JP2021510495A - 代謝工学 - Google Patents
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Abstract
Description
・ オキシドスクアレンシクラーゼ、
・ C−28位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をカルボン酸に酸化することができる酵素、
・ C−16α位においてβ−アミリン又はオレアノール酸などのその酸化誘導体をアルコールに酸化することができる酵素、
・ C−23位においてβ−アミリン又はエキノシスト酸などのその酸化誘導体をアルデヒドに酸化することができる酵素。
・ β−アミリンシンターゼ、
・ β−アミリンをオレアノール酸に酸化することができる酵素、
・ オレアノールをエキノシスト酸に酸化することができる酵素、
・ エキノシスト酸をQAに酸化することができる酵素。
宿主又はその1つ又は複数の細胞内で異種核酸を発現させる工程であって、核酸を宿主又はいずれかの祖先に導入する前工程の後の工程を含み、
その異種核酸は、各々が前記QA生合成活性を組み合わせて有するポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含む、方法が提供される。
・ トリテルペンへの普遍的な直鎖前駆体2,3−オキシドスクアレン(OS)の環化のためのβ−アミリンシンターゼ(bAS)、
・ C−28位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をカルボン酸に酸化することができるCYP450、C−16α位においてβ−アミリン又はオレアノール酸などのその酸化誘導体をアルコールに酸化することができるCYP450、
・ C−23位においてβ−アミリン又はエキノシスト酸などのその酸化誘導体をアルデヒドに酸化することができるCYP450
のうちのいくつか又は全て(1つ、2つ、3つ又は4つ)をコードする。
・ C−28位においてβ−アミリンを、オレアノール酸を形成するカルボン酸に酸化することができるCYP450、
・ C−16α位においてオレアノール酸を、エキノシスト酸を形成するアルコールに酸化することができるCYP450、
・ C−23位においてエキノシスト酸を、QAを形成するアルデヒドに酸化することができるCYP450
であってもよい。
C−28オキシダーゼは、CYP716である
β−アミリンシンターゼ(bAS)=配列番号2
C−28オキシダーゼ=配列番号4
C−16αオキシダーゼ=配列番号6
C−23オキシダーゼ=配列番号8
又は以下に説明されるようなこれらのバリアント若しくは断片。
C−28オキシダーゼ=配列番号18
C−16αオキシダーゼ=配列番号10若しくは12
C−23オキシダーゼ=配列番号14若しくは16
又は以下に説明されるようなこれらのバリアント若しくは断片。
これらのQA遺伝子(及びポリペプチド)の使用に加えて、本発明はこれらの遺伝子(及びポリペプチド)のバリアントの使用を包含する。
(i)天然に存在する核酸、例えば対立遺伝子(1つ又は複数の塩基において多型又は突然変異を含む)又は偽対立遺伝子(本発明のQA遺伝子と密接した遺伝子座において生じ得る)。また、本発明のQA遺伝子と同じファミリーに属するパラログ、イソ遺伝子、又は他の相同遺伝子も含まれる。また、他の植物種由来のオルソログ又はホモログも含まれる。
本発明の実施形態では、本明細書に記載される本発明のQA遺伝子及びバリアント核酸に加えて、QA産生のフラックスに作用し得る付加遺伝子を導入することが好ましいことがある。
本発明の一態様として、上記に説明されている生合成経路におけるそれらの協調発現のための上記に説明されているQA核酸の1つ又は複数を各々保有している複数のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の共インフィルトレーションを利用する方法が開示されている。
(i)プロモーターであって、以下と作動可能に連結されている、プロモーター、
(ii)RNA−2ゲノムセグメントにおける標的開始部位が突然変異されている、二分RNAウイルスのRNA−2ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列、
(iii)上記されているQA核酸配列、
(iv)転写終結配列、及び任意選択により
(v)前記転写終結配列の上流に位置する3’UTR
を含む発現カセットを含む。
本発明の態様では、宿主は、宿主がOSからの効果的なQA生合成を実行できない表現型から、宿主が前記QA生合成を実行できる表現型に変換され得、その結果、QAは宿主から回収され得るか、又は下流産生物を合成するためにin vivoで利用され得る。宿主の例には、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)などの植物及び酵母などの微生物が含まれる。これらは以下により詳細に説明されている。
前記核酸の発現は、形質転換された宿主にOSからのQA生合成を実行する能力を付与するか、又は宿主における前記能力を改善する、宿主細胞が提供される。
上記されている方法は、異種宿主においてQAを生成するために使用され得る。QAは一般に、それらが導入される種において天然に存在しない。
本発明の支持として、本発明者らは、その種におけるQAの合成に関与すると考えられるQ.サポナリア由来の配列(配列番号1〜8参照)を新たに特徴付けた。
(i)プロモーターであって、以下と作動可能に連結されている、プロモーター、
(ii)RNA−2ゲノムセグメントにおける標的開始部位が突然変異されている、二分RNAウイルスのRNA−2ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列、
(iii)上記されているQA核酸配列、
(iv)転写終結配列、及び任意選択により
(v)前記転写終結配列の上流に位置する3’UTR
を含む発現カセットを含む。
上記のように、本発明の支持として、本発明者らは、QA生合成に作用するポリペプチドをコードすると考えられているQ.サポナリア由来の遺伝子を同定した(表1の配列番号1〜8参照)。
したがって、それら自体で本発明の態様を形成する。
本明細書に記載されるのは、上記に開示されている本発明のQA遺伝子のいずれか、特にQ.サポナリア由来のQA配列を修飾する工程を含む、誘導体核酸を産生する方法である。
本発明は、上記に開示されている本発明のQA遺伝子をコードするポリペプチドの断片、特にQ.サポナリア由来のQA配列を利用することができる。
(a)例えば、植物細胞から核酸の調製物を準備する工程。試験核酸は、ゲノムDNA、cDNA若しくはRNA、又はこれらのいずれかの混合物として、好ましくは適切なベクターにおけるライブラリーとして、細胞から準備され得る。ゲノムDNAが使用される場合、プローブは、本明細書以下に記載されるように、遺伝子の非転写領域(例えば、プロモーターなど)を同定するために使用され得る、
(b)上記に説明されているプローブ又はプライマーである核酸分子を準備する工程、
(c)前記調製物におけるいずれかの前記遺伝子又はホモログとの前記核酸分子のハイブリダイゼーションのための条件下で前記調製物における核酸を前記核酸分子と接触させる工程、及び
(d)存在する場合、前記核酸分子とのそのハイブリダイゼーションによって前記遺伝子又はホモログを同定する工程。標的核酸(例えば、DNA)とのプローブの結合は、当業者が自由に使える種々の技術のいずれかを使用して測定することができる。例えば、プローブは、放射性標識され、蛍光標識され、又は酵素的に標識されてもよい。プローブの標識化を利用しない他の方法は、PCR(以下を参照)、RN’ase切断及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングを使用する増幅を含む。成功したハイブリダイゼーションの同定の後に、ハイブリダイズした核酸の単離が続き、これは、適切な宿主におけるベクターのPCR又は増幅の1つ又は複数の工程を含み得る。
(a)例えば、種子又は他の適切な組織若しくは器官から植物核酸の調製物を準備する工程、
(b)PCRに有用な(すなわち、適切な)一対の核酸分子プライマーを準備する工程であって、前記プライマーの少なくとも1つは上記に説明されている本発明によるプライマーである、工程、
(c)PCRを実施するための条件下で前記調製物における核酸を前記プライマーと接触させる工程、
(d)PCRを実施し、増幅されたPCR産物の存在又は非存在を決定する工程。増幅されたPCR産物の存在は、バリアントの同定を示し得る。
最近、Q.サポナリアからのトランスクリプトームデータセットが、1KPプロジェクトを通じて利用可能になった[1]。このデータセットは、Q.サポナリア葉組織のHiSeqシークエンシング(Illumina)に由来する。
最初に検索した候補はβ−アミリンシンターゼ(bAS)OSCであった。関連するマメ目の種由来を含む、多数のbAS酵素を特徴付けする。
本発明者らは、β−アミリンの酸化に関与する可能性の高いクラスの酵素はシトクロムP450(P450)であると推測した。これらの酵素は、通常、単一の植物ゲノムにおいて200を超える代表がある、非常に大きな遺伝子スーパーファミリーによってコードされる。
Q.サポナリアの木は、UK内の種苗場(Burncoose Nurseries, Cornwall)から得た。[26]に詳述されている改変プロトコールによって、Qiagen RNeasy Plant RNA抽出キットを使用してRNAを単一の木の葉及び根から抽出した。このRNAを、製造業者の説明書に従ってSuperscript III(Invitrogen)を使用してcDNA合成についての鋳型としてさらに使用した。
QsbASは単機能性β−アミリンシンターゼである
種々のクローニングした遺伝子の一過性発現をベンサミアナタバコにおいて実施した。全ての組合せは、A.ストリゴサHMG−CoAレダクターゼ(tHMGR)のフィードバック非感受性切断型を保有する株の共インフィルトレーションを含んだ。この酵素は、ベンサミアナタバコにおける一過性発現時にトリテルペン含量を増加させることが実証されている[5]。利用した配列を配列番号29〜32として示す。
次に、QsbASを種々のP450の組合せにより試験した。これにより、CYP716酵素の両方がβ−アミリンに対して活性を示すことが明らかになった。CYP716−2073932はC−28オキシダーゼであることが見出され、β−アミリンの大部分をオレアノール酸に変換した。CYP716−2012090は、少量のβ−アミリンを、16α−ヒドロキシ−β−アミリンとして推定的に同定した産生物に変換した(以前に公開された質量スペクトルとの比較に基づく[6、7])(図5;図5s)。
C−28及びC−16αオキシダーゼの発見に続いて、傑出したQ.サポナリアC−23オキシダーゼに注目した。C−28及びC−16αオキシダーゼの同定は、公知のトリテルペン酸化P450の相同性に基づく検索によって促進された。他の候補は、2つのCYP72ファミリーメンバー(OQHZ-2012357及びOQHZ-2019977)を含む、公知のトリテルペンオキシダーゼとの相同性に基づいて考慮され、その候補に関して、関連するマメ科の種であるタルウマゴヤシにおいてC−23オキシダーゼが同定されている。しかしながら、植物体においてクローニング及び試験をすると、これらの候補のいずれも、β−アミリン、又はそのC−28/C−16α酸化誘導体に対して明らかな活性を示さなかった(データは示さず)。
上記されているQ.サポナリア由来のβ−アミリンシンターゼ並びにC−28、C−16α及びC−23オキシダーゼは、一緒に発現される場合、キラ酸を産生するのに十分でなければならない(図2参照)。
・tHMGR/QsbAS/CYP716−2073932/CYP716−2012090/CYP72A68v2
・tHMGR/QsbAS/CYP716−2073932/CYP716−2012090/CYP94D65
の組み合わせの両方のセットが、キラ酸標準物の保持時間及び質量スペクトルに一致する新規産生物の出現をもたらすことが明らかになった(結果は示さず)。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、商業的QA産生のための宿主体(host chassis)として利用することができる。
トリテルペンは、操作されたトランスジェニック植物系統(例えば、シロイヌナズナ属、小麦)を使用して以前に産生されている。多重遺伝子ベクターの構築を可能にし、全経路の単一遺伝子座への組込みを可能にする一連のGolden Gate[23]ベクターが報告されている。これらは、本明細書の開示に照らして、本発明に類似的に適用することができる。
キラ酸はトリテルペノイドであり、キラヤ・サポナリアによって産生されるサポニンQS−21の重要な前駆体である。
一過性発現後のベンサミアナタバコにおけるキラ酸産生を推定するために、LC−CADによる分析を実行した。Q.サポナリアβ−アミリンシンターゼ並びにC−16α、C−23及びC−28オキシダーゼを使用して、以前に記載されるように、アグロインフィルトレーションを実施した。対照として、2つのみの(C−23及びC−28)オキシダーゼをインフィルトレーションされた葉を使用し、キラ酸の代わりにギプソゲニンを蓄積させた(図12)。
キラ酸産生がベンサミアナタバコにおいて達成されていることを明確に決定するために、産生物の精製を行った。
インフィルトレーション
以前に記載される(Reed et al., 2017)、無針注射器を使用してアグロインフィルトレーションを実施した。全ての遺伝子は、A.ツメファシエンスLBA4404においてpEAQ−HT−DEST1バイナリー発現ベクター(Sainsbury et al., 2009)から発現させた。全ての植物は、オーツ麦tHMGR、キラヤβ−アミリンシンターゼ(QsbAS)、並びにβ−アミリンC−28(CYP716-2073932)及びC−16α(CYP716-2012090S)オキシダーゼを共発現した。キラ酸産生のために、緑色蛍光タンパク質(GFP)を対照の代わりに使用しながら、C−23(CYP714-7)オキシダーゼも共発現させた。細菌及び植物の培養は、(Reed et al., 2017)に記載される通りである。試験条件ごとに3つの植物がインフィルトレーションされ、生物学的複製物として別々に分析した。
葉をアグロインフィルトレーションの5日後に収集し、凍結乾燥した。凍結乾燥した葉材料(試料当たり10mg)を1000rpmにて1分間粉砕した(Geno/Grinder 2010, Spex SamplePrep)。抽出は、ジギトキシン(内部標準物;Sigma)20μg/mLを含む80%メタノール550μL中で、40℃にて20分間、1400rpmにて振盪(Thermomixer Comfort, Eppendorf)しながら実行した。試料をヘキサン400μLで2回分配した。水相を真空下で40℃にて乾燥させた(EZ-2 Series Evaporator、Genevac)。乾燥材料を100%メタノール75μL中で再懸濁し、12,500gにて30秒間濾過した(0.2μm, Spin-X, Costar)。濾過した試料をガラスバイアルに移し、以下に詳述するように分析した。
シングル四重極質量分析計LCMS−2020(Shimadzu)及びCorona Veo RS荷電化粒子検出器(CAD)(Dionex)を備えるProminence HPLCシステムを使用して分析を実行した。検出:MS(デュアルESI/APCIイオン化、DL温度250℃、ネブライザーガス流量15L.min−1、ヒートブロック温度400℃、スプレー電圧ポジティブ4.5kV、ネガティブ−3.5kV)CAD:データ収集速度10Hz、フィルター定数3.6秒、925エバポレーター温度35℃、イオントラップ電圧20.5V。方法:溶媒A:[H2O+0.1%ギ酸]溶媒B:[アセトニトリル(CH3CN)+0.1%ギ酸。注入量:10μL。勾配:15%[B]0〜1.5分、15%〜60%[B]1.5〜26分、60%〜100%[B]26〜26.5分、100%[B]26.5〜28.5分、100%〜15%[B]28.5〜29分、35%[B]29〜30分。0.3mL.min−1の流速及びKinetexカラム2.6μm XB−C18 100Å、50×2.1mm(Phenomenex)を使用して方法を実施した。
LabSolutionsソフトウェア(Shimadzu)を使用して分析を実施した。産生物収率の推定値を得るために、キラ酸についてのピーク面積(CADによって決定した)を内部標準物(ジギトキシン、1.1μg/mg乾燥葉組織)の面積で割った。結果を3つの複製物から平均化した。キラ酸と同じ保持時間を有する内因性ベンサミアナタバコ産生物についての微小ピークが対照において観察された(計算した平均値0.25μg/mg)。したがって、この値を推定キラ酸収率から差し引いた。
tHMGR、QsbAS、CYP716−2073932、CYP716−2012090S及びCYP714−7オキシダーゼを使用して上記に詳述したようにアグロインフィルトレーションを実行した。合計209個の植物が以前に記載されるように(Reed et al., 2017)真空によってインフィルトレーションされ、4日後に収集した。
ラージスケールインフィルトレーションからの葉を収集し、凍結乾燥し、プログラムが4サイクル(100℃及び130バール圧力)を含むことを除いて、(Reed et al., 2017)に詳述されているようにSpeedExtractor E−914(Buchi)を使用して抽出を実施した。サイクル1(ヘキサン)は保持時間がゼロであり、サイクル2〜4(エタノール)は保持時間が5分であった。2分の溶媒フラッシュ及び6分のN2フラッシュで運転を終了した。抽出物のヘキサン部分を捨て、後続のフラッシュクロマトグラフィーについてエタノール部分を使用し、以下に示した個々のカラムの詳細と共にIsolera One(Biotage)を使用して実施した。各カラム後のキラ酸について、(Reed et al., 2017)に詳述されているようにGC−MS及び薄層クロマトグラフィー(TLC)によって画分をチェックした。各段階において、最も純粋な画分をプールし、後続のカラムへ負荷するためにシリカゲル60(Material Harvest)上で乾燥させた。カラム1:SNAP Ultra 50g(Biotage)、流速:100mL/分、以下の勾配による90mL画分:溶媒A:[ヘキサン]溶媒B:[酢酸エチル];勾配:10カラム体積にわたって5%[B]〜100%[B]、及びさらに5カラム体積について100%[B]にて保持。カラム2:SNAP Ultra 50gカラム(Biotage)、流速100mL/分、以下の勾配による90mL画分:溶媒A:[ジクロロメタン]溶媒B:[酢酸エチル];10カラム体積にわたって10%[B]〜60%[B]、及びさらに2カラム体積について100%[B]にて保持。カラム3:SNAP Ultra 10g(Biotage)、流速:36mL/分、カラム2と同じ勾配による17mL画分。カラム3の後、画分を活性炭により処理して着色不純物を除去し、カラム4に負荷した。カラム4:20カラム体積にわたってジクロロメタン中の15%酢酸エチルのイソクラティック移動相を用いたSNAP Ultra 10gカラム(Biotage)(36mL/分、17mL画分)。プールした画分を、TLCプレート上のストリーキングを減少させるのに役立つ少量のHCl(エタノール約40mL中の濃HCl400μL)により処理した。カラム5:30カラム体積にわたってジクロロメタン中の15%酢酸エチルのイソクラティック移動相を用い、5カラム体積にわたって100%酢酸エチルの最終フラッシュを用いたSNAP Ultra 10gカラム(Biotage)(36mL/分、17mL画分)。最も純粋な画分をプールし、乾燥させて、少量の黄色不純物を含む30mgの白色粉末を得た。これを以下のようにGC−MS、LC−MS及びNMRによって分析した。
GC−MS分析を、(Reed et al., 2017)に記載されるように実施した。LC−MS分析をキラ酸定量について上記のように実施した。NMRスペクトルを、重水素化メタノール中の1H NMRについて400MHzの公称周波数にてフーリエ変換モードにおいて記録した。各分析法について、キラ酸標準物(Extrasynthese)を比較のために使用した。
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表1−Q.サポナリア配列
クローン数とは、元の1KPトランスクリプトームアセンブリからのコンティグ数を指す(https://db.cngb.org/blast4onekp/)
キラル酸に見出される関連位置(16α、28、23)においてβ−アミリン(又はその誘導体)を酸化するシトクロムP450。太字で命名された酵素は、ベンサミアナタバコにおける一過性発現によって試験され、参照された研究によって報告されたものと一致する産生物を生成することが見出された。
Clustal Omega(バージョン1.2.4-https://www.ebi.ac.ukを介してアクセスした)を使用して18個のP450のペアワイズアラインメントを行った。表の数字は遺伝子間のアミノ酸同一性パーセンテージを表す。配列を機能に従って体系化し、本明細書において特徴付けたQ.サポナリア遺伝子を太字で示す。全てのペアワイズ値を2回表し、したがって冗長配列を灰色の背景で表に右上に示す。表は、提示を容易にするために2頁に分割されている。
本明細書に記載されるNBの長い及び短いアイソフォームは、以下の配列において下線を引いている最初の63ヌクレオチド(21アミノ酸)の存在によって区別される。
NB:全長HMGR配列を以下に提供する。5’領域(下線)を除去して切断型フィードバック非感受性形態(tHMGR)を生成することができる。tHMGRについての配列もまた、以下に別々に示す。
Claims (44)
- 宿主を、前記宿主が2,3−オキシドスクアレン(OS)からのキラ酸(QA)生合成を実行できない表現型から、前記宿主が前記QA生合成を実行できる表現型に変換する方法であって、
前記宿主又はその1つ又は複数の細胞内で異種核酸を発現させる工程であって、前記核酸を前記宿主又はいずれかの祖先に導入する前工程の後の工程を含み、
前記異種核酸が、各々が前記QA生合成活性を組み合わせて有するポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含む、方法。 - 前記核酸が、以下のポリペプチド
(i)トリテルペンへのOSの環化のためのβ−アミリンシンターゼ(bAS)、
(ii)C−28位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をカルボン酸に酸化することができる酵素(「C−28オキシダーゼ」)、
(iii)C−16α位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をアルコールに酸化することができる酵素(「C−16αオキシダーゼ」)、及び
(iv)C−23位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をアルデヒドに酸化することができる酵素(「C−23オキシダーゼ」)
の全てをコードし、
前記ポリペプチドの各々が任意選択によりQ.サポナリアから得られる、請求項1に記載の方法。 - 前記C−28オキシダーゼ、C−16αオキシダーゼ及びC−23オキシダーゼが、全てCYP450酵素である、請求項1又は2に記載の方法。
- (i)前記C−28オキシダーゼがCYP716であり、
(ii)前記C−16αオキシダーゼが、CYP716又はCYP87であり、
(iii)前記C−23オキシダーゼが、CYP714、CYP72又はCYP94である、請求項3に記載の方法。 - 前記bAS、C−28オキシダーゼ、C−16αオキシダーゼ及びC−23オキシダーゼポリペプチドが、表1又は2におけるそれぞれのポリペプチド、又は任意選択により表4に規定されている、前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片から選択されるか、或いは表1又は2におけるそれぞれのポリヌクレオチド、又は任意選択により表4に規定されている、前記ポリヌクレオチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片によってコードされる、請求項4に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、
(i)配列番号2に示されるβ−アミリンシンターゼ(bAS)、
(ii)配列番号4若しくは18に示されるか、又は配列番号19〜28のいずれかによってコードされるC−28オキシダーゼ、
(iii)配列番号6、10若しくは12に示されるC−16αオキシダーゼ、
(iv)配列番号8、14若しくは16に示されるC−23オキシダーゼ
又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片
からなるリストから選択される、請求項5に記載の方法。 - 前記ポリペプチドが、
(i)配列番号2に示されるβ−アミリンシンターゼ(bAS)、
(ii)配列番号4に示されるC−28オキシダーゼ、
(iii)配列番号6に示されるC−16αオキシダーゼ、
(iv)配列番号8に示されるC−23オキシダーゼ
又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片
からなるリストから選択される、請求項6に記載の方法。 - 前記核酸が、以下のポリペプチド:
(i)HMG−CoAレダクターゼ(HMGR)、
(ii)スクアレンシンターゼ(SQS)、
のうちの1つ又は複数をさらにコードし、
前記HMGR又はSQSは、任意選択により表3におけるそれぞれのポリペプチド又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片から選択されるか、或いは表3におけるそれぞれのポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片によってコードされる、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ヌクレオチド配列が、2つ又はそれ以上の異なる核酸分子に存在する、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、各々が前記核酸分子の1つ又は複数を保有する複数のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の共インフィルトレーションによって導入される、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸分子が一過性発現ベクターである、請求項10に記載の方法。
- 前記一過性発現ベクターの各々が、
(i)プロモーターであって、以下と作動可能に連結されている、プロモーター、
(ii)RNA−2ゲノムセグメントにおける標的開始部位が突然変異されている、二分RNAウイルスの前記RNA−2ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列、
(iii)前記QA生合成活性を組み合わせて有する前記ポリペプチドのうちの1つをコードするヌクレオチド配列、
(iv)転写終結配列、及び任意選択により
(v)前記転写終結配列の上流に位置する3’UTR
を含む発現カセットを含む、請求項11に記載の方法。 - 異種核酸を含有するか又は前記異種核酸で形質転換された宿主細胞であって、前記異種核酸が、各々がQA生合成活性を組み合わせて有するポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含み、
前記核酸の発現が、前記形質転換された宿主にQA生合成を実行する能力を付与する、宿主細胞。 - 請求項1から12のいずれか1項に記載の方法によって得ることができる、請求項13に記載の宿主細胞。
- 前記核酸を含む複数の組換え構築物を、それを一過性発現するための細胞に共インフィルトレーションさせることによって請求項13又は14に記載の宿主細胞を産生するプロセス。
- ベクターを介して前記核酸を細胞に導入し、前記核酸をゲノムに導入するために前記ベクターと前記細胞ゲノムとの間で組換えを引き起こすか、又は可能にすることによって前記細胞を異種核酸で形質転換することによって請求項13又は14に記載の宿主細胞を産生するプロセス。
- トランスジェニック植物を産生する方法であって、
(a)請求項16に記載のプロセスを実施する工程であって、前記宿主細胞が植物細胞である、工程、
(b)形質転換された植物細胞から植物を再生する工程
を含む、方法。 - 請求項17に記載の方法によって得ることができるトランスジェニック植物、又は前記トランスジェニック植物のクローン、又は自家若しくは雑種後代、又は他の子孫であるトランスジェニック植物であって、
前記異種核酸の発現が、それ以外の点で前記トランスジェニック植物に対応する野生型植物と比較して、QA生合成を実行する増加した能力を付与する、トランスジェニック植物。 - 作物又は蘚類である、請求項18に記載の植物。
- 微生物である、請求項13又は14に記載の宿主細胞。
- 酵母である、請求項20に記載の宿主細胞。
- 各々が植物シトクロムP450レダクターゼ(CPR)であるポリペプチドをコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む異種核酸をさらに含有するか、又は前記異種核酸で形質転換されている、請求項21に記載の宿主細胞。
- 前記CPRが、配列番号35に示されるか、又は前記ポリペプチドの実質的に相同なバリアント若しくは断片である、請求項22に記載の宿主細胞。
- 細胞懸濁培養物に存在する、請求項13、14又は20から23のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 異種宿主においてQA又はその誘導体である産生物を産生する方法であって、請求項13、14又は20から24のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養し、それから産生物を精製することを含む、方法。
- 異種宿主においてQA又はその誘導体である産生物を産生する方法であって、請求項18又は19に記載の植物を成長させ、次いで前記植物を採取し、それから産生物を精製することを含む、方法。
- アジュバントとしての、又はアジュバントの調製における、請求項25又は26に記載の方法によって得られるQA又はその誘導体の使用。
- Q.サポナリア由来のQAヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、前記QAヌクレオチド配列が、
(i)配列番号2、4、6又は8の全て又は一部をコードするか、
(ii)配列番号2、4、6又は8と少なくとも約60%の同一性を共有するそれらの配列番号のいずれかの相同性バリアントであるバリアント配列をコードするか、及び/又は
(iii)配列番号1、3、5若しくは7又はそれらのゲノム等価物から選択される、核酸分子。 - 前記QAヌクレオチド配列が、1つ又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換によって、配列番号2、4、6又は8に示されるアミノ酸配列の誘導体をコードする、請求項28に記載の核酸。
- 請求項28又は29に記載の核酸によってコードされる単離されたポリペプチド。
- 請求項28に記載の核酸を修飾する工程を含む、請求項30に記載の核酸を産生するプロセス。
- 請求項28又は29に記載の核酸を含む組換えベクター。
- 前記核酸が、宿主細胞における転写のためのプロモーターと作動可能に連結され、前記プロモーターが任意選択により誘導性プロモーターである、請求項32に記載のベクター。
- 植物ベクター又は微生物ベクターである、請求項32又は33に記載のベクター。
- (i)プロモーターであって、以下と作動可能に連結されている、プロモーター、
(ii)RNA−2ゲノムセグメントにおける標的開始部位が突然変異されている、二分RNAウイルスのRNA−2ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列、
(iii)QAヌクレオチド配列、
(iv)転写終結配列、及び任意選択により
(v)前記転写終結配列の上流に位置する3’UTR
を含む発現カセットを含む、請求項34に記載のベクター。 - 請求項32から35のいずれか1項に記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含む、方法。
- 請求項32から35のいずれか1項に記載のベクターを含有するか、又は前記ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 微生物であり、任意選択により酵母細胞である、請求項37に記載の宿主細胞。
- その染色体内に請求項28又は29に記載の異種核酸を有する、植物細胞である宿主細胞。
- 請求項32から34のいずれか1項に記載のベクターを宿主細胞に導入する工程、及び前記宿主細胞を形質転換するように前記ベクターと前記宿主細胞ゲノムとの間で組換えを引き起こすか、又は可能にする工程を含む、方法。
- トランスジェニック植物を産生する方法であって、
(a)請求項40に記載の方法を実施する工程であって、前記宿主細胞が植物細胞である、工程、
(b)形質転換された植物細胞から植物を再生する工程
を含む、方法。 - 請求項41に記載の方法によって得ることができるトランスジェニック植物、又は前記トランスジェニック植物のクローン、又は自家若しくは雑種後代、又は他の子孫であるトランスジェニック植物であって、各々の場合、請求項32から34のいずれか1項に記載の異種核酸を含む、トランスジェニック植物。
- 請求項84に記載の植物又は請求項80から82のいずれか1項に記載の宿主細胞であって、
(i)配列番号2に示されるβ−アミリンシンターゼ(bAS)、
(ii)配列番号4に示されるC−28オキシダーゼ、
(iii)配列番号6に示されるC−16αオキシダーゼ、
(iv)配列番号8に示されるC−23オキシダーゼ
又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片
の全てを含む異種核酸を含む。 - 細胞においてQA生合成に影響又は作用を与える方法であって、前記細胞内で請求項32から34のいずれか1項に記載の異種核酸の発現を引き起こすか、又は可能にする工程を含む、方法。
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