CN110317823B - 棉酚生物合成途径酶基因2-odd-1的功能鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及棉酚生物合成途径酶基因2‑ODD‑1的功能鉴定和应用。揭示了一个参与棉花中棉酚生物合成途径的酶，其在棉花的棉酚合成途径中间体化合物Furocalamen‑2‑one上增加一个羟基。2‑ODD‑1可以作为调节棉花的棉酚性状和/或感病表型的靶标，为棉花的改良育种提供新的途径。

Description

棉酚生物合成途径酶基因2-ODD-1的功能鉴定和应用

技术领域

本发明属于植物学及生物技术领域，更具体地，本发明涉及棉酚生物合成途径酶基因2-ODD-1的功能鉴定和应用。

背景技术

棉酚是棉属植物最重要的植保素，棉花、杨叶肖槿等锦葵科植物通过积累大量的棉酚等倍半萜醛类化合物来抵御病虫害。另一方面，棉酚也具有潜在的抗癌、抗菌、抗病毒的作用，是一种潜在的药物，但是，棉酚对人体也有一定的副作用，因而限制了其临床应用，也降低了棉籽的应用价值。棉酚合成过程中有许多中间产物，这些中间产物在正常植株中含量极少。通过基因工程手段，提高棉酚等倍半萜醛类化合物的含量能够显著提高棉花的抗病虫害能力，降低棉籽中棉酚含量可以使棉籽得到大量应用。

在棉花体内，棉酚通过细胞质的甲羟戊酸(MVA)途径进行合成，目前已经有一些棉酚合成的途径被分离鉴定，(+)-δ-杜松烯合酶[(+)-δ-cadinene synthase，CDNC]和(+)-δ-杜松烯-7-羟化酶[(+)-δ-cadinene-7-hydroxylase，CYP706B1]催化从FPP到7-羟基-(+)-δ-杜松烯(7-hydroxy-(+)-δ-cadinene)的连续步骤。棉酚和半棉酚酮结构中含有很多氧原子，猜测有多个P450或双加氧酶参与。双加氧酶能够催化氧原子和底物结合，属于氧化还原酶类，可催化多种有机化合物的氧化还原反应。

克隆棉酚途径相关的酶基因，不仅对棉酚等次生代谢化合物的调控研究具有重要理论意义，而且能够为后续培育棉籽低酚品种提供强有力的作用靶标。

发明内容

本发明的目的在于提供棉酚生物合成途径酶基因2-ODD-1的功能鉴定和应用。

在本发明的第一方面，提供一种调节棉花的棉酚性状的方法，所述方法包括：调节棉花中双加氧酶2-ODD-1的表达或活性。

在一个优选例中，所述的调节棉花的棉酚性状是降低棉花的棉酚或半棉酚酮含量，包括下调棉花中双加氧酶2-ODD-1的表达或活性。

在另一优选例中，将下调双加氧酶2-ODD-1表达的抑制分子转化植物。

在另一优选例中，所述的抑制分子是以双加氧酶2-ODD-1为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，以双加氧酶2-ODD-1基因中第231～729位核苷酸作为沉默靶标(如用于构建VIGS时的靶标)。

在本发明的另一方面，提供一种催化合成棉酚生物合成途径的中间体化合物的方法，包括：以式(I)化合物作为底物，以双加氧酶2-ODD-1催化，获得增加一个羟基的产物，产物结构如式(II)；

在本发明的另一方面，提供双加氧酶2-ODD-1的用途，用于作为调节棉花的棉酚性状的靶标，制备棉酚性状改良的棉花。

在一个优选例中，所述的调节为降低棉花的棉酚或半棉酚酮含量，包括下调棉花中双加氧酶2-ODD-1的表达或活性。

在本发明的另一方面，提供双加氧酶2-ODD-1的用途，用于在式(I)化合物上增加一个羟基，获得式(II)化合物；

在一个优选例中，所述的用途为在体用途或离体用途，所述的离体用途包括工业生产，如(但不限于)工业生产棉酚(包括发酵生产)或其中间体(如半棉酚酮)。

在本发明的另一方面，提供双加氧酶2-ODD-1的用途，用于作为棉花棉酚性状的分子标记。

在一个优选例中，所述的双加氧酶2-ODD-1选自下组：(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(b)将(a)多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有(a)多肽的活性的由(a)衍生的多肽；(c)氨基酸序列与(a)多肽所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％；更佳地≥95％；如98％，99％)，并具有(a)多肽的活性的衍生的多肽；(d)在(a)或(b)或(c)所述多肽序列中添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种化合物，其具有式(I)的结构：

在本发明的另一方面，提供一种化合物，其具有式(II)的结构：

在本发明的另一方面，提供具有式(I)的结构的化合物的用途，用于与双加氧酶2-ODD-1相互作用，参与棉酚合成的中间途径，生成式(II)化合物：

在本发明的另一方面，提供所述的具有式(I)结构或具有式(II)结构化合物的用途，用于调控棉酚的生物合成，或用于棉酚或棉酚中间体的人工合成。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、2-ODD-1在有腺体棉叶片(G_leaf)和无腺体棉叶片(GL_Leaf)的差异表达。

A.2-ODD-1在有腺体棉叶片和无腺体棉叶片的FPKM值。

B.qRT-PCR验证2-ODD-1在有腺体棉和无腺体棉叶片中的表达量。

C.有腺体棉和无腺体棉的叶片展示，其中有腺体棉叶片中布满腺点，无腺体棉的叶片则不含有腺点。

图2、2-ODD-1抑制植株(TRV:2-ODD-1)叶片中化合物及其含量检测。

A.通过GC-MS检测可以发现TRV:2-ODD-1植株叶片中积累了分子量为228的化合物。

B.通过HPLC检测，2-ODD-1抑制植株叶片中半棉酚酮含量显著下降。

C.通过HPLC检测，2-ODD-1抑制植株叶片中棉酚含量显著下降。

图3、2-ODD-1的功能鉴定。

A.通过HPLC检测，本发明人发现2-ODD-1能够利用furocalamen-2-one转化为新的产物。

B.2-ODD-1的底物及产物结构展示。其中228是底物的分子量，244是产物的分子量。

图4a～b、2-ODD-1的底物结构鉴定。furocalamen-2-one的¹H NMR(a)和¹³C NMR(b)数据。

图5a～b、2-ODD-1的底物furocalamen-2-one的二维核磁共振数据。

图6A～B、2-ODD-1的产物结构鉴定。3-hydroxy-furocalamen-2-one的H谱(a)及二维谱(b)。

图7a～b、2-ODD-1的产物3-hydroxy-furocalamen-2-one的二维核磁共振谱。

具体实施方式

无腺体棉是地上组织不含有棉酚的突变体材料，本发明人经过大量筛选，发现一个双加氧酶基因2-ODD-1在有腺体棉和无腺体棉的叶片中差异表达。该基因沉默植株的叶片中半棉酚酮和棉酚含量显著下降。同时，本发明人也检测到一种新的化合物Furocalamen-2-one在2-ODD-1抑制植株中大量积累。另外，该基因也可以作为低酚棉育种的靶标，为低酚棉育种提供新的种质资源。

本发明揭示了新的参与棉酚生物合成途径的酶2-ODD-1，其能催化合成棉酚生物合成途径的中间体化合物。优选地，所述的2-ODD-1具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

本发明涉及的2-ODD-1的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

所述的多肽优选序列为SEQ ID NO:2所示的多肽，还包括具有与所示多肽具有相同功能的SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

2-ODD-1多肽的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。这些标签可用于对蛋白进行纯化。为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述2-ODD-1多肽的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

编码2-ODD-1多肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。编码2-ODD-1成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

编码2-ODD-1的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含2-ODD-1的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

2-ODD-1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含2-ODD-1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

在体(体内)或离体(体外)条件下，2-ODD-1或其衍生多肽，可应用于在本发明发现的新化合物Furocalamen-2-one上增加一个羟基，获得中间体化合物，即式(II)化合物。所述的离体用途包括工业生产，如工业生产(包括发酵生产)棉酚或其中间体。所述的棉酚中间体至少包括如半棉酚酮。

本发明人通过重组表达2-ODD-1进行体外酶活实验，证明了2-ODD-1的催化活性。

在应用时，特别是工业化生产中，本发明的2-ODD-1多肽或它们的衍生多肽还可被固定于其它的固相载体上，获得固定化的酶，应用于与底物进行体外反应。所述的固相载体例如是一些无机物制成的微球，管状体等。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。上述的固定化酶的方法均可被应用于本发明中。

本发明中，“转基因”，系指通过任何方法导入植物个体一段外源的双链脱氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以是游离在染色体外，也可以整合到受体植物染色体的基因组上；可以通过生殖过程传递到后代，也可以不传递到后代。外源基因可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。

本发明提供了一种调节棉花的棉酚性状的方法，包括：调节棉花中2-ODD-1的表达或活性。

在得知了所述的2-ODD-1的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的2-ODD-1的表达。比如可通过一定的途径将携带2-ODD-1编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的2-ODD-1多肽。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低2-ODD-1的表达或使之缺失表达，比如将携带反义2-ODD-1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达2-ODD-1蛋白；或将2-ODD-1基因进行敲除。

作为本发明的一种方式，所述的调节棉花的棉酚性状是增加棉花的棉酚含量，包括上调棉花中2-ODD-1的表达或活性。作为该方法的一种具体实施方式，可将2-ODD-1蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述2-ODD-1蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达2-ODD-1蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达2-ODD-1蛋白的植物。利用农杆菌转化法可将2-ODD-1蛋白的编码基因或反义基因转入植物中。

作为本发明的另一种方式，所述的调节棉花的棉酚性状是降低棉花的棉酚含量，包括下调棉花中2-ODD-1的表达或活性。作为本发明的具体实施方式，通过敲除2-ODD-1基因，从而下调植物中2-ODD-1的表达。

例如，可以采用病毒诱导的基因沉默，制备转基因棉花，其中2-ODD-1被沉默。VIGS可由小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)驱动，siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)结合后，特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合，并降解RNA模板。

又例如，可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除2-ODD-1。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到合适的靶位点较为重要。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

在本发明的具体实施例中，利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)分别抑制2-ODD-1的积累不仅可以显著降低棉花植株的棉酚含量和半棉酚酮含量，也能检测到棉酚生物合成途径中间体的积累，证明了2-ODD-1确实参与了棉酚生物合成途径。

此外，本发明还涉及利用2-ODD-1或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用2-ODD-1或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中2-ODD-1的表达情况，早期确定棉花的棉酚特性和/或感病表型。

本发明中，抑制2-ODD-1的表达，发现了一种式(I)结构的化合物(Furocalamen-2-one)，同时发现棉酚的含量的显著下降。可见，式(I)结构的化合物参与了棉酚的合成，其积累导致棉酚合成受阻。

因此，本发明还涉及一种具有式(I)结构的化合物及其被2-ODD-1催化后加上一个羟基的产物，即式(II)化合物。它们在棉酚的生物合成中起着重要的作用。在离体条件下，它们也可被应用于棉酚的人工合成或棉酚中间体的人工合成，具有产业应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中所使用的引物如表1所示。

表1

实施例1、组织表达特征

本发明人经过广泛而深入的筛选，根据有腺体棉和无腺体棉差异表达的数据，克隆可能与棉酚合成相关的EST序列。发现2-ODD-1在有腺体棉和无腺体棉中存在差异表达。

2-ODD-1在有腺体棉叶片和无腺体棉叶片的FPKM值如图1A；qRT-PCR验证2-ODD-1在有腺体棉和无腺体棉叶片中的表达量如图1B；有腺体棉和无腺体棉的叶片中腺点分布显著差异，其中有腺体棉叶片中布满腺点，无腺体棉的叶片则不含有腺点，如图1C。

上述结果显示，2-ODD-1在有腺体棉的叶片中存在显著的高表达。

实施例2、棉花总RNA提取，PCR扩增目的基因

A、棉花总RNA的提取和cDNA反转录制备

棉花材料(陆地棉品种“晋棉R15”，购自山西省农科院棉花研究所)用液氮研磨，每100mg材料加0.5ml植物总RNA提取试剂(RNAplant plus Reagent，Tiangen)，震荡至彻底混匀，室温放置5min。4℃12,000rpm离心1min，上清转入新的无RNase离心管，加入0.1ml 5MNaCl，温和混匀。加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀。4℃12,000rpm离心10min。上清加LiCl至终浓度2M。-20℃静置3小时，13000g离心10min。沉淀用70％乙醇洗一次，真空干燥，溶于20-50μL H₂O(RNase free)。将RNA用10mM Tris-HCl(pH7.5)做适当稀释，测定波长在200nm-300nm之间的UV吸收值。将RNA浓度稀释至1μg/μl。PolyA mRNA第一链反转录采用iScript^TMcDNA Synthesis Kit(BIO-RAD，Cat.170-8891)。

反应体系如下：

25℃反应5分钟，42℃反应30分钟，85℃反应5分钟，置于冰上。反转录产物(或稀释10倍后)可直接用于PCR扩增目的基因。

B、PCR扩增目的基因2-ODD-1

用高保真酶

HS DNA Polymerase扩增2-ODD-1的全长(972bp)。

2-ODD-1-PET32a-F-BamHI：

5’-cgcggatccATGCCGGGTGTCAATCCTGA-3’(SEQ ID NO:7)；

2-ODD-1-PET32a-R-HindIII：

5’-cccaagcttTTAATTGGAAACTGGTGGTGA-3’(SEQ ID NO:8)。

PCR反应条件为：98℃，变性1分钟；98℃，变性10秒钟；58℃，复性10秒；72℃，延伸1分40秒；72℃，保温5分钟；4℃保温。

实施例3、载体构建和原核表达

A、载体构建

高保真酶

HS DNA Polymerase扩增的2-ODD-1全长CDS片段用BamHⅠ和HindⅢ酶切连入pET-32a载体中。

B、大肠杆菌感受态细胞制备

-70℃储存的大肠杆菌DH5α或BL-21，在固体LB平板上划线，37℃培养过夜；挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，250rpm培养过夜。第二天，按1/50的比例放大接种到500mL液体LB培养基中，18-22℃培养，至OD600≈0.5(约5-6h)，冰上冷却10min。4℃2,500g离心10min，菌体用160mL转化缓冲液重悬，离心弃上清，菌体最后用40mL转化缓冲液重悬，加入3mLDMSO，混匀。分装，每管50μL，液氮速冻，-70℃保存。

转化缓冲液：55mM MnCl₂，15mM CaCl₂，250mM KCl，10mM PIPES(pH 6.7)，新鲜配置，冰上预冷。

LB培养基(1L)：10g NaCl，5g酵母抽提物，10g蛋白胨，pH 7.0。固体LB培养基加入15g/L琼脂粉。

C、大肠杆菌转化

加DNA样品(0.1-0.5μg)于50μL融化的大肠杆菌感受态细胞中，混匀，冰上放置25min；42℃热处理90s，冰上放置3min；加100μL液体LB培养基，37℃复苏培养30min；涂于选择平板，培养12-16h。然后后挑单菌落进行PCR鉴定。

DNA琼脂糖凝胶电泳、片段的酶切、纯化和连接参考《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)(Sambrook and Russell，2001)。

D、原核表达

BL21细胞在含50μg/mL Ampicillin的LB平板上37℃生长过夜，PCR鉴定挑取阳性单菌落在液体培养基中培养过液，取500μL培养物扩大培养到50mL，直到OD₆₀₀≈0.6加入IPTG到终浓度为0.5mmol/L，继续在20℃度诱导培养过夜(20h)。取6mL菌液12000rpm离心5分钟，沉淀悬浮于预冷的3mL Buffer(25mM Mopso，pH 7.0，5mM DTT和10％[v/v]甘油，5mMMgCl₂)中，超声波破碎(3S开，7S关，处理3min，25％power)，离心，取上清进行SDS-PAGE电泳鉴定。或者依照Ni-NTA Spin Kit手册(Qiagen，Valencia，CA)，纯化带有His-Tag的重组蛋白，并电泳鉴定。

实施例4、2-ODD-1转基因沉默

A、VIGS载体构建

PCR扩增约400bp的2-ODD-1基因特异片段(针对SEQ ID NO:1中第231～729位)，正向引物引入BamHI酶切位点，反向引物引入XbaI酶切位点装入pTRV2载体，载体转入农杆菌GV3101用于注射棉花子叶进行感染。

B、棉花子叶转染

将含有转基因载体的农杆菌于28℃培养过夜，至OD值为2.5。4℃5000rpm离心5min，用等体积的重悬液(10mM MES，10mM MgCl₂，150μM acetosyringone)重悬。室温放置至少3小时。将转有不同质粒的农杆菌重悬液与转有pTRV1载体的农杆菌重悬液以1：1(V/V)混合，从棉花子叶背面注射进行转染。注射两周后取材-70℃冻存。

获得的2-ODD-1抑制植株为TRV:2-ODD-1。

C、GC-MS分析

GC-MS分析采用安捷伦6890/5973GC-MSD气相色谱-质谱检测器，HP5-MS石英毛细管柱(30m x 0.25mm x0.25μm，安捷伦)。高纯氦气作为载气，载气流速为1ml/min，温度设置为220℃。进行分析时，升温程序为60℃起始，保持2分钟，5℃/min升到210℃，保持10分钟，然后30℃/min升到300℃。质谱采用EI源，扫描范围为30-500m/z，离子源和四级杆温度分别为230℃和150℃，扫描频率为5次/s。化合物的结构和名称通过NIST(National Instituteof Standards and Technology)和Wiley libraries两个数据库共同决定。

取棉花叶片用液氮研磨后称重，每0.1克新鲜组织加入0.5毫升含内标壬酸乙酯的正己烷在28℃摇床抽提一小时，离心后取上清进行GC-MS检测萜类化合物。

GC-MS条件：升温程序为60℃起始，保持2分钟，5℃/min升到210℃，保持10分钟，然后30℃/min升到300℃。

D、HPLC检测棉酚

棉花叶片用液氮磨碎后每100mg材料加1ml叶片提取液，浸泡1小时，离心，上清用0.22μm滤头过滤，进行HPLC检测。

HPLC检测条件：进样10μl，流动相流速1ml/min，柱温40℃，检测时间40min。

叶片提取液：乙腈:水:磷酸＝80:20:0.1

HPLC流动相：乙醇:甲醇:异丙醇:乙腈:水:乙酸乙酯:DMF:磷酸＝16.7:4.6:12.1:20.2:37.4:3.8:5.1:0.1。

HPLC的检测结果显示，在VIGS抑制2-ODD-1表达的株系中，棉酚以及半棉酚酮的含量均显著下降。同时，通过GC-MS检测，本发明人还检测到Furocalamen-2-one的积累(通过NMR解析了Furocalamen-2-one的结构)。以上结果说明2-ODD-1在体内确实参与了棉酚的生物合成，同时说明了2-ODD-1可能以Furocalamen-2-one为底物进行反应。如图2A～C。

Furocalamen-2-one的中文名：呋喃卡拉曼-2-酮，化学式名：(S)-5-异丙基-7-甲基-4,5-二氢-3H-萘并[1,8-bc]呋喃-3-酮。

实施例5、2-ODD-1的体外酶活测定

A、酶活测定

反应体系：100mM Tris‐HCl(pH 7.4)，10％(v/v)甘油，14mM 2-巯基乙醇，1mM底物，10mM 2-酮戊二酸，10mM酮戊二酸，0.5mM FeSO₄。

反应条件：30℃，1h。

本发明人在以Furocalamen-2-one为底物(分子量为228)的体系中，利用HPLC可以检测到加入2-ODD-1蛋白之后，底物被消耗，生成了一个新的产物(图3A～B)。该产物需要核磁鉴定得知其结构，如图4～图7。

B、利用HPLC制备纯化2-ODD-1的产物

HPLC分析采用Agilent 1100系统，Agilent Eclipse XDB-C18semi-preparativecolumn(250mm×9.4mm，5μm)反向C18分析柱。流动相为乙腈(B)和甲酸溶液(A)，甲酸浓度为0.1％，流动相流速为2.5mL/min，进样量为100μl。梯度洗脱条件：0-10min，50-50％B；10-15min，50-95％B；15-25min，95-95％B。收集时间段：18.5-19.7min。

C、利用核磁共振检测2-ODD-1底物和产物的结构

¹H，¹³C NMR和2D NMR谱在Bruker AVANCEIII^TM 500核磁共振仪上测定(TMS为内标)。经过核磁实验，本发明人确定了2-ODD-1底物和产物的结构(表2，表3)。2-ODD-1的底物结构鉴定，furocalamen-2-one的¹H NMR(a)和¹³C NMR(b)数据如图4a～b。2-ODD-1的底物furocalamen-2-one的二维核磁共振数据如图5a～b。

同样，本发明人还对2-ODD-1的产物进行了结构鉴定。3-hydroxy-furocalamen-2-one的H谱及二维谱如图6A～B。2-ODD-1的产物3-hydroxy-furocalamen-2-one的二维核磁共振谱如图7a～b。

表2、2-ODD-1的底物furocalamen-2-one的核磁共振数据

	1H NMR(500MHz)(δ单ppm,J单位Hz)	13C NMR(125MHz)(δ单位ppm)
			1		119.09
2		194.4
			3	2.84(m,2H)	43.58
4	3.36(m)	45.97
			5	7.05(s)	122.82
6		136.58
			7	7.22(s)	109.55
8		153.84
			9		125.64
10		132.67
			11	8.01(s)	142.34
12	2.53(s)	22.29
			13	2.14(m)	33.6
14	0.92(d,8.0)	20.19
			15	0.84(d,8.0)	19.47

表3、2-ODD-1的产物3-hydroxy-furocalamen-2-one的核磁共振数据

	<sup>1</sup>H NMR(500MHz)(δ单位ppm,J单位Hz)
		1	119.09
2	194.4
		3	43.58
4	45.97
		5	122.82
6	136.58
		7	109.55
8	153.84
		9	125.64
10	132.67
		11	142.34
12	22.29
		13	33.6
14	20.19
		15	19.47

综上，可以确定2-ODD-1参与的棉酚合成途径中的如下反应：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 棉酚生物合成途径酶基因2-ODD-1的功能鉴定和应用

<130> 180540

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 972

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium spp.)

<400> 1

atgccgggtg tcaatcctga aattgagttc ccagccattg agtttcgttt atcggatttg 60

aagcgaggaa ctgaaggatg gaaccgtttg tgcaagaggg ttcaagaggc ttgtgagact 120

ttcggttgtt tcgaggtggt atatgaaaag gtatcgacta aactccgaga ggatgcgttt 180

gggttgatga aagaaatggt tgagctccca gtggagacga aacagaagaa taatagtccc 240

atgccttacc atggttgggt tggaccatgc aagcaggttt ctgtgttgta tgaaggcttt 300

ggagttggag atgcctccaa ctatgactct gttaaaagtt ttgctcaact tatgtggcct 360

aatggtcacc cacacttttc tgacactatt cataccctag ggacgcaaat ggaggagttg 420

aacaagttaa tttggttaat gttaattgat agttatggat taggggatga ctcattgaag 480

atgaactaca caacgttggt gcggatgatg aaatatatgg cccctccacc aggagagtat 540

gaaagaggac tctttgctca tactgataaa ccagtaagca cactcatttg tgaggatcaa 600

atttcaggac tggaaattga ggtcaatgat ggtcaatgga tcaagctaac taatttatct 660

ccttcttcct ttgtatttgt ggttggagat cccctcaagg cttggagcaa tgggagattg 720

aaatcagtga atcacagagt gatgatgagc ggagacaaag atcgatactc tatagcagct 780

ttcgtcattc caaatgaggg tactataatc aagacaccca aagagtttat agatgaccaa 840

catcctcggc ttttcaagga cttagatttc atggagttct tcctttatgc cttttccgat 900

cctgcaaggc acatcgacaa cggggagttg ctccatgtct ttgctggcct ctcaccacca 960

gtttccaatt aa 972

<210> 2

<211> 323

<212> PRT

<213> 棉花(Gossypium spp.)

<400> 2

Met Pro Gly Val Asn Pro Glu Ile Glu Phe Pro Ala Ile Glu Phe Arg

1 5 10 15

Leu Ser Asp Leu Lys Arg Gly Thr Glu Gly Trp Asn Arg Leu Cys Lys

20 25 30

Arg Val Gln Glu Ala Cys Glu Thr Phe Gly Cys Phe Glu Val Val Tyr

35 40 45

Glu Lys Val Ser Thr Lys Leu Arg Glu Asp Ala Phe Gly Leu Met Lys

50 55 60

Glu Met Val Glu Leu Pro Val Glu Thr Lys Gln Lys Asn Asn Ser Pro

65 70 75 80

Met Pro Tyr His Gly Trp Val Gly Pro Cys Lys Gln Val Ser Val Leu

85 90 95

Tyr Glu Gly Phe Gly Val Gly Asp Ala Ser Asn Tyr Asp Ser Val Lys

100 105 110

Ser Phe Ala Gln Leu Met Trp Pro Asn Gly His Pro His Phe Ser Asp

115 120 125

Thr Ile His Thr Leu Gly Thr Gln Met Glu Glu Leu Asn Lys Leu Ile

130 135 140

Trp Leu Met Leu Ile Asp Ser Tyr Gly Leu Gly Asp Asp Ser Leu Lys

145 150 155 160

Met Asn Tyr Thr Thr Leu Val Arg Met Met Lys Tyr Met Ala Pro Pro

165 170 175

Pro Gly Glu Tyr Glu Arg Gly Leu Phe Ala His Thr Asp Lys Pro Val

180 185 190

Ser Thr Leu Ile Cys Glu Asp Gln Ile Ser Gly Leu Glu Ile Glu Val

195 200 205

Asn Asp Gly Gln Trp Ile Lys Leu Thr Asn Leu Ser Pro Ser Ser Phe

210 215 220

Val Phe Val Val Gly Asp Pro Leu Lys Ala Trp Ser Asn Gly Arg Leu

225 230 235 240

Lys Ser Val Asn His Arg Val Met Met Ser Gly Asp Lys Asp Arg Tyr

245 250 255

Ser Ile Ala Ala Phe Val Ile Pro Asn Glu Gly Thr Ile Ile Lys Thr

260 265 270

Pro Lys Glu Phe Ile Asp Asp Gln His Pro Arg Leu Phe Lys Asp Leu

275 280 285

Asp Phe Met Glu Phe Phe Leu Tyr Ala Phe Ser Asp Pro Ala Arg His

290 295 300

Ile Asp Asn Gly Glu Leu Leu His Val Phe Ala Gly Leu Ser Pro Pro

305 310 315 320

Val Ser Asn

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

cgggatccta atagtcccat gccttac 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

gctctagaca ctgatttcaa tctccc 26

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

cgcggatcca tgccgggtgt caatcctga 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

cccaagcttt taattggaaa ctggtggtga 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

cgcggatcca tgccgggtgt caatcctga 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

cccaagcttt taattggaaa ctggtggtga 30

Claims (10)

1.一种调节棉花的棉酚性状的方法，其特征在于，所述方法包括：调节棉花中双加氧酶2-ODD-1的表达或活性；所述双加氧酶2-ODD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调节棉花的棉酚性状是降低棉花的棉酚或半棉酚酮含量，包括下调棉花中双加氧酶2-ODD-1的表达或活性。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将下调双加氧酶2-ODD-1表达的抑制分子转化植物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的抑制分子是以双加氧酶2-ODD-1为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

5. 一种催化合成棉酚生物合成途径的中间体化合物的方法，其特征在于，包括：以式(I)化合物作为底物，以双加氧酶2-ODD-1催化，获得增加一个羟基的产物，产物结构如式(II)；所述双加氧酶2-ODD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

(I)

(II)。

6. 双加氧酶2-ODD-1的用途，用于作为调节棉花的棉酚性状的靶标，制备棉酚性状改良的棉花；所述双加氧酶2-ODD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的调节为降低棉花的棉酚或半棉酚酮含量，包括下调棉花中双加氧酶2-ODD-1的表达或活性。

8. 双加氧酶2-ODD-1的用途，用于在式(I)化合物上增加一个羟基，获得式(II)化合物；所述双加氧酶2-ODD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

(I)

(II)。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的用途为在体用途或离体用途，所述的离体用途包括工业生产棉酚。

10. 双加氧酶2-ODD-1的用途，用于作为棉花棉酚性状的分子标记；所述双加氧酶2-ODD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

Images