CN110305893A - 棉酚生物合成途径因cyp71be79及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及棉酚生物合成途径基因CYP71BE79及其应用。揭示了一个参与棉花中棉酚生物合成途径的酶：细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79。其能在棉花的棉酚合成途径中间体8‑羟基‑7‑羰基‑δ‑杜松烯上增加一个羟基，获得中间体化合物8,11‑二羟基‑7‑羰基‑δ‑杜松烯。CYP71BE79可以作为调节棉花的棉酚性状和/或感病表型的靶标，为棉花的改良育种提供新的途径。

Description

棉酚生物合成途径因CYP71BE79及其应用

技术领域

本发明属于植物学及生物技术领域，更具体地，本发明涉及棉酚生物合成途径基因CYP71BE79及其应用。

背景技术

棉花是世界上最重要的经济作物之一，其植株通过在地上部分的腺体和根的表皮层中积累大量棉酚等化合物，来保护植物减少病菌侵染和昆虫取食。另一方面，棉酚是一类具有普遍毒性的多酚类化合物，是一种危害细胞、血管及神经的有毒物质，严重影响棉子油和棉子饼的食用和饲料应用价值。通过提高棉株叶片的棉酚含量，可以增强棉花的抗病虫害能力；而特异降低棉仁中的棉酚含量，可以使棉籽得到有效利用。传统的育种手段难以满足棉花实现高产、抗虫、同时植株高酚，种子低酚的目标。

在棉花体内，棉酚通过倍半萜合成途径进行合成，目前已经有一些棉酚合成的途径被分离鉴定，法尼基焦磷酸合酶(FPS)合成倍半萜类化合物的共同前体FPP，(+)-δ-杜松烯合酶[(+)-δ-cadinene synthase，CDNC]催化FPP生成(+)-δ-杜松烯[(+)-δ-cadinene]，(+)-δ-杜松烯-7-羟化酶[(+)-δ-cadinene-7-hydroxylase，CYP706B1]催化(+)-δ-杜松烯C7位上的羟基化反应生成7-羟基-(+)-δ-杜松烯(7-hydroxy-(+)-δ-cadinene)，目前还有多个P450羟化酶、脱氢酶、氧化酶等棉酚生物合成途径中的重要功能基因尚未被克隆鉴定。这些关键基因的克隆和功能验证对棉酚等次生代谢调控研究具有重要理论意义，为今后棉籽低酚性状的转基因工程提供了必要基因。棉籽特异低酚而植株高棉酚含量的转基因棉花具有重大应用价值，美国已进入了田间试验。棉酚性状的改良对棉花生产的可持续发展具有重要意义，棉酚代谢途径中的关键功能基因的克隆鉴定和转基因利用是实现这一目标的重要途径。

发明内容

本发明的目的在于提供棉酚生物合成途径因CYP71BE79及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种调节棉花的棉酚性状或感病表型的方法，所述方法包括：调节棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性。

在一个优选例中，所述的调节棉花的棉酚性状是降低棉花的棉酚或半棉酚酮含量，包括下调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性。

在另一优选例中，将下调细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79表达的抑制分子转化植物。

在另一优选例中，所述的抑制分子是以细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，以细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79基因中第1085～1328位核苷酸作为沉默靶标，如用于构建VIGS时的靶标。

在另一优选例中，所述的调节棉花的棉酚性状是增加棉花的棉酚或半棉酚酮含量，包括上调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性。

在另一优选例中，所述的调节棉花的感病表型是降低棉花的感病率，包括上调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性。

在另一优选例中，将上调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性分子转化植物。

在另一优选例中，所述的分子是重组表达(或过表达)细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达构建物或表达载体。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79选自下组：(a)具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(b)将(a)多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有(a)多肽的活性的由(a)衍生的多肽；(c)氨基酸序列与(a)多肽所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％；更佳地≥95％；如98％，99％)，并具有(a)多肽的活性的衍生的多肽；(d)在(a)或(b)或(c)所述多肽序列中添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的多肽。

在本发明到另一方面，提供一种催化合成棉酚生物合成途径的中间体化合物的方法，包括：以8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯作为底物，以细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79催化，获得增加一个羟基的产物，其是中间体化合物8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯。

在本发明到另一方面，提供细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的用途，用于作为调节棉花的棉酚性状或感病表型的靶标，制备棉酚性状改良的棉花。

在一个优选例中，所述的调节为降低棉花的棉酚或半棉酚酮含量，包括下调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性。

在另一优选例中，所述的调节为增加棉花的棉酚或半棉酚酮含量、或降低棉花的感病率，包括上调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性。

在本发明到另一方面，提供细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的用途，用于在8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯上增加一个羟基，获得中间体化合物8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯。

在一个优选例中，所述的用途为在体用途或离体用途，所述的离体用途包括工业生产，如工业生产(包括发酵生产)棉酚或其中间体(如半棉酚酮)。

在本发明到另一方面，提供细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的用途，用于作为棉花棉酚性状或感病表型的分子标记。

在本发明到另一方面，提供8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯的用途，用于促进植物染病；较佳地，所述的植物为有害植物或不利于农作物种植或生长的植物，包括杂草。

在本发明到另一方面，提供一种用于促进植物染病的农药组合物，其中包含8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯和农药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述的农药组合物中还包括植物侵染菌；所述的植物侵染菌包括：丁香假单孢杆菌，纹枯病菌。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、棉酚合成途径相关基因的表达及其与棉酚合成的相关性。

(A)棉酚合成途径相关基因VIGS植株叶片的半棉酚酮和棉酚含量测定及相关基因表达水平检测。其中VIGS的生物学重复n＝8。

(B)棉酚合成途径相关基因在有酚棉(G)和无酚棉(GL)的真叶中差异表达。

(C)棉酚合成途径相关基因在胚珠发育的过程中表达情况。

(D)～(E)棉酚合成途径相关基因在无酚棉(D)和无酚棉(E)子叶中的基因表达均能被大丽轮枝杆菌激发子(VdNEP)诱导。

图2、CYP71BE79的功能鉴定。VIGS-CYP71BE79植株叶片中通过LC-MS检测发现有8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯(8-hydroxy-7-keto-δ-cadinene)的积累。

图3、CYP71BE79的底物结构鉴定。8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯的¹H NMR(A)，¹³C NMR(B)和二维核磁共振谱数据(C、D)。

图4、CYP71BE79的产物结构鉴定。8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯的1H NMR(A)，13C NMR(B)and DEPT(C)数据和二维核磁共振谱数据(D、E)。

图5、CYP71家族成员和CYP71BE亚家族成员的进化树分析。基于CYP71家族成员蛋白序列构建9个物种系统发育树。

(A)以CYP71BE79为种子序列，identity设置为40％以上，blastp搜索比对9个陆地植物的CYP71家族成员；其中，绿色亚分支为CYP71BE79家族成员(贝叶斯树与极大似然法树相似)。

(B)5个锦葵科种CYP71BE亚家族成员系统发育树。CYP71BE79以单拷贝形式特异存在于5个锦葵科物种中。

图6、CYP71BE79的底物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯的生物学功能研究。

(A)VIGS-CYP71BE79植株的易感病表型(根和下胚轴交界处出现棕色感病损伤)，其中对照为空载(Vector control)、VIGS-PGF。表型照片拍摄于VIGS后第20天。

(B)VIGS植株感病率统计。n＝20，三次独立生物学重复。

(C)VIGS-CYP71BE79棉花植株根和下胚轴交界处检测出8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯的大量积累。

(D)化合物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯(234)促进拟南芥感染丁香假单孢杆菌，**P<0.02。

(E)8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯由CYP71BE79催化为8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯的反应式。

具体实施方式

本发明人基于有腺体棉和无腺体棉的差异表达，经过大量筛选，获得一个参与棉花中棉酚生物合成途径的酶：细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79。其能在棉花的棉酚合成途径中间体8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯(8-hydroxy-7-keto-δ-cadinene)上增加一个羟基，获得中间体化合物8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯；其被下调后，8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯积累，棉花出现易感病表型。利用化合物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯可以促进拟南芥感染丁香假单孢杆菌，提高感病性。CYP71BE79可以作为调节棉花的棉酚性状和/或感病表型的靶标，为棉花的改良育种提供新的途径。

本发明揭示了新的参与棉酚生物合成途径的酶CYP71BE79，其能催化合成棉酚生物合成途径的中间体化合物。优选地，所述的CYP71BE79具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

本发明涉及的CYP71BE79的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

所述的多肽优选序列为SEQ ID NO:2所示的多肽，还包括具有与所示多肽具有相同功能的SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

CYP71BE79多肽的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。这些标签可用于对蛋白进行纯化。为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述CYP71BE79多肽的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

编码CYP71BE79多肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。编码CYP71BE79成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

编码CYP71BE79的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含CYP71BE79的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

CYP71BE79多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含CYP71BE79编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

在在体(体内)或离体(体外)条件下，CYP71BE79或其衍生多肽，可应用于在8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯上增加一个羟基，获得中间体化合物8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯。所述的离体用途包括工业生产，如工业生产(包括发酵生产)棉酚或其中间体。所述的棉酚中间体至少包括如半棉酚酮。

本发明人通过真核表达CYP71BE79进行体外酶活实验，证明了CYP71BE79的催化活性。

在应用时，特别是工业化生产中，本发明的CYP71BE79多肽或它们的衍生多肽还可被固定于其它的固相载体上，获得固定化的酶，应用于与底物进行体外反应。所述的固相载体例如是一些无机物制成的微球，管状体等。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。上述的固定化酶的方法均可被应用于本发明中。

本发明中，“转基因”，系指通过任何方法导入植物个体一段外源的双链脱氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以是游离在染色体外，也可以整合到受体植物染色体的基因组上；可以通过生殖过程传递到后代，也可以不传递到后代。外源基因可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。

本发明提供了一种调节棉花的棉酚性状的方法，包括：调节棉花中CYP71BE79的表达或活性。

在得知了所述的CYP71BE79的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的CYP71BE79的表达。比如可通过一定的途径将携带CYP71BE79编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的CYP71BE79多肽。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低CYP71BE79的表达或使之缺失表达，比如将携带反义CYP71BE79基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达CYP71BE79蛋白；或将CYP71BE79基因进行敲除。

作为本发明的一种方式，所述的调节棉花的棉酚性状是增加棉花的棉酚含量或降低棉花的感病率，包括上调棉花中CYP71BE79的表达或活性。作为该方法的一种具体实施方式，可将CYP71BE79蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述CYP71BE79蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达CYP71BE79蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达CYP71BE79蛋白的植物。利用农杆菌转化法可将CYP71BE79蛋白的编码基因或反义基因转入植物中。

作为本发明的另一种方式，所述的调节棉花的棉酚性状是降低棉花的棉酚含量，包括下调棉花中CYP71BE79的表达或活性。作为本发明的具体实施方式，通过敲除CYP71BE79基因，从而下调植物中CYP71BE79的表达。

例如，可以采用病毒诱导的基因沉默，制备转基因棉花，其中CYP71BE79被沉默。VIGS可由小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)驱动，siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)结合后，特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合，并降解RNA模板。

又例如，可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除CYP71BE79。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到合适的靶位点较为重要。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

在本发明的具体实施例中，利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)分别抑制CYP71BE79的积累不仅可以显著降低棉花植株的棉酚含量和半棉酚酮含量，也能检测到棉酚生物合成途径中间体的积累，证明了CYP71BE79确实参与了棉酚生物合成途径。

此外，本发明还涉及利用CYP71BE79或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用CYP71BE79或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中CYP71BE79的表达情况，早期确定棉花的棉酚特性和/或感病表型。首先，确定一个植物表达CYP71BE79的中间值(标准值)，对于高于该中间值的植物，评估为棉酚或半棉酚酮含量高、不易于感病；对于低于该中间值的植物，评估为棉酚或半棉酚酮含量低、易于感病。早期鉴定出易感病的表型，可以在种植过程中加以适当防护，以避免病虫害的发生发展。

本发明还提供了一种制剂(如农药组合物)，其含有所述的8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯，以及农药学上可接受的载体。“农药学上可接受的载体”是用于将所述的8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯传送给植物的可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。农药学上可接受的载体可以是液体或固体。所述的制剂一般被用于除去有害植物或不利于农作物种植或生长的植物，包括杂草。

所述的制剂还可含有植物侵染菌；所述的植物侵染菌包括：丁香假单孢杆菌。由于8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯的作用，使得植物更置于被植物侵染菌感染，产生病变，从而被除去。

所述制剂(或农药组合物)的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：水溶液，悬浮剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物，乳液，可喷洒溶液，水性分散系，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将所述的8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯和/或植物侵染菌在保持全部或部分活性的前提下递送到待除去的植物上的都是可取的。优选那些易于递送的剂型，例如，所述农药组合物是注射剂、液体喷洒剂、或喷雾剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、棉花总RNA提取，PCR扩增目的基因CYP71BE79

A、棉花总RNA的提取和cDNA反转录制备

棉花材料(陆地棉品种“晋棉R15”，购自山西省农科院棉花研究所)用液氮研磨，每100mg材料加0.5ml植物总RNA提取试剂(RNAplant plus Reagent，Tiangen)，震荡至彻底混匀，室温放置5min。4℃ 12,000rpm离心1min，上清转入新的无RNase离心管，加入0.1ml 5MNaCl，温和混匀。加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀。4℃ 12,000rpm离心10min。上清加LiCl至终浓度2M。-20℃静置3小时，13,000g离心10min。沉淀用70％乙醇洗一次，真空干燥，溶于20～50μL H₂O(RNase free)。将RNA用10mM Tris-HCl(pH 7.5)做适当稀释，测定波长在200～300nm之间的UV吸收值。将RNA浓度稀释至1μg/μl。PolyA mRNA第一链反转录采用iScript^TMcDNA Synthesis Kit(BIO-RAD，Cat.170-8891)。反应体系如下：

25℃反应5分钟，42℃反应30分钟，85℃反应5分钟，置于冰上。反转录产物(或稀释10倍后)可直接用于PCR扩增目的基因。

B、PCR扩增目的基因CYP71BE79

用高保真酶HS DNA Polymerase扩增CYP71BE79的全长cDNA片段(1527bp)。引物序列如下：

CYP71BE79-YeDP60-S-BamHI：

5’-cgcggatcc ATGGAGCTTCAACTCCCTTC-3’(SEQ ID NO:3)；

CYP71BE79-YeDP60-AS-KpnI：

5’-cggggtacc CTAATGAACAATTTTAGATCC-3’(SEQ ID NO:4)。

PCR反应条件为：98℃，变性1分钟；98℃，变性10秒钟；57℃，复性10秒；72℃，延伸1分40秒；72℃，保温5分钟；4℃保温。

实施例2、载体构建和酵母转化

A、载体构建

前述利用高保真酶HS DNA Polymerase扩增的CYP71BE79的全长cDNA片段，用BamHI和KpnI酶切连入pYeDP60载体(BioVector NTCC)。

B、酵母转化

酵母菌株单菌落接种于2ml YPD培养基中，30℃培养过夜，转入300ml YPDA培养基中，30℃培养至OD₆₀₀＝0.5。离心收集细胞，用无菌水洗一次，细胞用1.5ml TE/醋酸锂重悬。

1.5ml EP管中加入200μg carrier DNA和1μg质粒，再加入200μl酵母感受态细胞，加入1.2ml新鲜配制的PEG溶液，42℃热激15分钟，室温下离心15秒，细胞沉淀用TE溶液重悬，涂在SGI筛选培养基上，30℃培养2-3天。

YPD培养基：YPD Medium(CLONTEC，8600-1)。

PEG：50％PEG 3350(Polyethylene glycol，avg.mol.wt.＝3，350；Sigma#P-3640)，无菌水配制，可以在60℃加热加速溶解。

10×TE：0.1M Tris-HCl，10mM EDTA，pH 7.5，高温高压灭菌后备用。

10×LiAc：1M LiAc，pH 7.5，高温高压灭菌后备用。

carrier DNA：YEAST MAKER^TM Carrier DNA(CLONTEC，K1606-A)。

SGI培养基：葡萄糖20g/L，酪蛋白水解物(Difco)1g/L，不含氨基酸的酵母基本氮源(Difco)6.7g/L，色氨酸40mg/L。

实施例3、CYP71BE79蛋白真核表达与酵母微粒体制备

从SGI培养基上挑取单菌落，接种到2ml SGI培养基中，培养过夜。转接到100mlYPGE培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.5时，加1/10体积灭菌半乳糖(200g/L)诱导8-16小时。

离心收集细胞，沉淀用10ml HESB溶液重悬。重悬液用one shot Cell DisrupterSystem(Constant Systems)进行破碎，破碎压力25kpsi。10,000g离心15分钟，超高速离心100，000g 1h，弃去上清，沉淀(即为微粒体)用HESB溶液重悬，收集上清用于酶活分析。YPGE培养基：葡萄糖5g/L，酵母提取物(Difco)10g/L，细菌蛋白胨(Difco)10g/L，乙醇3％(vol)。

缓冲液：

HEPES：100mM pH7.0；

HESB：25mM HEPES，1mM EDTA(pH 8.0)，Sorbitol 0.6M。

实施例4、CYP71BE79的底物分析

针对CDNC、CYP706B1和CYP71BE79的表达与棉酚合成途径的关联性进行研究。其中，CDNC和CYP706B1为已经鉴定功能的棉酚合成途径的基因。

A、病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体构建

PCR扩增200-500bp的基因特异片段，正向引物引入BamHI酶切位点，反向引物引入XbaI酶切位点，装入pTRV2载体(Biovector)，将重组的载体TRV转入农杆菌GV3101，用于注射棉花子叶进行感染。

用于VIGS的CYP706B1基因(GenBank登录号：AF332974.1)的特异片段为该基因的第912～1132位；

用于VIGS的CDNC基因(GenBank登录号：XM_016850504.1)的特异片段为该基因的第311～670位；

用于VIGS的CYP71BE79基因(SEQ ID NO:1)的特异片段为该基因的第1085～1328位。

B、棉花子叶转染

将含有转基因载体的农杆菌于28℃培养过夜，至OD值为2.5。4℃5,000rpm离心5min，用等体积的重悬液(10mM MES，10mM MgCl₂，150μM Acetosyringone)重悬。室温放置至少3小时。将转有不同质粒的农杆菌重悬液与转有pTRV1载体的农杆菌重悬液以1：1(V/V)混合，从棉花子叶背面注射进行转染。注射两周后取材-70℃冻存。获得如下植株：

TRV2:CYP71BE79(图2，即VIGS-CYP71BE79)：CYP71BE79被VIGS沉默的植株；

TRV2:CYP706B1：CYP706B1被VIGS沉默的植株；

TRV2:CDNC：CDNC被VIGS沉默的植株；

TRV2:00：转入空质粒的pTRV2的植株(CK)。

C、GC-MS分析

GC-MS分析采用安捷伦6890/5973GC-MSD气相色谱-质谱检测器，HP5-MS石英毛细管柱(30m x 0.25mm x 0.25μm，安捷伦)。高纯氦气作为载气，载气流速为1ml/min，温度设置为220℃。进行分析时，升温程序为60℃起始，保持2分钟，5℃/min升到210℃，保持10分钟，然后30℃/min升到300℃。质谱采用EI源，扫描范围为30～500m/z，离子源和四级杆温度分别为230℃和150℃，扫描频率为5次/s。化合物的结构和名称通过NIST(NationalInstitute of Standards and Technology)和Wiley libraries两个数据库共同决定。

取棉花叶片用液氮研磨后称重，每0.1克新鲜组织加入0.5毫升含内标壬酸乙酯的正己烷在28℃摇床抽提1小时，离心后取上清进行GC-MS检测萜类化合物。

GC-MS条件：升温程序为60℃起始，保持2分钟，5℃/min升到210℃，保持10分钟，然后30℃/min升到300℃。

D、HPLC检测棉酚

棉花叶片用液氮磨碎后每100mg材料加1ml叶片提取液，浸泡1小时，离心，上清用0.22μm滤头过滤，进行HPLC检测(Stipanovic et al.，1988)。

HPLC检测条件：进样10μl，流动相流速1ml/min，柱温40℃，检测时间40min。

棉籽提取液：乙醇:乙醚:水:醋酸＝59:17:24:0.2。

叶片提取液：乙腈:水:磷酸＝80:20:0.1。

HPLC流动相：乙醇:甲醇:异丙醇:乙腈:水:乙酸乙酯:DMF:磷酸＝16.7:4.6:12.1:20.2:37.4:3.8:5.1:0.1。

测定酚合成途径相关基因的表达及其与棉酚合成的相关性，基因表达的检测采用qPCR，引物如表1。

表1、qRT-PCR所用引物

棉酚合成途径相关基因CDNC和CYP706B1的VIGS植株叶片的半棉酚酮(HGQ)和棉酚(Gossypol)含量测定及相关基因表达水平检测如图1A。可见，当把棉酚合成途径中的基因表达抑制后，棉酚和半棉酚酮的含量均有显著降低，相应的基因表达也明显下降。

棉酚合成途径相关基因在有酚棉(G)和无酚棉(GL)的真叶中差异表达，与棉酚和半棉酚酮在有酚棉中的差异积累一致，如图1B。

如图1C，棉酚合成途径相关基因在胚珠发育的过程中前期表达量低，从15天到30天表达量逐步升高，35天后表达量下降。这一趋势也同棉酚和半棉酚酮在胚珠发育的过程中的积累一致。

并且，棉酚合成途径相关基因在无酚棉(图1D)和无酚棉(图1E)子叶中的基因表达均能被大丽轮枝杆菌激发子(VdNEP)诱导。这与棉酚和半棉酚在子叶中的含量也能受到大丽轮枝杆菌激发子(VdNEP)诱导一致。

经过GC-MS和HPLC的检测，显示不同靶向的棉花VIGS株系中有相应棉酚合成中间产物的减少或积累：在VIGS抑制CYP71BE79表达的株系中，棉酚以及半棉酚酮的含量均显著下降，说明CYP71BE79参与了棉花体内棉酚的生物合成。

E、LC-MS检测

HPLC分析采用Agilent 1200系统，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18analyticalcolumn(150mm×4.6mm，5μm)反向C18分析柱。质谱检测采用安捷伦6120四级杆检测器，API-ES离子源，正离子模式，碎裂电压70V。流动相为乙腈(B)和甲酸溶液(A)，甲酸浓度为0.1％，流动相流速为1mL/min，进样量为10μl。梯度洗脱条件：0-3min，20-70％B；3-5min，70-80％B；5-7min，80-84％B；7-8min，84-100％B；8-10min，100-20％B。

通过LC-MS分析，本发明人发现VIGS-CYP71BE79的植株叶片有化合物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯(8-hydroxy-7-keto-δ-cadinene)的积累，且根部积累量较高，即CYP71BE79的底物为8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯。

F、利用硅胶层析法分离VIGS-CYP71BE79植株中积累的CYP71BE79的底物

样品胶的制备：将VIGS-CYP71BE79的组织(根、茎和真叶)用液氮磨碎，用正己烷萃取，旋蒸干后，得到1g萃取物，溶于4mL正己烷中，按1：3加入3g 100目硅胶中，拌匀，37℃培养箱中干燥，得样品胶(棕色)。

硅胶柱的制备：按1：30称取30g 300-400目分离硅胶，干法装柱。采用V(氯仿)：V(乙酸乙酯)＝30：1洗脱液对硅胶柱进行洗脱，共收集10瓶，LC-MS检测所获得的初步分离品。

实施例5、CYP71BE79的体外酶活测定

A：酶活测定

反应体系：HEPES反应体系(25mM HEPES，pH 7.0，5mM DTT，1mM NADPH)。

反应条件：30℃，1h。

体外酶活实验中，以8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯为底物，酵母中表达的CYP71BE79微粒体能够催化生成羟化产物8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯。如图2。

也即，在以8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯为底物的体系中，利用LC-MS可以检测到加入CYP71BE79微粒体之后，底物消耗掉，同时生成羟化产物(分子量为250)。

B：利用PHPLC制备纯化CYP71BE79的产物

PHPLC分析采用Agilent 1100系统，Agilent Eclipse XDB-C18semi-preparativecolumn(250mm×9.4mm，5μm)反向C18分析柱。流动相为乙腈(B)和甲酸溶液(A)，甲酸浓度为0.1％，流动相流速为2.5mL/min，进样量为100μl。梯度洗脱条件：0-10min，50-50％B；10-15min，50-95％B；15-25min，95-95％B。收集时间段：18.5-19.0min。

C：利用核磁共振检测CYP71BE79的产物的结构

¹H，¹³C NMR和2D NMR谱在Bruker AVANCEIII^TM 500核磁共振仪上测定(TMS为内标)。

经过核磁共振，本发明人确定了CYP71BE79的底物和产物的结构，如图3A～D以及图4A～E，底物为8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯；产物为8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯。验证了CYP71BE79的体外酶活结果与体内功能一致。

表2、CYP71BE79底物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯的核磁共振数据(CD₃OD为溶剂)

表3、CYP71BE79的产物8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯的核磁共振数据(DMSO-d6为溶剂)

实施例6、CYP71BE79的进化树分析

本发明涉及到的蛋白序列和核苷酸序列均使用MAFFT(Katoh K&Standley DM.(2013)MAFFT multiple sequence alignment software version 7:improvements inperformance and usability.Molecular Biology&Evolution 30，772-780)软件比对，CYP71BE79编码基因的Ka和Ks值利用PAML4中yn00程序计算。系统发育树构建利用9个植物种的相关P450蛋白序列，以CYP71BE79为种子序列，Identity设置为40％以上，Blastp搜索比对9个陆地植物的CYP71家族成员。9个植物种分别包括双子叶植物：陆地棉、榴莲、可可、耧斗菜、拟南芥；单子叶植物：粳稻；基本的被子植物：无油樟；蕨类植物：江南卷柏和苔藓植物：小立碗藓，如如图5A。

系统发育树构建包括极大似然法树与贝叶斯树。本发明人利用MEGA5.05(Tamura，K.，Peterson，D.，Peterson，N.，Stecher，G.，Nei，M.，&Kumar，S.(2011)MEGA5:MolecularEvolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood，EvolutionaryDistance，and Maximum Parsimony Methods.Molecular Biology and Evolution 28，2731-2739)和PhyML 3.0(Guindon，S.，Dufayard，J.，Lefort，V.，Anisimova，M.，Hordijk，W.，&Gascuel，O.(2010)New Algorithms and Methods to Estimate Maximum-LikelihoodPhylogenies:Assessing the Performance of PhyML 3.0.Systematic Biology 59，307-321)构建Maximum likelihood(ML)进化树，使用GTR+G+I模型，Bootstrap值重复1000次，计算过程中gap数据全部删除。另外，本发明人利用PhyloBayes 3.3f(Lartillot N，LepageT，&Blanquart S.(2009)PhyloBayes 3:a Bayesian software package forphylogenetic reconstruction and molecular dating.Bioinformatics 25，2286-2288)软件构建贝叶斯进化树，GTR+G模型，运行1000万代，burn-in值为25％。如图5B，通过进化树分析发现CYP71BE亚家族在锦葵目中特异存在，CYP71BE79以单拷贝形式特异存在于5个锦葵科物种(陆地棉、雷蒙德式棉、亚洲棉、榴莲、可可)中，提示CYP71BE79在进化的过程中功能开始趋于高效而相对专一的参与棉酚代谢途径。

实施例7、CYP71BE79的底物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯的生物学功能研究

对于VIGS-CYP71BE79棉花植株进行观测后，本发明人发现其具有易感病的表型，感病率高于对照。在VIGS-CYP71BE79棉花植株根和下胚轴交界处检测出8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯的大量积累。如图6A～C。

为了研究VIGS-CYP71BE79植株的这种表型变化的原因，本发明人以拟南芥作为研究对象，观测化合物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯是否与感病性相关。拟南芥野生型(Col-0)在22℃左右的16小时光照温室中生长4周，按照文献(Clarke JD，Liu Y，Klessig DF，&DongX.(1998)Uncoupling PR Gene Expression from NPR1and Bacterial Resistance:Characterization of the Dominant Arabidopsis cpr6-1Mutant.Plant Cell 10，557-569)中的方法接种丁香假单孢杆菌(Pseudomonas syringae pv.Maculicola(Psm)ES4326，化合物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯处理的浓度为200μM。结果发现，叶片接种化合物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯(MW分子量：234)后，促进拟南芥感染丁香假单孢杆菌，如图6D。感染纹枯病菌的结果也类似。

8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯由CYP71BE79催化为8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯的反应式如图6E。

综上，本发明人通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)抑制CYP71BE79基因的表达，这不仅可以显著降低棉花植株的棉酚含量和半棉酚酮含量，也能检测到了CYP71BE79底物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯在根部的大量积累，从而能够快速高效地获得这个酶的底物，进一步通过体外酶活获得产物。

近年的研究表明，棉酚也具有抗肿瘤，抗病毒和抗微生物的活性。CYP71BE79的底物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯在正常情况下是无法被检测到的，通过对CYP71BE79功能的研究，可以获得棉酚生物合成的中间产物(8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯和8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯)，这两个中间产物的生物学功能具有结构的特殊性，如它们的生物活性与棉酚相反，使植物更加感病。通过进化树分析发现CYP71BE亚家族在锦葵目中特异存在，提示CYP71BE79在进化的过程中功能开始趋于高效而相对专一地参与棉酚代谢途径。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 棉酚生物合成途径因CYP71BE79及其应用

<130> 180251

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1527

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium spp)

<400> 1

atggagcttc aactcccttc attccaggtc ctcctcagca tcctccttgt ttccttcttc 60

atattcagaa gtttaaagaa atcaaaaccc aaaaatcccg accttaagcc aattccaggg 120

ccgagaaaat acccggtgat cgggaatttg caccaaatcg ctagcccatc accccacaag 180

accttgagag acttggccct gaaacatgga ccactgatgc atctccagct gggggagata 240

tcgacggtga tagtatcttc accggaagtg gctaaagagg tgacgaaaac ccacgacatt 300

aacttctcgt acaggccagc catggaagtt cccagggtct acacctacga tttcaccaac 360

atcgcctttg caccctacgg gaactactgg agataccttc gcaaactgtg caacacggag 420

ctgttgaccg cctcgagggt ccagtccttt cggtctataa gagaagcaga ggttttaaat 480

ctggtgaaaa cgatacatga gagcaagggg gaggcggtga accttagcga catgattttc 540

tcaatgacat atgggatagt tgccagagcg gcctttggga aaaaatgcaa ggatcaacag 600

acttacattg acagcataac cgaactcaca aagttgcttt ctggcttcag tttgtctgat 660

ttttatcctt ccattaaacc gcttcagctt tttagtggta tgaagaccaa agttgagaag 720

atgcataagg agaatgataa gatcatcgcg aacatcattg cggaacatag agagagaagg 780

gtcagagaaa agagcggaca agcagaagct gaacaagaag atctcgttga tgtgctctta 840

aggattcagg aggagaatga attccccttg gctgacaaga acatcaaatc agtcattgtg 900

gacgtttttg gtgcgggaag tgaaacatca tccacaaccg tggagtgggc actgtccgaa 960

atgataaaaa atccatgggt gatgaaagag gcccaagctg aagtaaggcg agttttcgga 1020

ccaaaaggaa acgttgacga aacaggcctt catgaactca aatacttgaa agcagtcatt 1080

agggaaacct tccgaatccg cccatccgtg ccattgttgc tcccaagaga atgtcaccaa 1140

gcttgcgaaa ttaatggcta ccatgtcccg gaaaaaacca gagtcctcat taacgcatgg 1200

gccctcggaa gagaccctaa ttactggaac gaacccgaca aatttaaccc tgaaaggttc 1260

ctcaacggta cagtcgatta cacgggaaca aattacgagt tcatcccatt tggggctgga 1320

agaaggatgt gcccagggat cacctttgcc acacccaacc tcgagctgcc tttggcccag 1380

ctgttgttcc attttgactg gaagctacct aatggaatga aaggggaaga tcttgatatg 1440

agtgaggtgt ttggcatgac tgtcaagagg aaaactgacc tggttcttat tccaactcca 1500

tatcatggat ctaaaattgt tcattag 1527

<210> 2

<211> 508

<212> PRT

<213> 棉花(Gossypium spp)

<400> 2

Met Glu Leu Gln Leu Pro Ser Phe Gln Val Leu Leu Ser Ile Leu Leu

1 5 10 15

Val Ser Phe Phe Ile Phe Arg Ser Leu Lys Lys Ser Lys Pro Lys Asn

20 25 30

Pro Asp Leu Lys Pro Ile Pro Gly Pro Arg Lys Tyr Pro Val Ile Gly

35 40 45

Asn Leu His Gln Ile Ala Ser Pro Ser Pro His Lys Thr Leu Arg Asp

50 55 60

Leu Ala Leu Lys His Gly Pro Leu Met His Leu Gln Leu Gly Glu Ile

65 70 75 80

Ser Thr Val Ile Val Ser Ser Pro Glu Val Ala Lys Glu Val Thr Lys

85 90 95

Thr His Asp Ile Asn Phe Ser Tyr Arg Pro Ala Met Glu Val Pro Arg

100 105 110

Val Tyr Thr Tyr Asp Phe Thr Asn Ile Ala Phe Ala Pro Tyr Gly Asn

115 120 125

Tyr Trp Arg Tyr Leu Arg Lys Leu Cys Asn Thr Glu Leu Leu Thr Ala

130 135 140

Ser Arg Val Gln Ser Phe Arg Ser Ile Arg Glu Ala Glu Val Leu Asn

145 150 155 160

Leu Val Lys Thr Ile His Glu Ser Lys Gly Glu Ala Val Asn Leu Ser

165 170 175

Asp Met Ile Phe Ser Met Thr Tyr Gly Ile Val Ala Arg Ala Ala Phe

180 185 190

Gly Lys Lys Cys Lys Asp Gln Gln Ile Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Glu

195 200 205

Leu Thr Lys Leu Leu Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Phe Tyr Pro Ser

210 215 220

Ile Lys Pro Leu Gln Leu Phe Ser Gly Met Lys Thr Lys Val Glu Lys

225 230 235 240

Met His Lys Glu Asn Asp Lys Ile Ile Ala Asn Ile Ile Ala Glu His

245 250 255

Arg Glu Arg Arg Val Arg Glu Lys Ser Gly Gln Ala Glu Ala Glu Gln

260 265 270

Glu Asp Leu Val Asp Val Leu Leu Arg Ile Gln Glu Glu Asn Glu Phe

275 280 285

Pro Leu Ala Asp Lys Asn Ile Lys Ser Val Ile Val Asp Val Phe Gly

290 295 300

Ala Gly Ser Glu Thr Ser Ser Thr Thr Val Glu Trp Ala Leu Ser Glu

305 310 315 320

Met Ile Lys Asn Pro Trp Val Met Lys Glu Ala Gln Ala Glu Val Arg

325 330 335

Arg Val Phe Gly Pro Lys Gly Asn Val Asp Glu Thr Gly Leu His Glu

340 345 350

Leu Lys Tyr Leu Lys Ala Val Ile Arg Glu Thr Phe Arg Ile Arg Pro

355 360 365

Ser Val Pro Leu Leu Leu Pro Arg Glu Cys His Gln Ala Cys Glu Ile

370 375 380

Asn Gly Tyr His Val Pro Glu Lys Thr Arg Val Leu Ile Asn Ala Trp

385 390 395 400

Ala Leu Gly Arg Asp Pro Asn Tyr Trp Asn Glu Pro Asp Lys Phe Asn

405 410 415

Pro Glu Arg Phe Leu Asn Gly Thr Val Asp Tyr Thr Gly Thr Asn Tyr

420 425 430

Glu Phe Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Met Cys Pro Gly Ile Thr

435 440 445

Phe Ala Thr Pro Asn Leu Glu Leu Pro Leu Ala Gln Leu Leu Phe His

450 455 460

Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Met Lys Gly Glu Asp Leu Asp Met

465 470 475 480

Ser Glu Val Phe Gly Met Thr Val Lys Arg Lys Thr Asp Leu Val Leu

485 490 495

Ile Pro Thr Pro Tyr His Gly Ser Lys Ile Val His

500 505

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

cgcggatcca tggagcttca actcccttc 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

cggggtaccc taatgaacaa ttttagatcc 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

gaagcctcat cgataccgtc 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

ctaccactac catcatgg 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

cttcttcatc acccctttc 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

ttagccattg gtgccaca 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

atgttgtcgg ttcggatgg 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

aagaagaccc tggtgccct 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

atccgtgcca ttgttgctc 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

atttgtcggg ttcgttccag 20

Claims (14)

1.一种调节棉花的棉酚性状的方法，其特征在于，所述方法包括：调节棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调节棉花的棉酚性状是降低棉花的棉酚或半棉酚酮含量，包括下调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将下调细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79表达的抑制分子转化植物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的抑制分子是以细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79选自下组：(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(b)将(a)多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有(a)多肽的活性的由(a)衍生的多肽；(c)氨基酸序列与(a)多肽所示氨基酸序列的同源性≥85％，并具有(a)多肽的活性的衍生的多肽；(d)在(a)或(b)或(c)所述多肽序列中添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的多肽。

6.一种催化合成棉酚生物合成途径的中间体化合物的方法，其特征在于，包括：以8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯作为底物，以细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79催化，获得增加一个羟基的产物，其是中间体化合物8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯。

7.细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的用途，用于作为调节棉花的棉酚性状的靶标，制备棉酚性状改良的棉花。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的调节为降低棉花的棉酚或半棉酚酮含量，包括下调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的表达或活性。

9.细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的用途，用于在8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯上增加一个羟基，获得中间体化合物8,11-二羟基-7-羰基-δ-杜松烯。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的用途为在体用途或离体用途，所述的离体用途包括工业生产，如工业生产棉酚或其中间体。

11.细胞色素P450单加氧酶CYP71BE79的用途，用于作为棉花棉酚性状或感病表型的分子标记。

12.8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯的用途，用于促进植物染病；较佳地，所述的植物为有害植物或不利于农作物种植或生长的植物，包括杂草。

13.一种用于促进植物染病的农药组合物，其特征在于，其中包含8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯和农药学上可接受的载体。

14.如权利要求13所述的农药组合物，其特征在于，其中还包括植物侵染菌；所述的植物侵染菌包括：丁香假单孢杆菌，纹枯病菌。