CN109207490B - Nfgdh抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途 - Google Patents

Nfgdh抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，特别涉及Nfgdh抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途，Nfgdh抗旱基因来源于发状念珠藻，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，用于提高植物特别是水稻的抗旱性。

Description

Nfgdh抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性 中的用途
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种来源于发状念珠藻的Nfgdh抗旱基因及其编码的氨基酸序列，用于提高植物特别是水稻的抗旱性。
背景技术
发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)主要分布在北半球的干旱或半干旱的荒漠地区，经常受到极度干旱、较大温差、高浓度盐碱、营养缺乏、UV-B辐射等非生物因素的胁迫。胁迫因子可能会对细胞产生一系列的损伤，包括核酸损伤、蛋白质损伤、膜脂损伤等，从而扰乱正常的细胞代谢。经过长期的环境选择和自身结构功能的适应，发状念珠藻已经进化出一系列的生理生态和分子的机制来抵抗各种逆境。因此，发状念珠藻已经成为研究逆境适应机制和发掘抗逆基因的最佳材料之一。
一般而言，大多数蓝藻可以直接吸收环境中的铵，也可以通过特异的转运蛋白，将环境中的氮源运转至细胞内，再由细胞内特定的氧化还原酶将其转换为铵。但不管通过哪个途径，最终经由谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)和谷氨酸合成酶(glutamate synthase,GOGAT)的作用结合到碳骨架2-酮戊二酸(2-oxoglutarate,2-OG)上合成有机物(Muro-Pasto等2005)。也就是说，蓝藻的氮同化代谢过程最终经GS-GOGAT循环与光合碳代谢相联系。谷氨酰胺脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase,GDH)可催化谷氨酸脱氨，使铵进入GS-GOGAT循环。
我国是个自然灾害频发的国家，水资源相对贫乏，在地理和时空上分布极不均匀，使我国的农业经常遭受干旱而造成粮食减产。水稻是我国最重要的粮食作物之一，其生产消耗掉我国近一半的淡水资源，提高水稻等农作物的节水抗旱性能，是保障我国粮食安全和生态安全，保障农业可持续发展的重大需求(Luo，2010)。目前转基因技术已被广泛应用到抗旱水稻的培育中，所采用的策略就是在水稻中表达干旱诱导或抗旱相关基因。因此，对发状念珠藻抗旱基因的克隆和挖掘，并应用在生物基因工程上具有非常重要意义。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种来源于发状念珠藻的Nfgdh抗旱基因，基于发状念珠藻干旱胁迫转录得到，其在干旱胁迫下表达量明显上升(图1)。
本发明的再一目的是提供上述Nfgdh抗旱基因在提高植物抗旱性中的用途，尤其是在水稻中的用途。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
第一方面，Nfgdh抗旱基因，来源于发状念珠藻，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列长度为402bp，具体为：
ATGATAAATTTGATTTCTAGGACGATTGCTAACATCAGTTCCCTACTTAAAGGACTTCAGGTAAAATCTTTTTTGGCTGTTGTCGTAGTTGGTTTTCTAGTGCTGACAACGAATGTCAATTATGGGCAGGAGCAAAATGATAAAGGCTTAAAGGAGAGAGTTCGCGAACAGGTAGAGCAAAATGATGCTCAAAGACCTAAAACAGTAGGGCAGTGGTTTAAGGATGCTCGTGAAACCGAAGATTCTCCTGGTGAAAGACTTCAGAAGATTGGGCAACAATCAGGAGAAGCCTTTAAAGAGTTTGGAGGTGGATACGTAAAGGGCGCTAAAGAAACTGCTAGTGATGTAGGCGACAGTGCGGCAGAGGCAGCCAGAGATGTCTCAAACAAAGTTGGACGCTAA；其编码的氨基酸序列为133个，如SEQ ID NO.2所示，具体为：MINLISRTIANISSLLKGLQVKSFLAVVVVGFLVLTTNVNYGQEQNDKGLKERVREQVEQNDAQRPKTVGQWFKDARETEDSPGERLQKIGQQSGEAFKEFGGGYVKGAKETASDVGDSAAEAARDVSNKVGR。
第二方面，上述Nfgdh抗旱基因在提高植物抗旱性上的用途，所述植物为水稻。
根据所述Nfgdh抗旱基因序列，直接采用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到所述Nfgdh抗旱基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA，携带上述Nfgdh抗旱基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入原核细菌细胞，植物细胞中。通过分离和应用发状念珠藻中包含Nfgdh抗旱基因的DNA片段，可以使大肠杆菌和水稻在干旱条件下的抗旱能力增强。
本发明的有益效果在于：
将野生型种子和转Nfgdh基因水稻T2种子进行发芽试验，经过在添加200mM甘露醇的1/2MS培养基培养10天后，野生型平均株高为1.14cm的小芽，而转基因株系长势明显优于野生型对照，转基因家系平均株高位3.88cm，证实在水稻中超表达Nfgdh抗旱基因提高了转基因植株的抗旱性。
附图说明
图1是实施例1中Nfgdh基因在发菜失水转录组的表达情况对比图。
图2是实施例1中Nfgdh基因在失水胁迫下的表达分析。
图3是实施例3中转Nfgdh基因藻株和对照藻株在干旱处理后的复水生长状况对比图。
图4是本发明选用的植物超量表达载体ub-06载体图。
图5是实施例4中转Nfgdh基因水稻株系的表达量检测图。
图6是实施例5中的转Nfgdh基因水稻株系OE-3，OE-5，OE-6和OE-8与野生型WT在添加200mM甘露醇的平板中生长10天后的株高统计(A)；OE-3和野生型WT在添加200mM甘露醇的平板中生长10天后的生长表现(B)。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：发状念珠藻Nfgdh基因的克隆
(1)发状念珠藻的培养
液体培养的发状念珠藻(天然野生样品采样于内蒙古自治区苏尼特左旗)。接种前用玻璃匀浆器匀浆藻种使藻丝分散，然后接种到300mL，BG11培养基中进行无菌培养，培养温度25℃，光强20±2μmol photons m-2s-1(24h连续光照)，每天早中晚摇藻三次，使藻细胞悬浮、均匀接受光照。
(2)DNA提取
将步骤(1)中培养的发状念珠藻样品在液氮中研磨，分装到1.5mL离心管中，加入1mL提取液(100mmol/L的Tris-HCl，500mmol/L的NaCl，50mmol/L的EDTA，PH8.0)，100微升20％SDS，10微升10mg/mL蛋白酶K，充分混匀；37℃裂解30min，每5min混匀一次；12000rpm离心10min，取上清加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温静置2min；12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿/异戊醇，充分混匀，室温静置2min；12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿，充分混匀，室温静置2min；12000rpm离心10min，取上清加入等体积异丙醇，加入1/10体积的3MNaAc，充分混匀，可见白色丝状物；用10微升吸头挑取白色丝状沉淀，转入70％乙醇洗2次；空气中晾干，加入30微升Buffer EB溶解。
(3)Nfgdh全长序列的扩增
在发状念珠藻失水转录组分析中，在失水10％，失水30％，失水50，失水70％，失水90％的条件下，Nfgdh基因的表达都显著升。通过转录组测序获得Nfgdh基因的全长序列，根据序列信息设计上下游引物(NfgdhF1:5-ATGATAAATTTGATTTCTAGG-3，NfgdhR1：5-CATTTAGCGTCCAACTTTG-3)，如序列表SEQ ID NO.3-4所示。
从发状念珠藻基因组DNA中克隆获得了Nfgdh基因，通过测序验证，扩增产物是本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(1-402bp)。
(4)Nfgdh基因在失水处理下的表达谱分析
将固体发菜浸泡在BG11培养基中，2天后达到完全饱和。并开始失水处理，在失水0％，失水10％，失水30％，失水50％，失水70％和失水90％6个时间点取样，置液氮中研磨。使用TIANGEN公司的RNAprep Pure多酚多糖植物总RNA提取试剂盒(目录号：DP441)提取发菜的总RNA，电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
逆转录合成第一链cDNA
反转录之前需用DNaseI消化所提取RNA样品，反应体系如下：
Figure BDA0001848921880000041
37℃反应15min后，加入0.25μL 0.1M EDTA(保证终浓度>2mM)，70℃温育10min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。
第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：
DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μL的反应体系：
Figure BDA0001848921880000042
将上反应体系于42℃温育15min；然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；4℃或冰上放置5min。制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。
基因表达的定量分析使用Takara公司的
Figure BDA0001848921880000051
Premix Ex TaqTM(Perfect RealTime)试剂盒，和美国
Figure BDA0001848921880000052
7000定量PCR仪进行。根据Nfgdh序列设计定量引物(NfgdhQF：5-GTTGTCGTAGTTGGTTTTCT-3；NfgdhQR：5-ACTGTTTTAGGTCTTTGAGC-3，引物序列如序列表SEQ ID NO.5-6所示)。以水稻持家基因actin(GenBank accession No.AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。
20μL反应体系的配制：
Figure BDA0001848921880000053
反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设DissociationStage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图，见图2。
实施例2：转Nfgdh基因鱼腥藻藻株的构建
(1)穿梭表达载体的构建
以pRL25N-PpetE-LGFP质粒为模板，扩增PmpetE启动子片段，并进行加dATP反应，切胶回收500bp大小PmpetE片段。回收的PmpetE片段连接pMD-18T载体，转化E.coliDH5α，长出转化子后，进行菌落PCR鉴定。挑取正确的转化子在LB液体培养基中扩大培养，送公司测序。将测序正确的PmpetE-pMD-18T转化子扩大培养，提取PmpetE-pMD-18T质粒。用BamH I和Xho I同步双酶切PmpetE-pMD-18T质粒，切胶回收500bp左右的PmpetE启动子片段。同时pRL25N-PpetE-LGFP质粒用BamH I和Xho I同步双酶切，切胶回收7900bp左右大片段。连接PmpetE-pMD-18T(BamH I和XhoI酶切回收)和pRL25N-PpetE-LGFP(BamH I和XhoI酶切回收)，转化E.coliDH5α，长出转化子后，做菌落PCR鉴定，鉴定正确的转化子扩大培养，提质粒pRL25N-PmpetE-LGFP。SmaI单酶切pRL25N-PmpetE-LGFP质粒，过柱回收单酶切产物，将此步单酶切产物进行加dTTP反应，过柱回收得到pRL25N-PmpetE-LGFP(Sma I酶切后，加T回收)。
连接目的基因与载体：将实施例1的目的基因加dATP回收产物连接载体酶切回收产物pRL25N-PmpetE-LGFP(Sma I酶切后，加T回收)，转化E.coliDH5α，长出转化子后，菌落PCR鉴定，正确的转化子送测序。
转化E.coli HB101：将测序正确的转化子扩大培养，提质粒。质粒转化E.coliHB101(含有辅助质粒pRL443和结合质粒pRL623)，菌落PCR鉴定正确的转化子菌株液体扩大培养，用于转化鱼腥藻PCC 7120。
(2)鱼腥藻PCC 7120的转化
利用三亲本杂交法进行鱼腥藻转化，方法步骤如下：(A)藻的收集：100mL对数生长后期的野生型藻株分装到50mL灭菌的大离心管中，室温5000rpm，离心5min，弃上清，收集沉淀藻细胞。(B)藻细胞的清洗与重悬：沉淀藻细胞中加灭菌的BG11培养基至45mL刻度，室温5000rpm，离心5min，弃上清。重复此步骤一次。沉淀藻细胞重悬于10mLBG11培养基中。(C)菌的收集：50mL供体菌转移到50mL灭菌的大离心管中，室温4000rpm，离心5min，弃上清。(D)菌的清洗与重悬：沉淀菌细胞加灭菌的LB液体培养基至45mL刻度，室温4000rpm，离心5min，弃上清。重复此步骤一次。沉淀菌细胞中加1mL LB培养基，吹打重悬。(E)藻与菌的混合：转移步骤(D)中的菌到步骤(B)中的藻细胞中，加BG11至35mL刻度，震荡混匀，使藻和菌充分接触。室温5000rpm，离心5min，弃上清。加300-500μLBG11至沉淀藻中，吹打混匀。将菌藻混合物转移到1.5mL灭菌的EP管中。(F)弱光适应：步骤(E)中菌藻混合物置于30℃恒温光照培养箱中，弱光下放置1h，期间颠倒混匀1次。(G)铺膜涂平板：将已灭菌的0.45μm微孔滤膜平铺到固体无抗BG11平板上。吸取400-500μL步骤(F)中的菌藻混合物到滤膜上，用枪尖拨动使其均匀分布。于超净工作台中吹干，封平板，置于30℃恒温光照培养箱中，弱光下适应培养24h。(H)抗性筛选：在超净工作台中把含有菌藻混合物的滤膜转移到含50μg/mL Neo的BG11(Neo50BG11)固体平板上。30℃弱光下培养。2周左右即可出现转化子。
(3)超表达藻株的筛选与鉴定
超表达藻株的筛选：Neo50BG11固体平板上出现单克隆转化子后，挑选单克隆在Neo50BG11固体平板上划线扩大培养。将能够生长的单克隆在Neo50BG11固体平板上划线转接2-3代。
超表达藻株的鉴定：鱼腥藻PCC 7120gDNA的提取：取5mL对数期藻，室温6000rpm，离心5min，弃上清。加400μL1×TE buffer(pH8.0)，吹打混匀。加入少量石英砂、200μLTris饱和酚和200μL氯仿：异戊醇(V/V＝24：1)，在振荡器上剧烈震荡1-2min，室温12000rpm，离心5min，吸取上清400μL转移至另一新的1.5mLEP管中，加0.5μLRNase A，置于37℃恒温水浴锅中消化30-40min。加400μL氯仿：异戊醇(V/V＝24：1)，颠倒混匀。室温12000rpm，离心5min，吸取上清约300μL转移至另一干净1.5mLEP管中，加入1/5体积(60μL)5M NaCl，再加2倍体积(720μL)无水乙醇，上下颠倒混匀。置于-20℃冰箱，过夜沉降。4℃，12000rpm，离心20min，弃上清，可见无色透明状沉淀即为gDNA，沉淀中加入1mL70％乙醇，颠倒混匀。7000rpm，4℃，5min，弃上清，沉淀于室温晾干(约5min)，加入50μL去离子水吹打混匀，溶解gDNA。
PCR鉴定超表达藻株：取1μL gDNA作模板，进行PCR鉴定。PCR体系和程序如下：
PCR反应体系
Figure BDA0001848921880000071
PCR程序
Figure BDA0001848921880000072
备注：循环数28cycles。
实施例3：转Nfgdh基因鱼腥藻藻株的抗性鉴定
将藻液均匀涂抹在固体Neo50BG11平板上，只盖盖子不封平板，让平板自然蒸发失水干燥(即藻株在生长的同时遭遇干旱胁迫，并且随着时间的延长干旱胁迫越严重)，待固体培养基中水分几乎完全蒸发而形成一块透明薄膜时，添加2mL BG11复水，50天后观察藻的恢复情况。结果显示：刚复水时，两藻株长势基本一致。但随着复水后时间的延长，对照藻株(42)会渐渐死亡，即干燥后不能恢复生长，而转Nfgdh基因藻株(14号)则可以恢复生长，表明14号藻株可以抵抗失水干燥逆境，具有耐受干旱胁迫的能力。
实施例4：发状念珠藻Nfgdh超量表达转化水稻
以实施例1中已获得Nfgdh基因为模板，用前引物NfgdhF3：5-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCATGATAAATTTGATTTCTAGG-3，后引物NfgdhR3：5-GAGAACACGGGGGACTCTAGACATTTAGCGTCCAACTTTG-3，进行PCR扩增，引物序列如序列表SEQ ID NO.7-8所示，产物经回收纯化后，通过One Step Cloning Kit重组反应，将扩增产物片段克隆至载体ub-06。具体过程如下：
(1)PCR扩增，按实施例1所述。
(2)PCR产物的回收，按实施例1所述。
(3)重组反应
采用南京诺唯赞生物科技有限公司的One Step Cloning Kit试剂盒进行重组反应如下：
将2μg环状ub-06质粒加入到20μL酶切反应体系中，37℃酶切2hr。限制性内切酶使用量为BamHI和XhoI各1μL。酶切完成后，将酶切产物置于65℃加热20min，失活内切酶。
于冰水浴中配制如下反应体系。
Figure BDA0001848921880000081
体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。然后取20μL冷却反应液，加入到200μL表达感受态DH5α细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2min。加入900μL LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μL菌液均匀涂布在含有抗生素Amp+的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养，测序获得含Nfgdh的质粒u6-Nfgdh。
(4)农杆菌转化
将1μL u6-Nfgdh质粒加入到100μL农杆菌EHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；加入400-800μLYEP培养液(Kan+)，28℃，200r/min震荡培养3-5h；室温离心(5000r/min，5min)，保留100μL上清重悬菌体，涂布于LA固体培养基(Kan+)，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落，挑取单克隆进行PCR检测，获得阳性菌株。
(5)愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75％的乙醇消毒1min，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。
愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。
(6)继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。
继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2mL2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。
(7)农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌，挑取阳性单菌落，在1mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。
悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成100mL溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50mL)，高温高压灭菌。使用之前加入1mL 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。
共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0mL2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20mL 50％的葡萄糖和1mL AS(100mM)。
(8)筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。
筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1mL Hn和1mL Cn(100ppm)。
(9)分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。
分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。
(10)生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。
生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。
(11)转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。
表1：基本培养基成分1
Figure BDA0001848921880000101
表2：基本培养基成分2
Figure BDA0001848921880000111
(12)超量表达植株的阳性检测
剪取再生植株叶片，利用CTAB法抽提DNA，利用hpt特异引物(hptF：ACACTACATGGCGTGATTTCAT；hptR：TCCACTATCGGCGAGTACTTCT)进行PCR检测，引物序列如序列表SEQ ID NO.9-10所示。
PCR体系：
Figure BDA0001848921880000112
PCR反应程序：
Figure BDA0001848921880000113
(13)超量表达阳性植株中目的基因的表达水平检测
取T0代水稻叶片，置于液氮研磨，提取RNA。具体如下：
RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mL TRNzol-A+试剂(天根生化科技有限公司)的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2mL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mLEP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μL RNase-free ddH2O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
逆转录合成第一链cDNA
反转录之前需用DNaseI消化所提取RNA样品，反应体系如下：
Figure BDA0001848921880000121
37℃反应15min后，加入0.25μL 0.1M EDTA(保证终浓度>2mM)，70℃温育10min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。
第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：
DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μL的反应体系：
Figure BDA0001848921880000122
将上反应体系于42℃温育15min；然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；4℃或冰上放置5min。制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。
基因表达的定量分析使用Takara公司的
Figure BDA0001848921880000123
Premix Ex TaqTM(Perfect RealTime)试剂盒，和美国
Figure BDA0001848921880000124
7000定量PCR仪进行。根据Nfgdh序列设计定量引物(NfgdhQF：5-GTTGTCGTAGTTGGTTTTCT-3；NfgdhQR：5-ACTGTTTTAGGTCTTTGAGC-3，引物序列如序列表SEQ ID NO.5-6所示)。以水稻持家基因actin(GenBank accession No.AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。
20μL反应体系的配制：
Figure BDA0001848921880000131
反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设DissociationStage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图，见图5。
实施例5：转基因水稻T2代种子的芽期甘露醇模拟干旱处理
将超量表达转基因家系种子去壳消毒(75％酒精处理1min，1.5％NaClO处理20min，无菌水清洗5次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型对照晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上。待发芽2～3天后挑选发芽好且长势一致的种子，转移到含200mM的1/2MS培养基中培养，10天后统计生长情况。实验结果显示经过10天胁迫培养后，野生型对照的平均株高为1.14cm，而转基因株系平均株高为3.88cm，具体如图6所示，说明在水稻中超表达Nfgdh基因的确提高了转基因植株的抗旱性。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
序列表
<110> 上海市农业生物基因中心
<120> Nfgdh抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途
<130> 2018-10-29
<141> 2018-10-31
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 402
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 1
atgataaatt tgatttctag gacgattgct aacatcagtt ccctacttaa aggacttcag 60
gtaaaatctt ttttggctgt tgtcgtagtt ggttttctag tgctgacaac gaatgtcaat 120
tatgggcagg agcaaaatga taaaggctta aaggagagag ttcgcgaaca ggtagagcaa 180
aatgatgctc aaagacctaa aacagtaggg cagtggttta aggatgctcg tgaaaccgaa 240
gattctcctg gtgaaagact tcagaagatt gggcaacaat caggagaagc ctttaaagag 300
tttggaggtg gatacgtaaa gggcgctaaa gaaactgcta gtgatgtagg cgacagtgcg 360
gcagaggcag ccagagatgt ctcaaacaaa gttggacgct aa 402
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> 未知()
<400> 2
Met Ile Asn Leu Ile Ser Arg Thr Ile Ala Asn Ile Ser Ser Leu Leu
1 5 10 15
Lys Gly Leu Gln Val Lys Ser Phe Leu Ala Val Val Val Val Gly Phe
20 25 30
Leu Val Leu Thr Thr Asn Val Asn Tyr Gly Gln Glu Gln Asn Asp Lys
35 40 45
Gly Leu Lys Glu Arg Val Arg Glu Gln Val Glu Gln Asn Asp Ala Gln
50 55 60
Arg Pro Lys Thr Val Gly Gln Trp Phe Lys Asp Ala Arg Glu Thr Glu
65 70 75 80
Asp Ser Pro Gly Glu Arg Leu Gln Lys Ile Gly Gln Gln Ser Gly Glu
85 90 95
Ala Phe Lys Glu Phe Gly Gly Gly Tyr Val Lys Gly Ala Lys Glu Thr
100 105 110
Ala Ser Asp Val Gly Asp Ser Ala Ala Glu Ala Ala Arg Asp Val Ser
115 120 125
Asn Lys Val Gly Arg
130
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 3
atgataaatt tgatttctag g 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 4
catttagcgt ccaacttt 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 5
gttgtcgtag ttggttttct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 6
actgttttag gtctttgagc 20
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 7
cgatcgggga aattcgagct catgataaat ttgatttcta gg 42
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 8
gagaacacgg gggactctag acatttagcg tccaactttg 40
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 9
acactacatg gcgtgatttc at 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 10
tccactatcg gcgagtactt ct 22

Claims (3)

1.Nfgdh抗旱基因在提高植物抗旱性中的用途，其特征在于，所述Nfgdh抗旱基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述植物为水稻。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Nfgdh抗旱基因来源于发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Nfgdh抗旱基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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Genome‑wide identification of glutathione peroxidase (GPX) gene family and their response to abiotic stress in cucumber;Yong Zhou等;《3 Biotech》;20180303(第8期);第1-11页 *
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