sec，共35个循环

68℃复延伸 10min

4. 取2 μl做1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。

5. 胶回收PCR产物，测序；对所得三个片段的序列用DNAstar软件进行拼接，得到SsAOX1基因全长序列（SEQ ID NO：1）。

（3）猪醛氧化酶1基因（SsAOX1）的序列分析

本发明的猪醛氧化酶1基因在GenBank核苷酸数据库中搜寻同源序列，发现该基因编码蛋白的核苷酸序列（CDS）同其它哺乳动物的同源基因具有高度的同源性。同GenBank中的牛的醛氧化酶1（BtAOX1, NM_176668）的CDS同源性为90%；同人的醛氧化酶1（HsAOX1,NM_001159）的CDS同源性为88%；同大鼠的醛氧化酶1（RnAOX1, NM_019363）的CDS同源性为82%；同小鼠的醛氧化酶1（MmAOX1, NM_009676）的CDS同源性为82%。

本发明中的猪醛氧化酶1基因所编码的蛋白质在GenBank的蛋白质数据库中搜寻同源序列，发现该基因编码的氨基酸序列同其他哺乳动物的同源基因的氨基酸序列同样具有高度的同源性。同牛的醛氧化酶1（BtAOX1, AAI05266）的氨基酸序列同源性为89%；同人的醛氧化酶1（HsAOX1,AAA96650）的氨基酸序列同源性为86%；同大鼠的醛氧化酶1（RnAOX1, EDL99010）的氨基酸序列同源性为81%；同小鼠的醛氧化酶1（MmAOX1, AAH26132）的氨基酸序列同源性为81%。特别地，对于本蛋白质序列中的相关结构域，本发明中的猪醛氧化酶1基因所编码的蛋白质序列与同为钼-黄素酶家族的黄嘌呤氧化酶也存在着高度的同源性，更进一步证明了所获得的基因其编码的蛋白隶属于钼-黄素酶家族成员，具有与已报道的多个物种的醛氧化酶和黄嘌呤氧化酶有高度相似性（图1）。

通过对脊椎动物25个物种的醛氧化酶1的编码蛋白序列进行聚类分析和序列比对并建立系统进化树（图2），结果表明本发明获得的SsAOX1基因符合醛氧化酶1的进化规律，间接证明了所得到的序列确为醛氧化酶1基因家族成员。

实施例2 猪醛氧化酶1（SEQ ID NO：1）的表达

（1）表达质粒的构建

根据SsAOX1的基因两端序列，合成以下的1对载体构建引物，上游引物含有Hind III酶切位点，下游引物含有Not I酶切位点。上游引物如SEQ IN NO：9所示，下游引物如SEQ IN NO：10所示。

以前述PCR的方法，从提取的猪肝总cDNA中扩增得到SSAOX1基因片段，长度为4000bp左右，与预期大小一致（图3）。将回收纯化的SsAOX1基因PCR产物用上述的Hind III和Not I双酶切后，插入到同样用Hind III和Not I双酶切的pQE30载体（北京鼎国昌盛生物技术公司）中，通过转化JM109感受态宿主菌（北京鼎国昌盛生物技术公司）并筛选阳性克隆，得到正确插入目的基因的阳性菌株。将阳性菌株扩培提取质粒后，用Hind III和Not I双酶切能切出一条与SsAOX1预期大小一致的片段，表明SsAOX1基因已插入质粒载体pQE30中。纯化pQE30-SsAOX1质粒，对插入片段进行双向测序，其序列与实施例1实验步骤（2）中的测序结果完全一致，说明合成的引物与PCR扩增无误，读码框正确。

（2）重组猪醛氧化酶1在大肠杆菌中的原核表达与纯化

将pQE30-SsAOX1质粒转化处于感受态的大肠杆菌M15表达菌株，挑去培养基平板上长出的单个克隆，接种至含有50 mg/l的2 ml液体LB培养基中，37℃，250 rpm，培养3h，至培养液浑浊。按1:100逐级扩大培养至100 ml LB培养1~2h，再1:100扩大培养到1l TB培养基中，培养至0D600为0.5~0.7。加入终浓度为0.4mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），于22℃诱导蛋白表达72 h，6000 rpm，10 min，4℃离心收集菌体。菌体用50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）洗涤后，超声破菌，裂解后上清液经Histrap Ni HP亲和层析柱进一步纯化，收集洗脱下的重组猪醛氧化酶蛋白，SDS-PAGE鉴定出大小为150kDa的带，与预期大小相符，证明成功纯化到了重组的猪醛氧化酶蛋白（图四）。

实施例3 重组猪醛氧化酶蛋白氧化代谢视黄醛的活性实验

将重组的猪醛氧化酶蛋白加入到10 mM的磷酸钾缓冲液中（pH7.8），总体积为0.5 ml，于37℃预孵育2 min，然后加入底物视黄醛，终浓度为25-100 μM。反应30 min后，用甲醇终止反应并萃取样品至10 μl甲醇溶液中溶解，HPLC上扬分析并在340nm处检测代谢物。通过绘制酶活力动力学曲线图，结果显示在底物视黄醛较低浓度时，重组猪醛氧化酶蛋白即具有良好的催化活性，其代谢视黄醛的相关酶动力学参数为: V_max=1090 nmol/min/mg protein，K_m=1.72 μM。已有研究表明：鸡和狗肝脏中的醛氧化酶，不具有代谢视黄醛的活性；重组表达的小鼠肝脏醛氧化酶代谢视黄醛的酶动力学参数为： V_max=807 nmol/min/mg protein， K_m=3.8 μM。相比之下，我们所纯化到的重组型猪醛氧化酶蛋白，具有较高的最大反应速率和较低的底物饱和浓度。这说明猪醛氧化酶比小鼠醛氧化酶具有更高的代谢活力和更高的底物转化效率。综上，我们利用本基因所重组表达获得的重组猪醛氧化酶在催化醛类氧化方面具有极强的专一性和高效性（图5）。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 猪醛氧化酶基因及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4017

<212> DNA

<213> Pig

<400> 1

atggacgggg cggcggagct gctgttctac gttaacggcc gcaaggtgat agaaaaaaat 60

gtcaatcctg aaacaatgct gttaccatat ttgaggaaga agctccgact cacaggaact 120

aaatatggct gtggaggggg aggctgtggt gcctgcacgg tgatgatatc acgatataac 180

cccattacca agaggataag acattatccg gctaacgcct gtctgattcc catctgttcc 240

ctgtatggtg ctgctgtcac cacagtagaa ggcataggaa gcaccaggac caggattcat 300

cctgttcagg agaggattgc caagtgtcac ggcacgcagt gtggcttctg cacccctggg 360

atggtgatgt ccatctacac gctgctcagg aaccaccccg agcccaccct cagtcaatta 420

actgaagccc ttggtggtaa cctgtgccgt tgcactggat acaggcccat aattgatgca 480

tgcaagactt tctgtaaaac ttctggctgc tgtcaaggta aagaaaatga ggtttgctgt 540

ttggatcaag gaataaatgg attaccagaa tttgaggaag gaaatgagac aagtcacaaa 600

ctcttttcag aagaggagtt tctgccattg gatccaactc aggaattgat atttcctcct 660

gagctagtga caatggctga gaaacaacca caaaggacca ggatttttgg tggtgatagg 720

atgacatgga tttccccagt gaccctgaag gaacttctag aagccaaagt caaatatccc 780

caggcccctg ttgtcatggg gaacacctct gtggggcctg acgtgaaatt taaaggcatc 840

tttcacccag ttgtaatatc tcctgacagc attgaagaaa tgagtattgt aaactataca 900

gataatgggc tgactttagg tgccgccctc agcctggctc aggtgaagga catcctggct 960

aaggtgatcc ggaagctccc agaggagaag acccagacat tccacgctct ctggaagcat 1020

ttgggaactc tggctggagc ccagatcagg aacatgtctt ctttaggggg ccacatagtg 1080

agcagacatc tagattcaga tctgaatccc ctcctggccg tgggcaactg tactcttaat 1140

ttgcaatcaa aagaaggaaa acgacagatt cctttaaatg agcagtttct caaaaagtgc 1200

cccagtgcca gtcttaagcc tgaagaaatc ttgatctcag tgaatatccc ctattcaaga 1260

aagtgggagt ttgtgtcggc cttccgacaa gcccagcgac agcagaacgc gctagcgatg 1320

gtcaattcgg gaatgagagt gtttttcgga gaaggagatg gcgtcattag agagttagcc 1380

atcgcgtatg gaggagttgg tccaaccacc atctgtgcaa agaattcctg ccaggagctc 1440

attggaaggc cctggaatga agagatgctg gatgcagctt gcaggctgat tctggacgaa 1500

gtctccctcc caggctcagc tccaggtggg agggtagaat tccggaggac tctcatcatc 1560

agcttcctct tcaagttcta cctgaaagtg tcacagattt tgaagatgag ggaccctgct 1620

cgctatccta gccttgcaga caagcatgcg agtgctttgg aggatcttca ttccagacat 1680

ccctggatta cactgaagta ccagaatgcg aacccaaagc agcttcctca agacccaatt 1740

ggccatcccg tcatgcatct gtccggcatt aagcacgcca cgggcgaggc cgtctactgt 1800

gatgacatgc ctaccgtgga ccgggaactg ttcctgacct tcgtaacaag ttcaagagct 1860

catgctaaga ttgtgtctat tgatctgtca gaggctctca gcctgcctgg tgtggtggac 1920

atcgtgactg aggaacatct tcatggcgtc aactccttct gccttttaac caaacctgag 1980

aaacttctgt cgacagatga ggtgttttgc gtgggtcagc ttgtctgtgc tgtgattgcc 2040

gattctgagg ttcaggcaaa gcgagctgca cagcgagtga agatcatcta ccgagatttg 2100

gagcctctga tcctaaccat cgaggaagca atacaacaca agtccttctt tgagcaagaa 2160

aagaaactgg agtatgggaa tgtggatgaa gcatttaaaa tggtggatca agttcttgaa 2220

ggtgaaatac acttgggcgg tcaagaacat ttttatatgg aaacccaaag catgcttgtt 2280

gttcccaaag gagaggatca agaaatggat gtctacgtgt ccacacagta tcccaaatac 2340

atacaggaca tagttgcttg gatcttgaag attccagcta acaaggtcat gtgtcacgta 2400

aagcgtgttg gcggggcttt cggggggaag gtgataaaaa ctggcatcat ggcagccatc 2460

accgcctttg ctgcaaacaa gcacggtcgt gcagttcgct gcattctaga gcgaggagaa 2520

gacatgttaa taactggagg ccgccaccct taccttggaa agtataaagt tggattcatg 2580

aacgatggca gaatcttggc cctggatatg gagcattata gtaatggagg cgcctccctg 2640

gatgagtcat tatttgtcgt ggagatggga cttctgaaaa tggaaaatgc ttacaagttt 2700

cccaacctgc gctgccgggc atgggcctgc agaaccaacc ttccatccaa cacagccttg 2760

cgagggtttg gctttcctca gacagggctt atcactgagt cctgtatcat ggaagttgca 2820

gccaaatgtg ggttgtctcc tgagaaggtt cgaacaataa acatgtacaa ggaaattgat 2880

cagacaccct acagacaaga gattgatgcc aagaacctga tccagtgttg gaaagaatgt 2940

atggccatgt cttcctatgc cctaaggaga accgctgtgg aaaaattcaa ctcagagaat 3000

tactggaaga aaaaggggct ggccgtggtc cccctgaagt atcctgtcgg caccggatca 3060

cttgctatgg gtcaggctgc tgccctggtt cacatttatc ttgatggatc tgtgctggtg 3120

actcacggtg gaattgaaat ggggcagggg gtccacacga aaatgcttca ggtggccagt 3180

cgtgagttga ggatgccatt gtccaacatc cacctgcgtg gaacaagcac agaaaccatc 3240

cctaatgcca atatctctgg agggtccgtg gtggccgacc tcaacgggtt ggctgtaaag 3300

gatgcttgcc agactcttct aaaacgcctt gaacccatca tcagcaagaa tcctggtggc 3360

acttggaaag actgggcaca ggctgctttt gatgaaagca ttagtctttc agctactgga 3420

tacttcaggg gttatgagtc gaacatgaac tgggaaaccg gtgaaggcca tcctttcgaa 3480

tactttgttt atggagctgc ctgttccgaa gttgaaatag actgcctgac aggtgctcat 3540

aagaacatca gaacagacat tgtcatggat gttggctaca gtataaatcc agcccttgac 3600

attggccaga tcgaaggtgc atttattcaa ggcatgggac tttacacaat agaggaactg 3660

aattattctc ctcagggtgt cctgtacagt cggggcccca gccagtataa aatccctgcc 3720

atctgtgatg tgcccgcgga gctgcacatt tccttcttgc ctccgtctca aaactcaaat 3780

accctgtact cgtctaaggg tctgggagag tctgggatgt tcctggggtg ttcagtgttt 3840

ttcgccatcc atgacgcaat aaatgcagcg cgacaggaga gaggcctgtc tggaccttta 3900

aagctcaata gtccactgac cccggagaag attagaatgg cctgtgaaga caaattcaca 3960

gaaatgattc caagagatga acctgggtcc tatgttcctt ggagtgtacc catatga 4017

<210> 2

<211> 948

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

Met Asp Gly Ala Ala Tyr Val Asn Gly Arg Lys Val Ile Lys Asn Val

1 5 10 15

Asn Thr Met Tyr Arg Lys Lys Arg Thr Gly Thr Lys Tyr Gly Cys Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys Thr Val Met Ile Ser Arg Tyr Asn Ile

35 40 45

Thr Lys Arg Ile Arg His Tyr Ala Asn Ala Cys Ile Ile Cys Ser Tyr

50 55 60

Gly Ala Ala Val Thr Thr Val Gly Ile Gly Ser Thr Arg Thr Arg Ile

65 70 75 80

His Val Arg Ile Ala Lys Cys His Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly Met

85 90 95

Val Met Ser Ile Tyr Thr Arg Asn His Thr Ser Thr Ala Gly Gly Asn

100 105 110

Cys Arg Cys Thr Gly Tyr Arg Ile Ile Asp Ala Cys Lys Thr Cys Lys

115 120 125

Thr Ser Gly Cys Cys Gly Lys Asn Val Cys Cys Asp Gly Ile Asn Gly

130 135 140

Gly Asn Thr Ser His Lys Ser Asp Thr Ile Val Thr Met Ala Lys Arg

145 150 155 160

Thr Arg Ile Gly Gly Asp Arg Met Thr Trp Ile Ser Val Thr Lys Ala

165 170 175

Lys Val Lys Tyr Ala Val Val Met Gly Asn Thr Ser Val Gly Asp Val

180 185 190

Lys Lys Gly Ile His Val Val Ile Ser Asp Ser Ile Met Ser Ile Val

195 200 205

Asn Tyr Thr Asp Asn Gly Thr Gly Ala Ala Ser Ala Val Lys Asp Ile

210 215 220

Ala Lys Val Ile Arg Lys Lys Thr Thr His Ala Trp Lys His Gly Thr

225 230 235 240

Ala Gly Ala Ile Arg Asn Met Ser Ser Gly Gly His Ile Val Ser Arg

245 250 255

His Asp Ser Asp Asn Ala Val Gly Asn Cys Thr Asn Ser Lys Gly Lys

260 265 270

Arg Ile Asn Lys Lys Cys Ser Ala Ser Lys Ile Ile Ser Val Asn Ile

275 280 285

Tyr Ser Arg Lys Trp Val Ser Ala Arg Ala Arg Asn Ala Ala Met Val

290 295 300

Asn Ser Gly Met Arg Val Gly Gly Asp Gly Val Ile Arg Ala Ile Ala

305 310 315 320

Tyr Gly Gly Val Gly Thr Thr Ile Cys Ala Lys Asn Ser Cys Ile Gly

325 330 335

Arg Trp Asn Met Asp Ala Ala Cys Arg Ile Asp Val Ser Gly Ser Ala

340 345 350

Gly Gly Arg Val Arg Arg Thr Ile Ile Ser Lys Tyr Lys Val Ser Ile

355 360 365

Lys Met Arg Asp Ala Arg Tyr Ser Ala Asp Lys His Ala Ser Ala Asp

370 375 380

His Ser Arg His Trp Ile Thr Lys Tyr Asn Ala Asn Lys Asp Ile Gly

385 390 395 400

His Val Met His Ser Gly Ile Lys His Ala Thr Gly Ala Val Tyr Cys

405 410 415

Asp Asp Met Thr Val Asp Arg Thr Val Thr Ser Ser Arg Ala His Ala

420 425 430

Lys Ile Val Ser Ile Asp Ser Ala Ser Gly Val Val Asp Ile Val Thr

435 440 445

His His Gly Val Asn Ser Cys Thr Lys Lys Ser Thr Asp Val Cys Val

450 455 460

Gly Val Cys Ala Val Ile Ala Asp Ser Val Ala Lys Arg Ala Ala Arg

465 470 475 480

Val Lys Ile Ile Tyr Arg Asp Ile Thr Ile Ala Ile His Lys Ser Lys

485 490 495

Lys Tyr Gly Asn Val Asp Ala Lys Met Val Asp Val Gly Ile His Gly

500 505 510

Gly His Tyr Met Thr Ser Met Val Val Lys Gly Asp Met Asp Val Tyr

515 520 525

Val Ser Thr Tyr Lys Tyr Ile Asp Ile Val Ala Trp Ile Lys Ile Ala

530 535 540

Asn Lys Val Met Cys His Val Lys Arg Val Gly Gly Ala Gly Gly Lys

545 550 555 560

Val Ile Lys Thr Gly Ile Met Ala Ala Ile Thr Ala Ala Ala Asn Lys

565 570 575

His Gly Arg Ala Val Arg Cys Ile Arg Gly Asp Met Ile Thr Gly Gly

580 585 590

Arg His Tyr Gly Lys Tyr Lys Val Gly Met Asn Asp Gly Arg Ile Ala

595 600 605

Asp Met His Tyr Ser Asn Gly Gly Ala Ser Asp Ser Val Val Met Gly

610 615 620

Lys Met Asn Ala Tyr Lys Asn Arg Cys Arg Ala Trp Ala Cys Arg Thr

625 630 635 640

Asn Ser Asn Thr Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ile Thr Ser Cys Ile Met

645 650 655

Val Ala Ala Lys Cys Gly Ser Lys Val Arg Thr Ile Asn Met Tyr Lys

660 665 670

Ile Asp Thr Tyr Arg Ile Asp Ala Lys Asn Ile Cys Trp Lys Cys Met

675 680 685

Ala Met Ser Ser Tyr Ala Arg Arg Thr Ala Val Lys Asn Ser Asn Tyr

690 695 700

Trp Lys Lys Lys Gly Ala Val Val Lys Tyr Val Gly Thr Gly Ser Ala

705 710 715 720

Met Gly Ala Ala Ala Val His Ile Tyr Asp Gly Ser Val Val Thr His

725 730 735

Gly Gly Ile Met Gly Gly Val His Thr Lys Met Val Ala Ser Arg Arg

740 745 750

Met Ser Asn Ile His Arg Gly Thr Ser Thr Thr Ile Asn Ala Asn Ile

755 760 765

Ser Gly Gly Ser Val Val Ala Asp Asn Gly Ala Val Lys Asp Ala Cys

770 775 780

Thr Lys Arg Ile Ile Ser Lys Asn Gly Gly Thr Trp Lys Asp Trp Ala

785 790 795 800

Ala Ala Asp Ser Ile Ser Ser Ala Thr Gly Tyr Arg Gly Tyr Ser Asn

805 810 815

Met Asn Trp Thr Gly Gly His Tyr Val Tyr Gly Ala Ala Cys Ser Val

820 825 830

Ile Asp Cys Thr Gly Ala His Lys Asn Ile Arg Thr Asp Ile Val Met

835 840 845

Asp Val Gly Tyr Ser Ile Asn Ala Asp Ile Gly Ile Gly Ala Ile Gly

850 855 860

Met Gly Tyr Thr Ile Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ser Arg Gly Ser Tyr

865 870 875 880

Lys Ile Ala Ile Cys Asp Val Ala His Ile Ser Ser Asn Ser Asn Thr

885 890 895

Tyr Ser Ser Lys Gly Gly Ser Gly Met Gly Cys Ser Val Ala Ile His

900 905 910

Asp Ala Ile Asn Ala Ala Arg Arg Gly Ser Gly Lys Asn Ser Thr Lys

915 920 925

Ile Arg Met Ala Cys Asp Lys Thr Met Ile Arg Asp Gly Ser Tyr Val

930 935 940

Trp Ser Val Ile

945

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccacmatg gamsggg 17

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgtgacact tccaggtaga ac 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtgtcagcc ttccgacaag 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctgtgttgg atggaaggtt g 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggcagaat cttggccct 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcatatgggt acactccaag ga 22

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caagcttcta tggacggggc ggcggag 27

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ataagaatgc ggccgctcat atgggtacac tccaag 36

Claims

1.猪醛氧化酶1基因，其特征在于所述猪醛氧化酶1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.一种如权利要求1所述醛氧化酶1基因所编码的具有生物活性的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3.一种重组表达载体，包含权利要求1所述的猪醛氧化酶1基因。

4.一种包含权利要求3所述重组表达载体的宿主系统。

5.一种催化组合剂，包含如权利要求2所述具有生物活性的蛋白。

6.根据权利要求5所述催化组合剂，其特征在于所述催化组合剂在催化醛类氧化成相应羧酸中的应用。

7.一种如权利要求1所述猪醛氧化酶1基因的制备方法，其特征在于：以猪肝组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的3对上、下游引物及相应序列分别为：F1：SEQ ID NO：3； R1：SEQ ID NO：4；F2：SEQ ID NO：5； R2：SEQ ID NO：6；F3：SEQ ID NO：7；

R3：SEQ ID NO：8。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于所述PCR扩增的反应的条件为：98℃预变性2 min，然后98℃变性30 s，55℃退火15 s，68℃延伸30 s，共35个循环，最后68℃复延伸10 min，得如SEQ ID NO：1所示猪醛氧化酶1基因。