CN108410905B

CN108410905B - 调节棉花的棉酚性状的基因以及调节方法

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Publication number: CN108410905B
Application number: CN201810218367.9A
Authority: CN
Inventors: 陈晓亚; 阮菊新; 杨长青; 方欣; 田秀; 王凌健; 胡文利; 刘霞
Original assignee: Guangdong Esquel Textiles Co Ltd; Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Guangdong Esquel Textiles Co Ltd; Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2038-03-16
Also published as: CN108410905A

Abstract

本发明涉及调节棉花的棉酚性状的基因以及调节方法。本发明揭示了调节棉花的棉酚性状的新的靶标，包括醇脱氢酶DH1、细胞色素P450单加氧酶CYP82D113，DH1可以催化棉酚生物合成途径中间体7‑羟基‑(+)‑δ‑杜松烯的一步脱氢反应；CYP82D113进行随后的一步羟基化反应。本发明的技术方案为棉花的改良育种提供新的途径。

Description

调节棉花的棉酚性状的基因以及调节方法

技术领域

本发明属于植物学领域，更具体地，本发明涉及调节棉花的棉酚性状的基因以及调节方法。

背景技术

棉酚是一种倍半萜醛衍生物，大量积累在棉株地上部分的腺体和根的表皮细胞里，且在棉籽中也有大量的积累。

一般而言，低酚棉指棉籽棉酚含量低于0.02％的棉花品种。因为棉籽油、饼中棉酚含量低于0.02％时对人、畜无毒，在0.02％～0.05％时有轻微的毒性，高于0.15％时具有强毒性。现有的大多棉花品种，棉籽中含有1％～2％的棉酚及其衍生物，长期阻碍人们对棉籽充分利用。因此世界各主要产棉国的育种家相继开展了低酚棉育种工作，希望通过遗传育种手段选育低酚棉。

一方面，棉酚作为棉花的一种植保素，在抗病抗虫反应中起重要作用。另一方面，棉酚是一类具有普遍毒性的多酚类化合物，是一种危害细胞、血管及神经的有毒物质，严重影响棉子油和棉子饼的食用和饲料应用价值。通过提高棉株叶片的棉酚含量，可以增强棉花的抗病虫害能力；而特异降低棉仁中的棉酚含量，可以使棉籽得到有效利用。传统的育种手段难以满足棉花实现高产、抗虫、同时植株高酚，种子低酚的目标。棉酚在植物体内通过异戊二烯次生代谢途径合成，目前仅有少数棉酚合成途径基因被克隆鉴定，包括法尼基焦磷酸合成酶、杜松烯合成酶、杜松烯-8-羟化酶等，还有多个P450羟化酶、脱氢酶、氧化酶等棉酚生物合成途径中的重要功能基因尚未被克隆鉴定。这些关键基因的克隆和功能验证对棉酚等次生代谢调控研究具有重要理论意义，为今后棉籽低酚性状的转基因工程提供了必要基因。棉籽特异低酚而植株高棉酚含量的转基因棉花具有重大应用价值，棉酚性状的改良对棉花生产的可持续发展具有重要意义。

综上，棉酚代谢途径中的关键功能基因的克隆鉴定和转基因利用是实现这一目标的重要途径。

发明内容

本发明的目的在于提供调节棉花的棉酚性状的基因以及调节方法。

在本发明的第一方面，提供一种调节棉花的棉酚性状的方法，所述方法包括：调节棉花中醇脱氢酶DH1和/或细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的表达或活性。

在一个优选例中，所述的调节棉花的棉酚性状是降低棉花的棉酚含量，包括下调棉花中醇脱氢酶DH1和/或细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的表达或活性。

在另一优选例中，将下调醇脱氢酶DH1和/或细胞色素P450单加氧酶CYP82D113表达的抑制分子转化植物；较佳地，所述的抑制分子是以醇脱氢酶DH1和/或细胞色素P450单加氧酶CYP82D113为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，以醇脱氢酶DH1基因中第231～657位核苷酸作为沉默靶标。

在另一优选例中，以细胞色素P450单加氧酶CYP82D113基因中第381～836位核苷酸作为沉默靶标。

在另一优选例中，所述的调节棉花的棉酚性状是增加棉花的棉酚含量，包括上调棉花中醇脱氢酶DH1和/或细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的表达或活性。

在另一优选例中，将上调棉花中醇脱氢酶DH1和/或细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的表达或活性分子转化植物；较佳地，所述的分子是重组表达(或过表达)醇脱氢酶DH1和/或细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的表达构建物或表达载体。

在另一优选例中，所述的醇脱氢酶DH1选自下组：(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(b)将(a)多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有(a)多肽的活性的由(a)衍生的多肽；(c)氨基酸序列与(a)多肽所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％；更佳地≥95％；如98％，99％)，并具有(a)多肽的活性的衍生的多肽；(d)在(a)或(b)或(c)所述多肽序列中添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的多肽。

在另一优选例中，所述的细胞色素P450单加氧酶CYP82D113选自下组：(a’)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；(b’)将(a’)多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有(a’)多肽的活性的由(a’)衍生的多肽；(c’)氨基酸序列与(a’)多肽所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％；更佳地≥95％；如98％，99％)，并具有(a’)多肽的活性的衍生的多肽；(d’)在(a’)或(b’)或(c’)所述多肽序列中添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种催化合成棉酚生物合成途径的中间体化合物的方法，包括：以7-羟基-(+)-δ-杜松烯作为底物，以醇脱氢酶DH1催化，获得脱氢产物，其是中间体化合物7-羰基-δ-杜松烯。

在一个优选例中，所述的方法还包括：以7-羰基-δ-杜松烯作为底物，以细胞色素P450单加氧酶CYP82D113催化，获得羟基化产物，其是中间体化合物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯。

在另一优选例中，所述的7-羟基-(+)-δ-杜松烯由以下方法合成：(+)-δ-杜松烯合酶重组蛋白(CADC)与法呢基焦磷酸(FPP)反应，生成(+)-δ-杜松烯；以(+)-δ-杜松烯为底物，细胞色素P450单加氧酶CYP706B1催化，获得7-羟基-(+)-δ-杜松烯。

在本发明的另一方面，提供醇脱氢酶DH1的用途，用于作为调节棉花的棉酚性状的靶标，制备性状改良的棉花。

在一个优选例中，所述的调节为降低棉花的棉酚含量，包括下调棉花中醇脱氢酶DH1的表达或活性。

在另一优选例中，所述的调节为增加棉花的棉酚含量，包括上调棉花中醇脱氢酶DH1的表达或活性。

在本发明的另一方面，提供醇脱氢酶DH1的用途，用于对7-羟基-(+)-δ-杜松烯进行脱氢，获得脱氢产物7-羰基-δ-杜松烯。

在本发明的另一方面，提供细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的用途，用于作为调节棉花的棉酚性状的靶标。

在一个优选例中，所述的调节为降低棉花的棉酚含量，包括下调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的表达或活性。

在另一优选例中，所述的调节为增加棉花的棉酚含量，包括上调棉花中细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的表达或活性。

在本发明的另一方面，提供细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的用途，用于对7-羰基-δ-杜松烯进行羟基化，获得羟基化产物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、CYP82D113和DH1以及棉酚合成途径相关酶基因在不同组织中的表达特征(A-D，F)和棉籽中的棉酚含量测定(E)。A-D：CADC(A)，CYP706B1(B)，DH1(C)和CYP82D113(D)在顶部嫩叶(Y-L)、下部老叶(O-L)和茎杆(stem)中的表达；G：有腺体棉；GL：无腺体棉。DPA：开花后天数，例如17DPA为开花后17天。

图2A～F、利用GC-MS检测CADC，CYP706B1，DH1和CYP82D113的体外酶活。其中，a：(+)-δ-杜松烯；b：7-羟基-(+)-δ-杜松烯；1-4：酶活反应检测到的新产物，产物1-4。

图3、DH1产物(A～D图依次对应于产物1～4)的气相质谱图。

图4、CYP82D113产物的液相质谱检测。紫外检测器272nm处的吸收光谱(A)以及正离子模式下提取离子流质核比257(B)和235(C)的色谱图，黑色箭头指示CYP82D113产物保留时间。在能产生7-羟基-δ-杜松烯的体系中先后加入DH1和CYP82D113可以在液相质谱中检测到一个分子量为234的产物峰(257和235为该产物的加钠峰和加氢峰)。

图5、CYP82D113产物的液相质谱提取离子流图及高分辨一级质谱图。在正离子模式下得到产物的准分子离子峰为[M+H]+m/z 235.16910；负离子条件下得到产物的分子离子峰[M-H]-m/z 233.15480，经过精确拟合元素组成，可确定其分子式为C₁₅H₂₂O₂。

图6、CYP82D113产物的核磁共振(NMR)H谱(A)和C谱(B)确定其结构。

图7A-B、CYP82D113产物的核磁共振二维核磁确定其结构。

图8、VIGS植株叶片的半棉酚酮(A)和棉酚(B)含量测定及相关基因表达水平检测(C)。当把棉酚合成途径中的基因表达抑制后棉酚和半棉酚酮的含量均有显著降低，相应的基因表达也明显下降。

图9、VIGS分别抑制CADC，CYP706B1，DH1以及CYP82D113表达的植株中(+)-δ-杜松烯的相对含量。可以看到在VIGS抑制棉酚合成途径基因CYP706B1，DH1和CYP82D113的表达后棉酚生物合成的前体(+)-δ-杜松烯显著积累，而抑制(+)-δ-杜松烯合酶后其产物(+)-δ-杜松烯显著下降。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了调节棉花的棉酚性状的新的靶标，包括醇脱氢酶DH1、细胞色素P450单加氧酶CYP82D113。DH1可以催化棉酚生物合成途径中间体7-羟基-(+)-δ-杜松烯的一步脱氢反应；CYP82D113进行随后的一步羟基化反应。DH1和CYP82D113可以作为调节棉花的棉酚性状的靶标，为棉花的改良育种提供新的途径。

本发明揭示了新的参与棉酚生物合成途径的酶，DH1和CYP82D113，其能催化合成棉酚生物合成途径的中间体化合物。优选地，所述的DH1具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；所述的CYP82D113具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。

DH1和CYP82D113的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

所述的多肽优选序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4所示的多肽，还包括具有与所示多肽具有相同功能的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

DH1和CYP82D113多肽的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。这些标签可用于对蛋白进行纯化。为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述DH1和CYP82D113多肽的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

编码DH1和CYP82D113多肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。编码DH1和CYP82D113成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

编码DH1和CYP82D113的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含DH1和CYP82D113的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

DH1和CYP82D113多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含DH1和CYP82D113编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

在体外条件下，DH1或其衍生多肽，可应用于催化7-羟基-(+)-δ-杜松烯底物，获得脱氢产物，即中间体化合物7-羰基-δ-杜松烯。CYP82D113或其衍生多肽，可应用于催化7-羰基-δ-杜松烯底物，获得羟基化产物，即中间体化合物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯。

在应用时，特别是工业化生产中，本发明的DH1和CYP82D113多肽或它们的衍生多肽还可被固定于其它的固相载体上，获得固定化的酶，应用于与底物进行体外反应。所述的固相载体例如是一些无机物制成的微球，管状体等。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。上述的固定化酶的方法均可被应用于本发明中。

本发明人通过原核表达DH1和真核表达CYP82D113进行体外酶活实验，证明DH1和CYP82D113分别可以催化棉酚生物合成途径中间体7-羟基-(+)-δ-杜松烯的一步脱氢反应及随后的一步羟基化反应。

本发明中，“转基因”，系指通过任何方法导入植物个体一段外源的双链脱氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以是游离在染色体外，也可以整合到受体植物染色体的基因组上；可以通过生殖过程传递到后代，也可以不传递到后代。外源基因可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。

本发明提供了一种调节棉花的棉酚性状的方法，包括：调节棉花中醇脱氢酶DH1和/或细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的表达或活性。

在得知了所述的DH1和/或CYP82D113的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携带DH1和/或CYP82D113编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的DH1和/或CYP82D113多肽。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低DH1和/或CYP82D113的表达或使之缺失表达，比如将携带反义DH1和/或CYP82D113基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达DH1和/或CYP82D113蛋白；或将DH1和/或CYP82D113基因进行敲除。

作为本发明的一种方式，所述的调节棉花的棉酚性状是增加棉花的棉酚含量，包括上调棉花中DH1和/或CYP82D113的表达或活性。作为该方法的一种具体实施方式，可将DH1和/或CYP82D113蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述DH1和/或CYP82D113蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达DH1和/或CYP82D113蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达DH1和/或CYP82D113蛋白的植物。利用农杆菌转化法可将DH1和/或CYP82D113蛋白的编码基因或反义基因转入植物中。

作为本发明的另一种方式，所述的调节棉花的棉酚性状是降低棉花的棉酚含量，包括下调棉花中DH1和/或CYP82D113的表达或活性。作为本发明的具体实施方式，通过敲除DH1和/或CYP82D113基因，从而下调植物中DH1和/或CYP82D113的表达。

例如，可以采用病毒诱导的基因沉默，制备转基因棉花，其中DH1和/或CYP82D113被沉默。VIGS可由小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)驱动，siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)结合后，特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合，并降解RNA模板。

又例如，可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除DH1和/或CYP82D113。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到合适的靶位点较为重要。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

在本发明的具体实施例中，利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)分别抑制DH1和CYP82D113的积累不仅可以显著降低棉花植株的棉酚含量和半棉酚酮含量，也能检测到棉酚生物合成途径中间体的积累，证明了CYP82D113和DH1确实参与了棉酚生物合成途径。

此外，本发明还涉及利用DH1和/或CYP82D113或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用DH1和/或CYP82D113或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中DH1和/或CYP82D113的表达情况，早期确定棉花的棉酚特性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、组织表达特征

本发明人经过广泛而深入的筛选，根据有腺体棉和无腺体棉差异表达的数据，克隆获得多个可能与棉酚合成相关的EST序列，利用RACE的方法获得了全长序列。CYP82D113和DH1以及棉酚合成途径相关酶基因在不同组织中的表达特征如图1A-D和F。

进一步研究后，本发明人发现，其中的一个细胞色素P450单加氧酶(CYP82D113)和一个醇脱氢酶(DH1)在棉花叶片中表达被抑制后叶片中棉酚(Gossypol)及半棉酚酮(Hemigossypol)的积累显著下降。棉籽中的棉酚含量测定如图1E。

实施例2、棉花总RNA提取，PCR扩增目的基因DH1和CYP82D113

A、棉花总RNA的提取和cDNA反转录制备

棉花材料(陆地棉品种“晋棉R15”，购自山西省农科院棉花研究所)用液氮研磨，每100mg材料加0.5ml植物总RNA提取试剂(RNAplant plus Reagent，Tiangen)，震荡至彻底混匀，室温放置5min。4℃于12000rpm离心1min，上清转入新的无RNase离心管，加入0.1ml 5MNaCl，温和混匀。加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀。4℃于12000rpm离心10min。上清加LiCl至终浓度2M。-20℃静置3小时，13000g离心10min。沉淀用70％乙醇洗一次，真空干燥，溶于20-50μL H₂O(RNase free)。将RNA用10mM Tris-HCl(pH 7.5)适当稀释，测定波长在200nm-300nm之间的UV吸收值。将RNA浓度稀释至1μg/μl。PolyA mRNA第一链反转录采用iScript^TMcDNA Synthesis Kit(BIO-RAD，Cat.170-8891)。

25℃反应5分钟，42℃反应30分钟，85℃反应5分钟，置于冰上。反转录产物(或稀释10倍后)可直接用于PCR扩增目的基因。

B、PCR扩增目的基因DH1和CYP82D113

用高保真酶

HS DNA Polymerase扩增DH1和CYP82D113的全长cDNA片段(DH1：825bp；CYP82D113：1569bp)。引物序列如下：

DH1-PET32a-S-BamHI：5’-cgcggatcc ATGAGCTGCGACTCTTC-3’(SEQ ID NO:5)；

DH1-PET32a-AS-HindIII：5’-cccaagcttTTATCCAAAAAGTGCTGCG-3’(SEQ ID NO:6)；

CYP82D113-YeDP60-S-SmaI-his：5’-tcccccgggATGGATCTTCTTGATCTCTCC-3’(SEQID NO:7)；

CYP82D113-YeDP60-AS-KpnI：5’-cggggtaccTTAGTTATAGAGCTCAGGAGCAAGG-3’(SEQID NO:8)。

PCR反应条件为：98℃，变性1分钟；98℃，变性10秒钟；58℃，复性10秒；72℃，延伸1分40秒；72℃，保温5分钟；4℃保温。

实施例3、载体构建、大肠杆菌转化和酵母转化

A、载体构建

前述利用高保真酶

HS DNA聚合酶扩增的DH1全长cDNA片段用BamHⅠ和HindⅢ酶切连入pET-32a载体；CYP82D113的全长cDNA片段用SmaI和KpnI酶切连入pYeDP60酵母表达载体。

B、大肠杆菌感受态细胞制备

-70℃储存的大肠杆菌BL-21，在固体LB平板上划线，37℃培养过夜；挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，250rpm培养过夜。第二天，按1/50的比例放大接种到500mL液体LB培养基中，18-22℃培养，至OD600≈0.5(约5-6h)，冰上冷却10min。4℃2,500g离心10min，菌体用160mL转化缓冲液重悬，离心弃上清，菌体最后用40mL转化缓冲液重悬，加入3mL DMSO，混匀。分装，每管50μL，液氮速冻，-70℃保存。

转化缓冲液：55mM MnCl₂，15mM CaCl₂，250mM KCl，10mM PIPES(pH 6.7)，新鲜配置，冰上预冷。

LB培养基(1L)：10g NaCl，5g酵母抽提物，10g蛋白胨，pH 7.0。固体LB培养基加入15g/L琼脂粉。

C、大肠杆菌转化

加DNA样品(0.1-0.5μg)于50μL融化的大肠杆菌感受态细胞中，混匀，冰上放置25min；42℃热处理90s，冰上放置3min；加100μL液体LB培养基，37℃复苏培养30min；涂于选择平板，培养12-16h。然后后挑单菌落进行PCR鉴定。DNA琼脂糖凝胶电泳、片段的酶切、纯化和连接参考《分子克隆：实验室指南》。

D、酵母转化

酵母菌株单菌落(酿酒酵母)接种于2ml YPD培养基中，30℃培养过夜，转入300mlYPDA培养基中，30℃培养至OD₆₀₀＝0.5。离心收集细胞，用无菌水洗一次，细胞用1.5ml TE/醋酸锂重悬。

1.5ml EP管中加入200μg carrier DNA和1μg质粒，再加入200μl酵母感受态细胞，加入1.2ml新鲜配制的PEG溶液，42℃热激15分钟，室温下离心15秒，细胞沉淀用TE溶液重悬，涂在SGI筛选培养基上，30℃培养2-3天。

YPD培养基：YPD Medium(CLONTEC，8600-1)；

PEG：50％PEG 3350(聚乙二醇，avg.mol.wt.＝3，350；Sigma#P-3640)，无菌水配制，可以在60℃加热加速溶解；

10×TE：0.1M Tris-HCl，10mM EDTA，pH 7.5，高温高压灭菌后备用；

10×LiAc：1M LiAc，pH 7.5，高温高压灭菌后备用；

carrier DNA：YEASTMAKERTM Carrier DNA(CLONTEC，K1606-A)。

SGI培养基：葡萄糖20g/L，酪蛋白水解物(Difco)1g/L，不含氨基酸的酵母基本氮源(Difco)6.7g/L，色氨酸40mg/L。

实施例4、蛋白的原核表达和真核表达

A、原核表达

BL21细胞在含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上37℃生长过夜，PCR鉴定挑取阳性单菌落在液体培养基中培养过液，取500μL培养物扩大培养到50mL，直到OD₆₀₀≈0.6加入IPTG到终浓度为0.5mmol/L，继续在20℃度诱导培养过夜(20h)。取6mL菌液12000rpm离心5分钟，沉淀悬浮于预冷的3mL Buffer(25mM Mopso，pH 7.0，5mM DTT和10％[v/v]甘油，5mMMgCl₂)中，超声波破碎(3S开，7S关，处理3min，25％power)，离心，取上清进行SDS-PAGE电泳鉴定。或者依照Ni-NTA Spin Kit手册(Qiagen，Valencia，CA)，纯化带有His-Tag的重组蛋白，并电泳鉴定。

B、真核表达与酵母微粒体制备

从SGI培养基上挑取单菌落，接种到2ml SGI培养基中，培养过夜。转接到100mlYPGE培养基中，培养至OD600＝0.5时，加1/10体积灭菌半乳糖(200g/L)诱导8-16小时。

离心收集细胞，沉淀用10ml HESB溶液重悬。重悬液用one shot Cell DisrupterSystem(Constant Systems)进行破碎，破碎压力25kpsi。10,000g离心15分钟，收集上清，超高速离心100,000g 1h，弃去上清，沉淀(即为微粒体)用HESB溶液重悬，用于酶活分析。YPGE培养基：葡萄糖5g/L，酵母提取物(Difco)10g/L，细菌蛋白胨(Difco)10g/L，乙醇3％(v/v)。

缓冲液：

HEPES：100mM pH7.0；

HESB：25mM HEPES，1mM EDTA(pH 8.0)，Sorbitol 0.6M。

实施例5、CYP82D113和DH1的体外酶活测定

A、仪器和色谱条件

GC-MS分析采用安捷伦6890/5973GC-MSD气相色谱-质谱检测器，HP5-MS石英毛细管柱(30m x 0.25mm×0.25μm，安捷伦)。高纯氦气作为载气，载气流速为1ml/min，温度设置为220℃。进行分析时，升温程序为60℃起始，保持2分钟，5℃/min升到210℃，保持10分钟，然后30℃/min升到300℃。质谱采用EI源，扫描范围为30-500m/z，离子源和四级杆温度分别为230℃和150℃，扫描频率为5次/s。化合物的结构和名称通过NIST(National Instituteof Standards and Technology)和Wiley libraries两个数据库共同决定(图2A～F，图3)。

HPLC分析采用Agilent 1200系统，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18analytical column(150mm×4.6mm，5μm)反向C18分析柱。质谱检测采用安捷伦6120四级杆检测器，API-ES离子源，正离子模式，碎裂电压70V。检测结果如图4。

¹H，¹³C NMR和2D NMR谱在Bruker AVANCEIII^TM 500核磁共振仪上测定(TMS为内标)。检测结果如图6和图7。

B、酶活测定

原核表达的重组蛋白经纯化后用于酶活测定，真核表达的细胞色素P450直接提取酵母微粒体进行酶活测定。醇脱氢酶DH1和细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的底物利用体外酶活获得。每步酶活反应在30℃进行2小时，产物用正己烷抽提后进行GC-MS检测，或者直接过滤后进行HPLC-MS检测。

底物制备：原核表达的(+)-δ-杜松烯合酶重组蛋白(CADC，Gene accession：U23206)经纯化后与FPP于30℃反应，生成(+)-δ-杜松烯，反应2小时后加入真核表达的CYP706B1(Gene Accession：AAK60517)酵母微粒体，继续反应2小时，用于产生7-羟基-(+)-δ-杜松烯作为DH1的底物。经DH1催化后的7-羟基-(+)-δ-杜松烯作为CYP82D113的底物。

反应体系：HEPES反应体系(25mM HEPES，pH 7.0，5mM DTT，5mM MgCl₂)。

本发明人在以CYP706B1的酶活产物作为底物的体系中，利用GC-MS可以检测到加入DH1之后，CYP706B1的产物减少，同时产生了一个分子量为218的产物。经过高分辨质谱检测，得到分子组成为C₁₅H₂₂O，在GC-MS质谱数据库中未找到匹配的化合物，推测是一种新的化合物，称为7-羰基-δ-杜松烯。

此外，本发明人还检测到，CYP82D113可以催化DH1的产物7-羰基-δ-杜松烯生成一个分子量为234的化合物，经过高分辨质谱检测得到的分子组成为C₁₅H₂₂O₂，称为8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯。如图2～图7。

图2：利用GC-MS检测CADC，CYP706B1，DH1和CYP82D113的体外酶活。a：(+)-δ-杜松烯；b：8-羟基-(+)-δ-杜松烯；1-4：酶活反应检测到的新产物，产物1为DH1的主产物。图3：产物1-4的气相质谱图。图4：CYP82D113产物的液相质谱检测。紫外检测器272nm处的吸收光谱(A)以及正离子模式下提取离子流质核比257(B)和235(C)的色谱图，黑色箭头指示CYP82D113产物保留时间。图5为高分辨台式四极杆静电场轨道阱QE分析CYP82D113产物的二级质谱，产物分子式为C₁₅H₂₂O₂。图6为核磁共振NMR解析CYP82D113产物的结构。图7为CYP82D113产物的核磁共振二维核磁确定其结构。

实施例6、棉花子叶VIGS(病毒诱导的基因沉默)转染

A、VIGS载体构建

本实施例中，制备转基因棉花，分别使其中CADC，CYP706B1，DH1(靶向于第231～657位)或CYP82D113(靶向于第381～836位)表达沉默。

PCR扩增300-500bp的基因特异片段，正向引物引入BamHI酶切位点，反向引物引入XbaI酶切位点，装入pTRV2载体中，载体转入农杆菌GV3101用于注射棉花子叶进行感染。

针对各个基因进行VIGS所用PCR引物(加粗部分为BamHI/XbaI酶切位点)(5’-3’)如表1所示。

表1

B、棉花子叶转染

将含有转基因载体的农杆菌于28℃培养过夜，至OD值为2.5。4℃于5,000rpm离心5min，用等体积的重悬液(10mM MES，10mM MgCl₂，150μM N-乙酰甲苯胺(acetosyringone))重悬。室温放置至少3小时。将转有不同质粒的农杆菌重悬液与转有pTRV1载体的农杆菌重悬液以1：1(V/V)混合，从棉花子叶背面注射进行转染。注射两周后取材-70℃冻存。

C、化合物测定

GC-MS

取棉花叶片用液氮研磨后称重，每0.1克新鲜组织加入0.5毫升含内标壬酸乙酯的正己烷在28℃摇床抽提1小时，离心后取上清进行GC-MS检测萜类化合物。

GC-MS条件：升温程序为60℃起始，保持2分钟，5℃/min升到210℃，保持10分钟，然后30℃/min升到300℃。

HPLC

棉花叶片用液氮磨碎后每100mg材料加1ml叶片提取液，浸泡1小时，离心，上清用0.22μm滤头过滤，进行HPLC检测。

HPLC检测条件：进样10μl，流动相流速1ml/min，柱温40℃，检测时间40min。

棉籽提取液：乙醇:乙醚:水:醋酸＝59:17:24:0.2

叶片提取液：乙腈:水:磷酸＝80:20:0.1。

HPLC流动相：乙醇:甲醇:异丙醇:乙腈:水:乙酸乙酯:DMF:磷酸＝16.7:4.6:12.1:20.2:37.4:3.8:5.1:0.1。

经过GC-MS和HPLC的检测，显示不同靶向的棉花VIGS株系中有相应棉酚合成中间产物的减少或积累：

在VIGS抑制CADC表达的株系中，(+)-δ-杜松烯的含量下降，棉酚棉酚(叶片)以及半棉酚酮的含量均显著下降，未检测到其它中间产物；

在VIGS抑制CYP706B1表达的株系中(+)-δ-杜松烯含量升高，棉酚(叶片)含量降低；

在VIGS抑制DH1表达的株系中，(+)-δ-杜松烯含量升高，7-羟基-(+)-δ-杜松烯有所积累，棉酚(叶片)含量降低；

在VIGS抑制CYP82D113表达的株系中，(+)-δ-杜松烯含量升高，7-羟基-(+)-δ-杜松烯以及体外酶活检测到的DH1的主产物有所积累，棉酚(叶片)含量下降。如图8A～C，图9。

以上结果说明，DH1和CYP82D113参与了棉花体内棉酚的生物合成，同时验证了DH1和CYP82D113的体外酶活结果与体内功能一致。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调节棉花的棉酚性状的基因以及调节方法

<130> 17A325

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 825

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atgagctgcg actcttcaat aaccaagagg ctggatggca aggtggcact gataactggt 60

ggtgccagtg gcttaggaaa gtgcacagcc acactttttg tcaaacatgg agccaaggtt 120

ctcattgctg atattcaaga cgaactgggc gactctgttt gccaagagct tggaactgaa 180

aacatcagct atgtccactg cgatataaca tgcgaatccg atgttgaaaa tgccgtaaac 240

ttggctgtct ccaagtacgg aaagctcgat atcatgttca acaatgccgg cactcatggt 300

gacaacgaaa caagagtgac acacgccagc actgaagact tcaagaaagt gtttgatatc 360

aatgtgttgg gtggtttctt gggtgccaag tatgctgcca gggtcatggt tccggccaag 420

aaaggttgca tactattcac atcaagtctt gcttcaaaaa tcagcttcgg tagcccccat 480

gcatacaagg catcgaagca tgccgttgca gggttgacga agagcttggc cgtggagtta 540

ggtgagcatg gaattagagt caactctatt tcacctcatg caatttcgac tccaatgttc 600

caaaaatcaa ttgggatacc cgataagaag aagggagagg agatgattgc ggcttcagca 660

gtgttgaaag gcactgtatt ggagcctgaa gattttgcac atgcagcact gtatttggca 720

agtgatgagg ctaaatttat cagtggtgtc aacttaccac tggatggagg gtatagtctc 780

agcaatcaat catggaagct gggattcgca gcactttttg gataa 825

<210> 2

<211> 274

<212> PRT

<213> 棉花(Gossypium spp )

<400> 2

Met Ser Cys Asp Ser Ser Ile Thr Lys Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala

1 5 10 15

Leu Ile Thr Gly Gly Ala Ser Gly Leu Gly Lys Cys Thr Ala Thr Leu

20 25 30

Phe Val Lys His Gly Ala Lys Val Leu Ile Ala Asp Ile Gln Asp Glu

35 40 45

Leu Gly Asp Ser Val Cys Gln Glu Leu Gly Thr Glu Asn Ile Ser Tyr

50 55 60

Val His Cys Asp Ile Thr Cys Glu Ser Asp Val Glu Asn Ala Val Asn

65 70 75 80

Leu Ala Val Ser Lys Tyr Gly Lys Leu Asp Ile Met Phe Asn Asn Ala

85 90 95

Gly Thr His Gly Asp Asn Glu Thr Arg Val Thr His Ala Ser Thr Glu

100 105 110

Asp Phe Lys Lys Val Phe Asp Ile Asn Val Leu Gly Gly Phe Leu Gly

115 120 125

Ala Lys Tyr Ala Ala Arg Val Met Val Pro Ala Lys Lys Gly Cys Ile

130 135 140

Leu Phe Thr Ser Ser Leu Ala Ser Lys Ile Ser Phe Gly Ser Pro His

145 150 155 160

Ala Tyr Lys Ala Ser Lys His Ala Val Ala Gly Leu Thr Lys Ser Leu

165 170 175

Ala Val Glu Leu Gly Glu His Gly Ile Arg Val Asn Ser Ile Ser Pro

180 185 190

His Ala Ile Ser Thr Pro Met Phe Gln Lys Ser Ile Gly Ile Pro Asp

195 200 205

Lys Lys Lys Gly Glu Glu Met Ile Ala Ala Ser Ala Val Leu Lys Gly

210 215 220

Thr Val Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala His Ala Ala Leu Tyr Leu Ala

225 230 235 240

Ser Asp Glu Ala Lys Phe Ile Ser Gly Val Asn Leu Pro Leu Asp Gly

245 250 255

Gly Tyr Ser Leu Ser Asn Gln Ser Trp Lys Leu Gly Phe Ala Ala Leu

260 265 270

Phe Gly

<210> 3

<211> 1569

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium spp )

<400> 3

atggatcttc ttgatctctc cacttttggt tatgcagtag tgttaggcat cacgctactg 60

tttttgtaca ccaaactcaa gaagtctagc tcaggaagta gcagcaaagc tgcacccgta 120

gcagccggtg catggccaat aatcggtcac cttccgctgt taggcggacc caagacccct 180

catgaaacat tgggagactt aggtgagaaa tatggacctg cctacatgat ccggattggt 240

gttcacccag ccctggtggt gaattcgagt gaggtagcca aggaaatctt caccgtcaat 300

gatatgtatg tctcttccag atcagaattt gccgccgctg aacacttggg ttacaactat 360

gccatgtttg ggttttctcc ttatggacaa tactggcgtg aaatgcgcaa aataacaatg 420

ttggaggtgc tatccaatca caggatcgat cagctcaaga aagtgtttgt ctcggaaata 480

gaaggctcaa tgaaactatt atataaaact tgggctgcga aaaaggatgg ctcaagtaag 540

gtgttggttg agatgaagaa acacttttca gacttgactt tgaacgtcat tatgaggacg 600

gttgctggga agaggtacag tgttgttgca gaggaagacc aaaaagaggt gttgagatat 660

cgtaaggctt tacgagattt ctttcacttg acagggatgt ttgtgttggg agatgcagtc 720

cctttcctcc gttggttgga tattggtggt tatgagaagt ggatgaagaa aactgctaaa 780

gagttggatg aaatttccgg aggatggcta gatgaccata ggaagggtgg acgctgggat 840

gaaaataaaa aggagaagga tttcatggac gtgatgaact ctgttcttaa aggtgcaagt 900

cttgccggat atgatgctga caccatcaac aaagccactt ccttgaatat gattttagca 960

ggcagtgaca ccacaacagt taccttaata tggggtcttt ccctaatgct gaacaaacct 1020

catatactca aaaaggctca agaagaatta gacacctata taggcaggga taggtttgtg 1080

aatgagacag acatcggcaa attagtgtac atccaagcca tagttaaaga gacattaaga 1140

atgtatccac ctgcaccttt gtcagcacct cgtgagctca gtgaaagttg ttctattgga 1200

ggctatgaca tccccaaagg cacccgactg atcataaacc ttcataagat ccaaagggat 1260

cctaaaaaat ggccagaacc atcagagttt aagcccgaga ggtttctcac aacccacaaa 1320

gatgtggatg ttaggggcca gcattttgaa ctgatgcctt ttggcagtgg taggaggagt 1380

tgtcctggaa catcgtttgc actccatatg ctatacttga ccatgtctaa tttcttgcac 1440

gcctttgatt tctcaacacc atccaatggt ttgattgact tgactggcac agttggattg 1500

accaacatta aatctacccc gcttgaagca ttggtctcac ctcgccttgc tcctgagctc 1560

tataactaa 1569

<210> 4

<211> 522

<212> PRT

<213> 棉花(Gossypium spp )

<400> 4

Met Asp Leu Leu Asp Leu Ser Thr Phe Gly Tyr Ala Val Val Leu Gly

1 5 10 15

Ile Thr Leu Leu Phe Leu Tyr Thr Lys Leu Lys Lys Ser Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Ser Ser Lys Ala Ala Pro Val Ala Ala Gly Ala Trp Pro Ile Ile

35 40 45

Gly His Leu Pro Leu Leu Gly Gly Pro Lys Thr Pro His Glu Thr Leu

50 55 60

Gly Asp Leu Gly Glu Lys Tyr Gly Pro Ala Tyr Met Ile Arg Ile Gly

65 70 75 80

Val His Pro Ala Leu Val Val Asn Ser Ser Glu Val Ala Lys Glu Ile

85 90 95

Phe Thr Val Asn Asp Met Tyr Val Ser Ser Arg Ser Glu Phe Ala Ala

100 105 110

Ala Glu His Leu Gly Tyr Asn Tyr Ala Met Phe Gly Phe Ser Pro Tyr

115 120 125

Gly Gln Tyr Trp Arg Glu Met Arg Lys Ile Thr Met Leu Glu Val Leu

130 135 140

Ser Asn His Arg Ile Asp Gln Leu Lys Lys Val Phe Val Ser Glu Ile

145 150 155 160

Glu Gly Ser Met Lys Leu Leu Tyr Lys Thr Trp Ala Ala Lys Lys Asp

165 170 175

Gly Ser Ser Lys Val Leu Val Glu Met Lys Lys His Phe Ser Asp Leu

180 185 190

Thr Leu Asn Val Ile Met Arg Thr Val Ala Gly Lys Arg Tyr Ser Val

195 200 205

Val Ala Glu Glu Asp Gln Lys Glu Val Leu Arg Tyr Arg Lys Ala Leu

210 215 220

Arg Asp Phe Phe His Leu Thr Gly Met Phe Val Leu Gly Asp Ala Val

225 230 235 240

Pro Phe Leu Arg Trp Leu Asp Ile Gly Gly Tyr Glu Lys Trp Met Lys

245 250 255

Lys Thr Ala Lys Glu Leu Asp Glu Ile Ser Gly Gly Trp Leu Asp Asp

260 265 270

His Arg Lys Gly Gly Arg Trp Asp Glu Asn Lys Lys Glu Lys Asp Phe

275 280 285

Met Asp Val Met Asn Ser Val Leu Lys Gly Ala Ser Leu Ala Gly Tyr

290 295 300

Asp Ala Asp Thr Ile Asn Lys Ala Thr Ser Leu Asn Met Ile Leu Ala

305 310 315 320

Gly Ser Asp Thr Thr Thr Val Thr Leu Ile Trp Gly Leu Ser Leu Met

325 330 335

Leu Asn Lys Pro His Ile Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Leu Asp Thr

340 345 350

Tyr Ile Gly Arg Asp Arg Phe Val Asn Glu Thr Asp Ile Gly Lys Leu

355 360 365

Val Tyr Ile Gln Ala Ile Val Lys Glu Thr Leu Arg Met Tyr Pro Pro

370 375 380

Ala Pro Leu Ser Ala Pro Arg Glu Leu Ser Glu Ser Cys Ser Ile Gly

385 390 395 400

Gly Tyr Asp Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Ile Ile Asn Leu His Lys

405 410 415

Ile Gln Arg Asp Pro Lys Lys Trp Pro Glu Pro Ser Glu Phe Lys Pro

420 425 430

Glu Arg Phe Leu Thr Thr His Lys Asp Val Asp Val Arg Gly Gln His

435 440 445

Phe Glu Leu Met Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Thr

450 455 460

Ser Phe Ala Leu His Met Leu Tyr Leu Thr Met Ser Asn Phe Leu His

465 470 475 480

Ala Phe Asp Phe Ser Thr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Asp Leu Thr Gly

485 490 495

Thr Val Gly Leu Thr Asn Ile Lys Ser Thr Pro Leu Glu Ala Leu Val

500 505 510

Ser Pro Arg Leu Ala Pro Glu Leu Tyr Asn

515 520

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

cgcggatcca tgagctgcga ctcttc 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

cccaagcttt tatccaaaaa gtgctgcg 28

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

tcccccggga tggatcttct tgatctctcc 30

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

cggggtacct tagttataga gctcaggagc aagg 34

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

cgcggatcca caatgatgcc gagaacg 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

tgctctagac cttattatgg gactcaa 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

cgcggatccg tggcaaacag ggaggag 27

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

tgctctagag ttcagccatt gtccattc 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

cgcggatcct gccgtaaact tggctgtc 28

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

tgctctagat gaagccgcaa tcatctc 27

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

cgcggatcct tatggacaat actggcgtg 29

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

tgctctagac agcgtccacc cttcctat 28

Claims

1.一种调节棉花的棉酚性状的方法，其特征在于，所述方法包括：调节棉花中醇脱氢酶DH1的表达或活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调节棉花的棉酚性状是降低棉花的棉酚含量，包括下调棉花中醇脱氢酶DH1的表达或活性。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，用下调醇脱氢酶DH1表达的抑制分子转化植物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的抑制分子是以醇脱氢酶DH1为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调节棉花的棉酚性状是增加棉花的棉酚含量，包括上调棉花中醇脱氢酶DH1的表达或活性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，用上调棉花中醇脱氢酶DH1的表达或活性分子转化植物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的分子是重组表达醇脱氢酶DH1的表达构建物或表达载体。

8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醇脱氢酶DH1选自下组：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的多肽；(b)在(a)所述多肽序列中添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的多肽。

9.一种催化合成棉酚生物合成途径的中间体化合物的方法，其特征在于，包括：以7-羟基-(+)-δ-杜松烯作为底物，以醇脱氢酶DH1催化，获得脱氢产物，其是中间体化合物7-羰基-δ-杜松烯。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：以7-羰基-δ-杜松烯作为底物，以细胞色素P450单加氧酶CYP82D113催化，获得羟基化产物，其是中间体化合物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的7-羟基-(+)-δ-杜松烯由以下方法合成：(+)-δ-杜松烯合酶重组蛋白与法呢基焦磷酸反应，生成(+)-δ-杜松烯；以(+)-δ-杜松烯为底物，细胞色素P450单加氧酶CYP706B1催化，获得7-羟基-(+)-δ-杜松烯。

12.醇脱氢酶DH1的用途，用于作为调节棉花的棉酚性状的靶标，制备棉酚性状改良的棉花。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的调节为降低棉花的棉酚含量，包括下调棉花中醇脱氢酶DH1的表达或活性。

14.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的调节为增加棉花的棉酚含量，包括上调棉花中醇脱氢酶DH1的表达或活性。

15.醇脱氢酶DH1的用途，用于对7-羟基-(+)-δ-杜松烯进行脱氢，获得脱氢产物7-羰基-δ-杜松烯。

16.细胞色素P450单加氧酶CYP82D113的用途，用于对7-羰基-δ-杜松烯进行羟基化，获得羟基化产物8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯。