CN110484547A

CN110484547A - 桃多胺氧化酶PpPAO1基因、其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN110484547A
Application number: CN201910830609.4A
Authority: CN
Inventors: 王伟; 冯建灿; 郑先波; 谭彬; 程钧; 叶霞; 李继东; 李志谦; 张郎郎; 王小贝
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-09-04
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2039-09-04
Also published as: CN110484547B

Abstract

本发明公开了桃多胺氧化酶PpPAO1基因、其编码蛋白和应用，本发明通过克隆桃多胺氧化酶基因的家族成员得到PpPAO1，并分析了该基因在桃果实发育和成熟过程中的表达模式，利用VIGS技术诱导PpPAO1基因沉默，抑制多胺分解，从而抑制乙烯等与成熟相关基因的表达，延缓果实成熟。对进一步实现有针对性的品质和性状改良，培育耐贮运的桃新品种，具有积极的指导作用。

Description

桃多胺氧化酶PpPAO1基因、其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及桃多胺氧化酶PpPAO1基因、其编码蛋白和应用。

背景技术

桃是呼吸跃变型果实，成熟过程中释放大量乙烯，呼吸强度急剧上升，果实迅速软化，不耐贮运。目前常用的延长桃果实储存的方法包括低温贮藏和气调贮藏等，但是这些方法都是通过改变外界条件来实现。如果能利用基因工程对现有的桃品种进行改进，繁育出能够耐贮运的桃品种，对于桃的品质和性状改良具有十分重要的意义。

多胺(Polyamine，PA)是广泛存在于各类生物体中的低分子量脂肪族含氮生物碱，常见的有腐胺(Putrescine，Put)、尸胺(Cadavarine，Cad)、亚精胺(Spermidine，Spd)、精胺(Spermine，Spm)等，此外还有多种稀有多胺如降精胺(Norspermine，Nspm)、降亚精胺(Norspermidine，Nspd)等。在植物体内，其参与多种生理过程，包括细胞分化、形态建成、营养生长和生殖发育以及衰老等，并且在抵御生物胁迫和非生物胁迫中发挥着重要作用。

多胺的降解依赖于胺氧化酶的作用，目前已知的胺氧化酶有两种：一种是依赖Cu² ⁺、以磷酸吡咯醛为辅酶的二胺氧化酶(Diamine oxidase，DAO)，其催化腐胺和尸胺氧化分解，催化腐胺生成4-氨基正丁醛、H₂O₂和氨；另一种是依赖黄素腺嘌呤二核苷酸的多胺氧化酶(Polyamine oxidase，PAO)。PAO可催化Spd、Spm的终端氧化分解，分别生成4-氨基正丁醛或3-氨丙基-4-氨基正丁醛，同时生成代谢终产物1，3-丙二胺(Dap)和H₂O₂，如玉米多胺氧化酶ZmPAO；也可催化Spd向Put或Spm向Spd的逆转化分解代谢，同时伴随着H₂O₂的生成，如哺乳动物的精胺氧化酶和拟南芥中的多胺氧化酶PAO1-PAO5；此外，还有一类PAO也具有相似的多胺氧化酶结构域，但并不催化多胺的脱氨基作用。PAO通过降解多胺产生的H₂O₂与植物密切相关，调节包括细胞伸长、极性生长、向地生长、气孔活动和花的发育等植物生长发育进程以及参与植物对生物胁迫和非生物胁迫的应答。

目前研究发现多胺可以抑制乙烯生成，延缓桃果实成熟软化。研究表明多胺与乙烯具有共同的合成前体ACC，在果实成熟中具有拮抗作用。同时多胺可以抑制细胞壁降解相关酶活性，保持果实硬度。桃果实发育前期多胺含量较高，随着果实成熟多胺含量逐渐降低。分析发现桃成熟过程中多胺合成基因ADC、SAMDC表达水平逐渐升高，暗示多胺分解导致桃果实多胺含量降低，并且多胺分解在桃成熟中发挥重要作用。并且，公开号为CN103421749A的中国发明专利公开了棉花多胺氧化酶GhPAO2基因，该基因能够提高宿主菌的耐盐性，但目前关于桃多胺氧化酶在桃成熟中作用的研究尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供桃(Prunus persica L.)多胺氧化酶PpPAO1基因及其编码蛋白在促进果实成熟中的应用。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

桃多胺氧化酶PpPAO1基因，其DNA分子是如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或能够与序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述桃多胺氧化酶PpPAO1基因编码的蛋白，它是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

其中，序列中的SEQ ID NO.1由1518个碱基组成，自5’端第1位碱基为转录起始位点，至第1518位碱基为转录终止位点，完整编码框为1518个碱基，编码505个氨基酸。

并且含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因细胞系以及含有所述载体的宿主细胞也落入本发明的保护范围之内。

本发明中术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。其中，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株。

本发明还提供了上述桃多胺氧化酶PpPAO1基因或其蛋白在促进果实成熟中的应用。

本发明还提供了上述基因或蛋白在获得转基因植株中的应用。

作为本发明的一种实施方式，将多核苷酸通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到植物细胞中，使所述的植物细胞表达所述的桃多胺氧化酶PpPAO1基因。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达所述多肽的植物。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：茄科、十字花科、蔷薇科、葡萄科的植物。比如，所述的“植物”包括但不限于：茄科的烟草和番茄；十字花科的拟南芥、蔷薇科的苹果、草莓；葡萄科的葡萄等。

同时本发明还提供了通过抑制桃多胺氧化酶PpPAO1基因或其蛋白的表达在延缓果实成熟中的应用，比如通过沉默桃果实该基因达到延缓桃果实成熟的目的，从而延长其保存时间，采用这种方法可以获得品质和性状优良，耐贮运的桃新品种。

另外需要说明的是，本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述桃多胺氧化酶PpPAO1基因，还包括与SEQ ID NO：1具有较高同源性(如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基因。

本发明具有如下优点：

1、本发明通过克隆桃多胺氧化酶基因的家族成员得到PpPAO1，并分析了该基因在桃果实发育和成熟过程中的表达模式，最后用VIGS技术验证目的基因在桃果实成熟中的功能，有利于从分子机制上阐明在桃成熟过程中的多胺信号的响应机制，对进一步实现有针对性的品质和性状改良，培育耐贮运的桃新品种，具有积极的指导作用。

2、相对于其它采用外源多胺处理研究多胺在果实成熟中的作用的相关报道，PpPAO1基因在桃果实成熟过程中促进多胺分解，解除多胺对乙烯等与成熟相关基因的表达抑制，从而促进果实的成熟。利用VIGS技术诱导PpPAO1基因沉默，抑制多胺分解，从而抑制乙烯等与成熟相关基因的表达，延缓果实成熟。

3、本发明还能从桃分离出桃多胺氧化酶PpPAO1基因的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得转基因植株，促进果实提早成熟，缩短栽培管理时间，提前上市，因此该基因也可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1是桃多胺氧化酶PpPAO1基因的PCR扩增电泳图。

图2是桃多胺氧化酶基因PpPAO家族成员和玉米ZmPAO氨基酸多序列比对图。

图3是桃多胺氧化酶基因家族成员在桃不同组织中的表达模式；图中，PpPAO1、PpPAO2、PpPAO3、PpPAO4分别表示桃多胺氧化酶家族4个PAO基因。

图4是桃多胺氧化酶基因家族成员在桃果实发育和成熟过程中的表达模式；图中PpPAO1、PpPAO2、PpPAO3、PpPAO4分别表示桃多胺氧化酶家族4个PAO基因，S1表示花后30天、S2表示花后50天、S2/S3表示花后60天、S3/S4表示花后80天、S4表示花后90天。

图5是‘黄水蜜’桃果实发育及成熟中多胺浓度检测。

图6是桃多胺氧化酶基因PpPAO1超量表达重组载体图。

图7是桃多胺氧化酶基因PpPAO1转基因烟草阳性植株检测及过氧化氢和多胺含量检测；图中，M、WT、EV、OE PpPAO1分别表示marker、野生型烟草、转化pRI-101空载质粒烟草、超量表达PpPAO1基因烟草。

图8是VIGS诱导桃多胺氧化酶基因PpPAO1在桃果实中沉默后的表型观察及果实硬度测定；图中，TRV2、TRV2-PpPAO1分别表示转化TRV2空载质粒果实(对照)和诱导PpPAO1基因沉默果实。

图9是VIGS诱导桃多胺氧化酶基因PpPAO1在桃果实中沉默后的呼吸作用强度和乙烯释放量测定；图中，TRV2、TRV2-PpPAO1分别表示转化TRV2空载质粒果实(对照)和诱导PpPAO1基因沉默果实。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

本发明中‘黄水蜜’由河南农业大学“河南省果树瓜类生物学重点实验室”提供，品种详细信息可以参见“早中熟鲜食黄桃新品种‘黄水蜜’”(李靖等，园艺学报，2005，32(4)，756)。

实施例一桃多胺氧化酶基因PpPAO1的分离和鉴定

1、PpPAO1基因的分离

利用植物多糖多酚试剂盒(DP441，天根生化科技(北京)有限公司)提取桃果肉RNA，通过反转录试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)获得单链cDNA，以单链cDNA为模版，以下述序列为引物，通过PCR(试剂盒FastStart SYBR Green Master购于罗氏生物科技有限公司)获得基因PpPAO1的全长序列，PCR扩增电泳图如图1所示。基因PpPAO1的全长序列如SEQ ID NO.1所示，共1518bp，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共编码505个氨基酸序列。桃PpPAO家族成员与玉米ZmPAO氨基酸序列进行多序列比对结果如图2。

PpPAO1基因克隆引物序列为：

正向PpPAO1-F：5′-ATATCGACACCGACTCCCGCTATTTC-3′；

反向PpPAO1-R：5′-CGGAATTCTTCGTAAACGGCATCACG-3′。

PCR的退火温度为60℃。

2、PpPAO家族基因表达分析

荧光定量PCR操作步骤：采用多糖多酚RNA提取试剂盒SK8662(生工，上海)提取‘黄水蜜’花、幼果、幼叶、成熟叶和不同发育时期桃果实的总RNA，采用反转录试剂盒KR106(天根，北京)合成cDNA，并以此为模板，使用Lignt-Cycler 480II荧光定量仪进行qRT-PCR检测，采用SYBR Green I Master(Roche，瑞士)进行扩增反应。

反应总体积15μL，包括100ng cDNA(1μL)，2×Lightcycler 480 SYBR Green IMaster(7.5μL)，0.5μmol·L^-1上、下游引物(各0.75μL)和无RNA酶水(5μL)。

反应程序：95℃预变性，5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环。每个样品3次重复。采用Primer Express 3.0分别对各个转录本序列的设计特异性引物。

定量引物序列为：

正向Q PpPAO1-F：5′-ACTCGTACAAGAAGGCCGTG-3′；

反向Q PpPAO1-R：5′-TGGCGTAGAAGACGATTCGG-3′。

正向Q PpPAO2-F：5′-GCCTTATGGTCAGGGGCTAC-3′；

反向Q PpPAO2-R：5′-AAGCACACCGAGAGGAACAG-3′。

正向Q PpPAO3-F：5′-TAGGCTTCGAGCACCTTTGG-3′；

反向Q PpPAO3-R：5′-TGCTTCGAGGACTTCATCCG-3′。

正向Q PpPAO4-F：5′-CACTTGAGTCTGAGCAGCCA-3′；

反向Q PpPAO4-R：5′-ATGGGGTCTACCAGAGTGGG-3′。

采用qRT-PCR检测PpPAO基因在‘黄水蜜’果实不同发育期的表达情况。采样时间点为S1时期、S2时期、S2/S3时期、S3时期、S3/S4时期、S4时期。选取Actin(ppa007242m)作为内参基因(Brandi et al.，2011)，用2^-ΔΔCt公式计算基因相对表达量(Livak andSchmittgen，2001)，结果如图3和图4所示。

从图3可以看出，PpPAO1基因在花、果实、叶片等不同组织中均有表达，其中在花和成熟叶中表达量较高，而在幼果中表达量最低。

从图4可以看出，PpPAO1基因随着果实发育成熟表达量迅速升高，在成熟期表达量达到最高。

3、‘黄水蜜’果实不同发育时期多胺浓度检测

取0.3g组织用液氮迅速磨成粉末，转移至2mL离心管，加入1mL预冷的5％高氯酸(0.05g/100mL比例加入二硫苏糖醇，DTT)，充分涡旋后于冰上浸提1h，注意避光。4℃，12000r/min离心15min，取1mL上清液于新的2mL离心管，沉淀再加入1mL 5％高氯酸，充分涡旋后于冰上浸提1h。4℃，12000r/min离心15min，取1mL上清液与上次取出的上清液混合，4℃，12000r/min离心5min充分混匀。吸取1mL上清液加入10mL离心管，然后在通风厨依次加入50μL 1M的1，6-己二胺(内标)，1mL 2M的NaOH，10μL苯甲酰氯。涡旋30sec后于37℃水浴20min。取1mL乙醚相于新的1.5mL离心管，于真空浓缩仪干燥30min。干燥后加入500μL色谱级甲醇(Fisher，美国)溶解，采用0.22μm有机滤膜过滤，然后上样检测。多胺提取完成后采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，测定使用安捷伦高效液相色谱系统(Agilent 1200，美国)，检测波长为230nm，并采用安捷伦C₁₈反向色谱柱(4.6mm×150mm，particle size 5μm)。使用甲醇和水作为洗脱液，设定0.7mL/min流速室温下进行梯度洗脱。

多胺测定结果如图5所示，腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)含量在S1到S3时期均呈现出显著降低趋势，而在S3到S4时期趋于稳定并略有降低，整体呈较低水平。说明多胺含量在桃果实发育成熟过程显著降低。

实施实例二PpPAO1基因在桃果实成熟中的作用

为研究PpPAO1基因是否参与到桃成熟过程中，通过转基因烟草和VIGS技术沉默桃果实该基因来分析鉴定其功能。

2.1构建重组载体

(1)超量表达载体构建

设计带有限制性酶位点的特异引物扩增PpPAO1基因CDS序列，通过双酶切和连接重组将PpPAO1基因整合到超量表达载体pRI-101上，构建35S：：PpPAO1重组质粒。引物序列如下：

PpPAO1-F：5’-CATATGCCCGTCGACCCCGGGATAGTCGACATGGAGTCCCCTTCTCGCTCC-3’

PpPAO1-R：5’-TCAGAATTCGGATCCGGTACCACGGAATTCCTATAGGTCCACATAGTCATA-3’

重组载体构建模式图见图6。

(2)VIGS载体构建

设计带有限制性酶切位点的特异引物，扩增PpPAO1基因cDNA非保守区200-400bp片段，利同源重方法将所扩增片段插入到TRV2载体中，构建完成pTRV2-PpPAO1重组质粒。引物序列如下：

PpPAO1-TRV1F：5’-ATTCTGTGAGTAAGGTTACCGAATTCAGATTTCGGAGGCTTGTCGG-3’

PpPAO1-TRV1R：5’-TCTTCGGGACATGCCCGGGCCTCGAGTGGCGTAGAAGACGATTCGG-3’

2.2瞬时转化烟草

利用瞬时转化技术将含有重组质粒的农杆菌菌液注射到本氏烟草叶片，26℃，16h光照/8h黑暗条件培养48h后对转基因材料进行鉴定，测定转基因材料多胺和H₂O₂含量。验证PpPAO1基因在多胺分解中的功能。转基因烟草阳性检测和PpPAO1基因表达分析如图7A、7B所示。烟草过氧化氢(H₂O₂)检测见图7C所示，可见PpPAO1转基因烟草染色明显深与空载对照，说明H₂O₂含量高于对照。多胺含量检测如图7D，转基因烟草Put、Spd和Spm含量均显著低于对照水平，说明PpPAO1基因参与多胺末端分解代谢。

2.3VIGS诱导桃果实PpPAO1基因沉默

VIGS(病毒诱导的基因沉默)诱导桃果实基因沉默方法参见Wang等(Wang et al.，2013.Plant Physiology，162，885-896；Li et al.，2017.Plant Science，257，63-73)。同时将构建好的沉默表达载体pTRV2-PpPAO1和pTRV2菌液等量混合后，利用注射法将含有重组质粒的农杆菌菌液接种到盛花后50d和70d的‘黄水蜜’桃实靠近果柄的果肉中，每个果实均匀选取3处注射。在果实商品成熟期(约花后90d)采样。以注射针孔所在位置为中心，用手术刀切取半径约1cm的侵染区域果实，利用qRT-PCR技术检测PpPAO1基因的沉默效率。采用以接种pTRV1、pTRV2和未接种的果实为对照。选择PpPAO1基因沉默效率高的接种时间果实开展耐贮性分析。

VIGS诱导PpPAO1基因沉默后桃果实表型如图8A所示，与空载对照相比，转基因果实注射位点颜色明显偏绿，说明果实成熟被延缓了。

2.4沉默PpPAO1基因对桃果实硬度、呼吸强度和乙烯释放量的影响

为了进一步验证沉默PpPAO1基因对桃果实成熟的影响，进一步检测了桃果实硬度、呼吸强度和乙烯释放量。果实硬度测定如图8B所示，连续测定了采后7d的果实硬度变化。可见转基因果实硬度显著高于对照果实，说明沉默PpPAO1基因显著延缓了桃果实软化。果实呼吸强度测定如图9A所示，转基因果实呼吸速率显著低于对照，说明沉默PpPAO1基因显著降低了桃果实呼吸强度。乙烯释放量如图9B所示，转基因果实与对照相比乙烯含量无显著差异，说明沉默PpPAO1基因对桃乙烯释放无明显影响。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 桃多胺氧化酶PpPAO1基因、其编码蛋白和应用

<130> 2019

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1518

<212> DNA

<213> Prunus persica L.

<400> 1

atggagtccc cttctcgctc ctccgtcatc atcgtcggtg ccggagtctc cggtttatcg 60

gcggcgaagg ttttgatcga gaacggcgtg gaggacgtag tgattctgga agcttcagac 120

cgtatcggcg gcaggatccg aaaacaagat ttcggaggct tgtcggtgga gctcggcgcc 180

ggctggatag tcggcgtcgg aggcagagag tcgaacccgg tctgggagct tgcccagaaa 240

tcgaatctcc gcactttctt ctccgattac agcaatgctc gcttcaacat ctacgatcaa 300

agtgggaaga tatttccgag tggaatcgcc gcggactcgt acaagaaggc cgtggagtcg 360

gcgatgcaaa agctgaagaa gtctgaagcc gactcttgct atggtggtgg cgacgtcacc 420

aaagccgccg aatcgtcttc tacgccaaaa acgccgatag agctggctat tgatttcatc 480

ctgcacgatt ttgagatgcc agaaggtgag cccatatcaa cattccaaga ctttggagaa 540

cgagagtttt tagtggcgga tgaaagaggg tatgagcatc tgctatacaa aatggctgga 600

gaatttcttt tcacctctga gggtaaactg ttggacaatc gtctcaagtt caacaaggtt 660

gttcgggagt tgcagcactc gagaaacggc gttacggtaa tgacggagga tggttgcgtc 720

tacgaagcaa gttacgtgat tttgtctgtt agcattggcg ttctccaaag cgagctcatt 780

gccttcaatc cacctttgcc caggtggaaa actgaggcta tacagaaatg tgatgtaata 840

gtgtacacaa agatctttct caagttccct tataagttct ggccttgtgg cccaggaaaa 900

gagtttttca tctatgccca tgagcggaga ggctactaca cattttggca gcacatggag 960

aatgcatatc ctggatccaa tatactggtc gtgacgttga cgaatgagga atcaaagcgt 1020

gtggaagctc agtctgataa ggaaacattg aaagaagcca tgggggctct tagggacatg 1080

tttggactca acattcctga agctactgat atatttgtac ctcggtggtg gaacaatagg 1140

ttccagcgag gcagctatag caactaccca gtaatctcta atggccaagt tgttcgtgac 1200

atcaaggccc cattaggctg catcttcttc agtggggaac acacaagcga gagatatagc 1260

ggctatgtcc atggcggata ccttgcaggt attgagacgg gtaaagcttt gctggaagaa 1320

atagaaaagg aaaaagaaag gagtattgag agtgagaatc aaacattttt gttagaaccc 1380

ttgcttgcat tgactggttc attaagtttg acgcaaaacg atgctgtatc gagtctcaaa 1440

tgcgatattc ctagacaatt gtatctaagt ggcaaagttg gcgccccgga gctatattat 1500

gactatgtgg acctatag 1518

<210> 2

<211> 505

<212> PRT

<213> Prunus persica L.

<400> 2

Met Glu Ser Pro Ser Arg Ser Ser Val Ile Ile Val Gly Ala Gly Val

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ser Ala Ala Lys Val Leu Ile Glu Asn Gly Val Glu Asp

20 25 30

Val Val Ile Leu Glu Ala Ser Asp Arg Ile Gly Gly Arg Ile Arg Lys

35 40 45

Gln Asp Phe Gly Gly Leu Ser Val Glu Leu Gly Ala Gly Trp Ile Val

50 55 60

Gly Val Gly Gly Arg Glu Ser Asn Pro Val Trp Glu Leu Ala Gln Lys

65 70 75 80

Ser Asn Leu Arg Thr Phe Phe Ser Asp Tyr Ser Asn Ala Arg Phe Asn

85 90 95

Ile Tyr Asp Gln Ser Gly Lys Ile Phe Pro Ser Gly Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ser Tyr Lys Lys Ala Val Glu Ser Ala Met Gln Lys Leu Lys Lys Ser

115 120 125

Glu Ala Asp Ser Cys Tyr Gly Gly Gly Asp Val Thr Lys Ala Ala Glu

130 135 140

Ser Ser Ser Thr Pro Lys Thr Pro Ile Glu Leu Ala Ile Asp Phe Ile

145 150 155 160

Leu His Asp Phe Glu Met Pro Glu Gly Glu Pro Ile Ser Thr Phe Gln

165 170 175

Asp Phe Gly Glu Arg Glu Phe Leu Val Ala Asp Glu Arg Gly Tyr Glu

180 185 190

His Leu Leu Tyr Lys Met Ala Gly Glu Phe Leu Phe Thr Ser Glu Gly

195 200 205

Lys Leu Leu Asp Asn Arg Leu Lys Phe Asn Lys Val Val Arg Glu Leu

210 215 220

Gln His Ser Arg Asn Gly Val Thr Val Met Thr Glu Asp Gly Cys Val

225 230 235 240

Tyr Glu Ala Ser Tyr Val Ile Leu Ser Val Ser Ile Gly Val Leu Gln

245 250 255

Ser Glu Leu Ile Ala Phe Asn Pro Pro Leu Pro Arg Trp Lys Thr Glu

260 265 270

Ala Ile Gln Lys Cys Asp Val Ile Val Tyr Thr Lys Ile Phe Leu Lys

275 280 285

Phe Pro Tyr Lys Phe Trp Pro Cys Gly Pro Gly Lys Glu Phe Phe Ile

290 295 300

Tyr Ala His Glu Arg Arg Gly Tyr Tyr Thr Phe Trp Gln His Met Glu

305 310 315 320

Asn Ala Tyr Pro Gly Ser Asn Ile Leu Val Val Thr Leu Thr Asn Glu

325 330 335

Glu Ser Lys Arg Val Glu Ala Gln Ser Asp Lys Glu Thr Leu Lys Glu

340 345 350

Ala Met Gly Ala Leu Arg Asp Met Phe Gly Leu Asn Ile Pro Glu Ala

355 360 365

Thr Asp Ile Phe Val Pro Arg Trp Trp Asn Asn Arg Phe Gln Arg Gly

370 375 380

Ser Tyr Ser Asn Tyr Pro Val Ile Ser Asn Gly Gln Val Val Arg Asp

385 390 395 400

Ile Lys Ala Pro Leu Gly Cys Ile Phe Phe Ser Gly Glu His Thr Ser

405 410 415

Glu Arg Tyr Ser Gly Tyr Val His Gly Gly Tyr Leu Ala Gly Ile Glu

420 425 430

Thr Gly Lys Ala Leu Leu Glu Glu Ile Glu Lys Glu Lys Glu Arg Ser

435 440 445

Ile Glu Ser Glu Asn Gln Thr Phe Leu Leu Glu Pro Leu Leu Ala Leu

450 455 460

Thr Gly Ser Leu Ser Leu Thr Gln Asn Asp Ala Val Ser Ser Leu Lys

465 470 475 480

Cys Asp Ile Pro Arg Gln Leu Tyr Leu Ser Gly Lys Val Gly Ala Pro

485 490 495

Glu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Val Asp Leu

500 505

Claims

1.桃多胺氧化酶PpPA01基因，其特征在于，其DNA分子是如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或能够与序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.权利要求1所述桃多胺氧化酶PpPA01基因编码的蛋白，其特征在于，它是SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述基因的表达载体、重组载体或转基因细胞系。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.权利要求1所述的桃多胺氧化酶PpPA01基因或权利要求2所述的蛋白在促进果实成熟中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因或蛋白在获得转基因植物中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物包括茄科、十字花科、蔷薇科、葡萄科。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物包括烟草、番茄、拟南芥、苹果、草莓、葡萄。

9.抑制权利要求1所述的桃多胺氧化酶PpPA01基因或权利要求2所述的蛋白的表达在延缓果实成熟中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，抑制所述基因或蛋白的表达在桃育种过程中的作用。