CN102146377B - 一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法。所述方法是通过将含有需要制备的蛋白质基因转化到植物胚性细胞中进行培养来制备蛋白质的，具体包括1)制备植物胚性细胞组织；2)将需要制备的蛋白质基因转入步骤1)所制备的胚性细胞组织中；3)培养步骤2)得到的胚性细胞组织，使其发育成熟为体细胞胚；4)从步骤3)得到的体细胞胚中提取蛋白质。用于制备蛋白质的胚性细胞组织为针叶类植物的胚性细胞组织。本发明所提供的方法是制备转基因药用蛋白的一个重大改革，能显著提高转基因药用蛋白产率，适合于放大生产。

Description

一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及一种制备蛋白质的方法，具体地，本发明涉及一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法。

背景技术

已证明转基因植物种子合子胚是药用活性蛋白的极佳来源(Hood etal。2003，Horn et al。2004)，其原因包括胚胎中高蛋白含量，天然拥有蛋白酶抑制剂，且在成熟的种子中能降低总体代谢活动，并能导致外源蛋白保持长期稳定性的低水份含量。大规模生产药用蛋白要求转基因作物种植在开放的田间，因为大棚种植昂贵因而受到局限。在开放的田间种植此类作物要求政府统一集中监测和批准，而且对于转基因产品的可能逃脱监管区域而进入到食物链还存在极大的争议.

对此的解决办法是在大型生物发酵罐中通过细胞悬浮培养液形式生长转基因植物细胞或组织。这种解决办法有许多优点(Hellwig et al。2004)。这些优点是：(1)从接种，收成到过程处理完全在密封的容器中进行；(2)气候和季节不构成影响产量的因素，这意味着药用蛋白质的生产可周年进行；(3)处理废弃生物质简单且便宜；(4)发酵罐生物反应器系统对制药企业来讲比田间生产系统更容易被接受；(5)商用转基因生产系可以采用细胞库，采用低温贮藏办法。

但是，生物反应器系统生长转基因植物细胞用于生产异性蛋白，特别是药用蛋白的可见的弱点在于：(1)从历史角度看，产率低(Hellwig etal.2004)，(2)使用较小规模生物反应器所带来的较高的成本(Hood et al，2003)；(3)必须马上处理，因为不可以放置较长时间。

因此，本发明寻求对这些问题的解决并改进制备蛋白质的方法。

发明内容

除非特别说明，在本文中，所使用的术语“胚性细胞组织”或“胚性体细胞组织”，是指还没有形成胚胎器官如双极胚胎结构(可分化幼苗和根部)以及子叶(子叶可能是或不是某个特定植物种类胚胎器官组成部分)的细胞组织。

除非特别说明，在本文中，所使用的术语“体细胞胚”，简称“体胚”，是指胚性体细胞在培养液中生长发育一段时间后形成的物质，其可能形成不了成熟的具有器官或类似器官结构的胚胎，如子叶或胚根，但却仍然具有成熟器官的特性，即蛋白含量高，具有蛋白酶抑制剂，干物质含量高和水份含量低，并能使外源蛋白保持长期稳定。

本发明的目的在于，提供一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法。

本发明的另一个目的在于，提供用于制备蛋白质的胚性细胞组织。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种制备蛋白质的方法，所述方法是通过将含有需要制备的蛋白质基因转化到植物胚性细胞组织中进行培养来制备蛋白质的。

优选地，所述方法包括以下步骤：1)制备植物胚性细胞组织；2)将需要制备的蛋白质基因转入步骤1)所制备的胚性细胞组织中；3)培养步骤2)得到的胚性细胞组织，使其发育成熟为体细胞胚；4)从步骤3)得到的体细胞胚中提取蛋白质。

优选地，所述步骤1)中制备植物胚性细胞组织的方法包括采用半固体培养基诱导和液体培养基增殖的步骤；优选地，所述培养基为添加了1-20μmol/L生长素和/或1-20μmol/L细胞分裂素的1/2 Litvay(LV)培养基；更优选地，所述的培养条件为：20-30℃，黑暗，90-120转/分钟摇床培养。

优选地，所述步骤2)中将需要制备的蛋白质基因转入胚性细胞组织的方法选自：微粒-介导传递技术(基因枪转化)、原生质电穿孔方法、聚乙二醇析出技术、直接基因转移技术、生物体外原生质转化技术、植物细胞原生质或胚性愈伤组织显微注射技术和土壤农杆菌转化方法；更优选地，所述步骤2)中是通过微粒-介导传递技术和土壤农杆菌转化方法将需要制备的蛋白质基因转入胚性细胞组织。

优选地，所述步骤2)中获得的转基因胚性细胞组织是通过超低温液氮冷冻技术并以细胞库的方式保存，转基因胚性细胞组织的细胞先被制作成种源细胞库(master cell bank，MCB)，然后用种源细胞库的细胞制作工作细胞库(working cell bank，WCB)。

优选地，所述方法还包括在超低温下冷冻保藏所述步骤1)中制备的胚性细胞组织或步骤2)中制备的转入蛋白质基因的胚性细胞组织的步骤；更优选地，所述冷冻保藏温度为-196℃。

优选地，所述步骤3)中培养胚性细胞的方法包括采用液体培养基悬浮培养的步骤；优选地，所述培养基为添加了生长抑制剂如5-120μmol/L脱落酸和/或渗压剂如蔗糖的1/2 Litvay培养基；更优选地，所述的培养条件为：20-30℃，黑暗，60-120转/分钟摇床培养。

优选地，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理；更优选地，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，优选地，所述船式RAFT培养的培养基为添加了生长抑制剂如5-120um/L脱落酸和/或渗压剂如蔗糖的Litvay培养基；更优选地，所述的培养条件为：20-30℃，黑暗静培养。

优选地，由于裸子植物或被子植物的种子或幼苗均能诱导出胚性细胞组织，故所述制备植物胚性细胞组织的外植体选自裸子植物或被子植物种子或幼苗；更优选地，所述裸子植物包括松科、柏科和杉科，如冷杉属、松属、云杉属、铁杉属、假铁杉属、金钟柏属、桧属、落叶松属、紫杉属和红杉属；所述被子植物包括油棕、刺葵属桉树、栎属、葡萄属、苹果属、小麦属、稻属、大豆属、燕麦属、芸薹属、甘蔗属、大麦属、荞麦属、棉属、甜菜属、落花生属、蛇麻籽属、番薯属、蕉麻芭蕉属、木薯、咖啡属、山茶属、蔷薇属、古柯属、大麻属、罂粟属、番木瓜属、椰子属、胡萝卜属、苜蓿属、玉米属、可可属、槭属、桤木属、杨梅属、泡泡树属、桦木属、鹅耳枥属、山核桃属、栗属、朴属、紫荆属、扁柏属、山茱萸属、柳杉属、桉树属、水青冈属、白蜡树属、皂荚属、肥皂荚属、金缕梅属、胡桃属、鹅掌楸属、木莲属、苹果属、桑属、紫树属、铁木属、悬铃木属、杨属、李属、栎属、鼠李属、漆树属、柳属、接骨木属、檫木属、花楸属、椴树属、榆属以及荚蒾属；进一步优选地，所述制备植物胚性细胞组织的外植体为云杉属植物种子的合子胚。

另一方面，本发明提供了上述方法在制备蛋白质中的用途；优选地，所述蛋白质包括任何一种具有研究，工业或药用价值的蛋白质或多肽，例如疫苗或单克隆抗体等，具体包括重组人类生长素、人类生长素受体拮抗剂(HGRA)、胰岛素、干扰素、细胞因子等。

又一方面，本发明还提供了一种用于制备蛋白质的胚性细胞组织，所述胚性细胞组织为针叶类植物的胚性细胞组织。

优选地，所述其胚性细胞组织是通过诱导白云杉种子的合子胚而形成。

本发明所采用的针叶类植物体细胞胚的生产是利用该过程所获得的体细胞胚制备异类蛋白质，即用针叶植物胚性细胞和在液体培养液中进行体胚生成以获得高浓度蛋白质的制备。

本发明所展示的发明独立地或以联合的方式解决了所报道的使用生物反应器悬浮培养液中制备重组蛋白的三种弱点，具体详述如下：

首先胚性细胞组织本身具备比其它非胚性细胞更强的蛋白质合成机制，转化胚性细胞并经过对转基因的胚性细胞的挑选，获得高产率的细胞组织，可以克服现有蛋白产率低的缺点。

其次，本发明所提供的白云杉胚性细胞悬浮液发酵培养可被操作放大到1500-7500升，有效解决了现有技术中使用较小规模生物反应器所带来的较高超薄的缺陷。然后更换介质进一步骤诱导转基因的胚性细胞经历体胚的发育和形成，在这一过程完成目标蛋白的积增。转基因体胚可被进一步诱导在生物反应器中成熟(即RAFT反应器)，与此同时体胚积增更多目标蛋白，进一步提高了蛋白产率。

再次，体胚达到收成阶段时，可以在低温下储存直到处理工艺过程开始而不必马上进行处理，克服了现有技术不能放置较长时间的缺陷。此时体胚被打碎，目标蛋白被提取并被纯化.

体细胞胚(简称体胚)形成是分化的体细胞被诱导发展成胚胎的过程。体细胞胚发育和合子胚一样是营养物质积累的过程，包括高蛋白含量的积累。体胚与合子胚的区别在于，体胚的形成来源于体细胞通过有丝分裂的再分化，而合子胚则是出自于生殖细胞的受精。下面提到包含用于转化目标异性蛋白核苷酸序列的植物组织是“早期阶段体胚细胞组织”。在一些文献当中可能会将此参照为”前”或”先”胚胎发生物质(proembryogenicMass，PEMs)。当我们谈到“早期阶段体胚细胞组织”是指胚胎器官还没有形成的细胞组织，这些器官如双极胚胎结构(可分化幼苗和根部)以及子叶(子叶可能是或不是某个特定植物细胞族胚胎器官组成部分)。当在培养液中生长一段时间后，胚性细胞组织将开始有能力形成体胚。在培养液中发育的体胚可能形成不了成熟的具有器官或类似器官结构的胚胎例如子叶和胚根，但它们却仍然具有成熟体胚的特性，即于上面提到的高蛋白含量，拥有蛋白酶抑制剂，高干物质和低水份含量，并能导致外源蛋白保持长期稳定等。

当针叶树类植物用于异性蛋白制备系统时，本发明具有特别的实用价值。针叶树是指木本裸子植物松柏类系属、包括的植物科系是松科(Pinacae)、柏科(Cupressacae)和杉科(Taxodiaceae)，裸子植物为异花授粉繁殖种子，具有丰富的遗传多样性，这一特性适合优良胚性体细胞系的多次重复筛选。其他植物种类还包括冷杉属(Abies)、松属(Pinus)、云杉属(Picea)、铁杉属(Tsuga)、假铁杉属(Pseudotsuga)、金钟柏属(Thuja)、桧属(Juniperus)、落叶松属(Larix)、紫杉属(Taxus)和红杉属(Sequoia)。其他被子植物包括但不限于的类属包括油棕(Elaeis)、刺葵属(Phoenix)、桉树属(Eucalyptus)、栎属(Quercus)、葡萄属(Vitis)、苹果属(Malus)、小麦属(Triticum)、稻属(Oryza)、大豆属(Glycine)、燕麦属(Avena)、芸薹属(Brassica)、甘蔗属(Saccharum)、大麦属(Hordeum)、荞麦属(Fagopyrum)、棉属(Gossypium)、甜菜属(Beta)、落花生属(Arachis)、蛇麻籽属(Humulus)、番薯属(Iopomea)、蕉麻芭蕉属(musa)、木薯(Manihot)、咖啡属(Coffea)、山茶属(Camellia)、蔷薇属(Rosa)、古柯属(Coca)、大麻属(Cannabis)、罂粟属(Papaver)、番木瓜属(Carica)、椰子属(Cocos)、胡萝卜属(Daucus)、苜蓿属(Medicago)、玉米属(Zea)、可可属(Theobroma)、槭属(Acer)、桤木属(Alnus)、杨梅属(Arbutus)、泡泡树属(Asimina)、桦木属(Betula)、鹅耳枥属(Carpinus)、山核桃属(Carya)、栗属(Castanea)、朴属(Celtis)、紫荆属(Cercis)、扁柏属(Chamaecyparis)、山茱萸属(Cornus)、柳杉属(Cryptomeria)、桉树属(Eucalyptus)、水青冈属(Fagus)、白蜡树属(Fraxinus)、皂荚属(Gleditsis)、肥皂荚属(Gymnocladus)、金缕梅属(Hamamelis)、胡桃属(Juglans)、鹅掌楸属(liriodendron)、木莲属(Magnolia)、苹果属(Malus)、桑属(morus)、紫树属(Nyssa)、铁木属(Ostrya)、悬铃木属(Platanus)、杨属(Populus)、李属(Prunus)、栎属(Quercus)、鼠李属(Rhmnus)、漆树属(Rhus)、柳属(Salix)、接骨木属(Sambucus)、檫木属(Sassafras)、花楸属(Sorbus)、椴树属(Tilia)、榆属(Ulmus)以及荚蒾属(Viburnum)。

在本发明的一项具体实例中，使用的植物是白云杉(White Spruce)作为细胞组织来源。首先是早期胚性体细胞组织的诱导。生殖细胞或受精的合子具有内在成胚的能力，而体细胞则需要该细胞有能够诱导胚胎形成的能力。为了能够引起体细胞胚的生成，体细胞的基因表达必须转换到使胚胎能够形成的状态。在这一转换过程中，细胞发生脱分化并改变基因表达程序(Dudits et al.，1995)。结果是，细胞质和生理的状态从体细胞转变成胚性细胞状态。而被诱导或在体细胞胚胎形成中分化表达了的基因组列则被通过采用各种分子生物学技术而得以分离出来，例如荷尔蒙敏感反应基因(如可诱导-植物生长激素和可诱导-脱落酸)，胚形成受体激酶基因，含有homeobox基因，(LEA)基因，细胞外蛋白调控基因，种子储藏蛋白基因及管家(house keeping)基因，这些基因在胚胎形成过程中被诱发或调控(见Chugh and Khurana，2002)。

具体实例之一是，针叶树种早期胚性体细胞组织可以通过诱导合子胚胎组织的细胞而获得。通常情况下，针叶类体细胞胚的形成包括以下三个步骤：

(1)通过在有植物生长调节剂，主要是植物生长激素和/或细胞分裂素的介质中的人工培养，以达到诱导启动从体细胞到胚性细胞的转化；

(2)与在启动步骤中所使用的相类似的介质中，胚性体细胞得以增殖和维护；

(3)胚胎的发育和成熟是在通过有脱落酸(ABA)和渗透压不断增加的介质培养体系中进行，这一阶段标志着体细胞胚发育的终结。

在各种实例当中，被用于作基因转化的组织是早期体胚细胞组织或胚性(体)细胞(组织)。任何含有异性重组核苷酸的序列可被转化到这类细胞的染色体上。本发明的一个重要方面是：被转入的目标蛋白可能是任何蛋白质或单克隆抗体或多肽类物质，期望在体胚细胞组织中被生产出来。而且，在特别选定的实例中，目标蛋白是药用的或工业上有价值的蛋白质或肽类物质。外源的异性蛋白的信号编码序列，如那些后面将讨论到的，也可以引进到细胞组织中去。如果适如所愿，被引进的核苷酸编码序列能够被优化以更适应植物细胞体系的信息转译。通过优化用于植物的密码系统和植物转录起始部位的密码，可以去除可能引起信使RNA不稳定性的因素。

“异性”是指某核苷酸编码或蛋白，起源于外部来源或族类，或起源于同一族类但被修改了而与起源编码不同。核苷酸编码序列隐含所期许的多肽或蛋白的转录信息，但是也可能是并不构成完整基因的核苷酸序列，甚至并不隐含任何多肽或蛋白的转录信息。例如，如果是同源的重组过程，重组基因序列可能选中染色体的某个区域插入，但是这个区域序列信息并没有转录蛋白的信息，而是目标核苷酸序列会生成信息RNA，这种信息RNA会被用于使一个系统沉默，正象抗转录系统的启动，就不会再有蛋白质生成。增加或抑制一个蛋白的途径可以有很多，可以包括转基因表达，抗转录抑制，共抑制表达方法包括但并不仅局限于：RNA干扰，使用转录因子和/或抑制剂启动或抑制基因表达。基因变异包括转位子标记技术，定向或定位基因突变技术，染色体工程，和同源基因重组技术。

在当今技术已经非常发达，有很多不同的方法和技术可以用于将某一目标蛋白的核苷酸编码序列信息引进到植物细胞。

在一个具体实例中，表达载体被用于引进核苷酸编码序列。这种载体包括一个可以促进目标核苷酸编码序列得以表达的启动子。用于控制产品蛋白表达和基因选择的启动子有很多种。只要是与植物组织相匹配的任何启动子都可以。这些启动子可能是植物基因启动子，例如，泛素(ubiquitinpromoter)蛋白质启动子(欧洲专利申请号：0342926)；核酮糖-1，5-二度-磷酸盐羧基酶的小亚子启动子(ssRUBISCO)(Coruzzi et al.，1984；Broglieet al.，1984)；或者来源于根癌土壤农杆菌质粒的肿瘤诱发启动子。象胭脂碱合成酶，章鱼碱合成酶(见US专利5,034,322)及有植物活性的甘露碱合成酶启动子(Velten and Schell，1985)或病毒启动子诸如花叶病毒CAMV19S和35S启动子(Guilley et al.，1982；Odell et al.，1985)，玄参嵌入病毒FLt启动子(Maiti et al.，1997)或TMV外被蛋白启动子(Grdzelishvili etal.，2000)。

可与植物相容和的启动子的范围包括专用的组织和可诱导的启动子。可诱导调节是指在诱导作用下能够直接或者间接启动转录一个或者更多的DNA序列或基因。没有诱导因素存在，DNA序列或基因就不会被转录。这些诱导因素可以是化学试剂，诸如某种蛋白，代谢物，生长因子，灭草剂或酚类化合物或由于直接施以冷、热、盐或毒性物，或间接通过病原体或病毒及其他致病因素。含有可诱导调控机制的植物细胞可以被暴露给外部的诱导条件。这些诱导因素可以在细胞生长的某个阶段加入到培养液或介质中，或通过喷洒，浇水，加热或类似方法。典型的可诱导启动子包括蜕皮激素受体启动子(ecdysone receptor promoters)，美国专利号6,504,082；由于铜的作用而激活的启动子ACE1系统。玉米In2-1和In2-2基因的启动子受控于苯磺酰胺灭草剂(美国专利5,364,789)；而烟叶PR-1启动子，则是由水杨酸活化。其他化学调节目标启动子包括类固醇-敏感型启动子，糖(肾上腺)皮质激素启动子(Schena et al.(1991)及McNellis et al.(1998)。四环素-可诱导及四环素-可抑制启动子(例，Gats et al.，1991，和美国专利号5,814,618和5,789,156)。热休克启动子如黄豆hsp 17.5-E(Gurley et al.，1986)或乙醇-可诱导启动子(Caddick et al.，1998)都可以作为更进一步的例证。

有组织倾向性的启动子可以用于瞄向某种特定植物组织内已提高了转录和/或表达的部位。启动子可以在目标组织内以较高于其他组织的水平表达。这些启动子包括这些能提供对种子有倾向性表达的例子，诸如菜豆蛋白启动子(Bustos et al.，1989)；玉米27 kD r-zein启动子(Russell andFromm，1997)；及玉米globulin-1启动子(Belanger and Kriz，1991；Genbankaccession L22344)。还有其他的许多组织倾向性启动子的描述见Yamanotoet al.(1997)；Kamamata et al.(1996)；Hansen et al.(1997)；Russell et al.(1997)；Rinehart et al.(1996)；Van Camp et al.(1996)；Canevascini et al.(1996)；Yamamoto et al.(1994)；Orozco et al.(1993)和Matsuoka et al.(1993)。

表达载体可能还包含一个终止子区。方便的终止子区域可以在根癌土壤杆菌Ti-质粒中得到，如章鱼碱合成酶终止子。其他各种终止子的例子包括来自于马铃薯的pin II终止子(An et al.，1989)和nos终止子。同时请见Guerineau et al.(1991)；Proudfoot(1991)；Sanfacon et al.(1991)；Mogenet al.(1990)；Munroe et al.(1990)；Ballas et al.(1989)及Joshi et al.(1987)。

在一个实例当中，表达载体中还包含一段基因，这段基因所隐含的是某一可以选择或可报告的标记，这种标记具有可操作性或功能性，且可以与控制转录启动的启动子相连接。有关植物表达载体和报告(reporter)基因的综述，请见Gruber et al.(1993)。此类标志基因的例子包括草丁膦抵抗编码DNA，此类DNA编码序列可以是草胺膦乙酰转移酶(pat)或由玉米优化的pat基因。这类基因能够产生对于除草剂双丙氨酰膦的抵抗(Gordon-Kamm et al.，1990；Wohllenben et al.1988)。其他例子，如新霉素磷酸转移酶，潮霉素磷酸转移酶，EPSP合成酶和二氢叶酸编码基因。见Miki et al.(1993)，美国专利6,174,724)，Santerre et al.(1984)。还可以选用可用于定量的标记基因。这些例证包括b葡萄糖醛酸酶或uidA(GUS)基因(美国专利5,268,463和5,599,670)。

表达载体可以选择性的在启动子和目标基因之间或目标基因之后放置一个信号编码序列。一个信号编码序列是一组序列核苷酸，转译后给出的是一组有特定序列的氨基酸，这组有特定序列的氨基酸被细胞用于指导目标蛋白或多肽被置放于该真核细胞内部或外部某一特定位置。一个植物信号编码序列的例子是大麦a淀粉酶分泌信号(barley-amylase secretionsignal，Rogers，1985)。许多信号编码序列已经为人们所知，请见例如Beckeret al.(1992)，Fonte et al.(1991)，Matsuoka and Nakamura(1991)，Gould etal.(1989)，Creissen et al.(1992)，Kalderon et al.(1984)and Stiefel et al.(1990)。

先导编码序列可以被包括在内以提高转录水平。各种可以使用的先导编码序列可以被置换使用或加起来使用。转译先导序列编码已经为人们所知，如下例所示：picomavirus先导序列，EMCV先导序列，脑心肌炎5’非编码区域(Elroy-Stein et al.1989)；马铃薯Y病毒组先导序列，如TEV先导序列(烟草蚀刻病毒)(Gallie et al.，1995)；人类免疫球蛋白重链结合蛋白质(Bip)先导序列(Macejak et al.，1991)；从苜蓿花叶病毒的外被蛋白信使RNA的未转译先导序列(AMV RNA 4)(Jobling et al.，1987)；烟草花叶病毒先导序列(TMV)(Gallie，1987)和玉米枯黄斑点病毒先导序列(MCMV)(Lommel et al.，1991)。其他已知的能够提升转译水平的方法也得到应用，例如，内含子及其同类。很显然，有关启动子，可选择性标记，信号编码序列，先导编码序列，终止编码序列，内含子，增强子和其他表达载体的构成组份都有很多种类可供选择。

由于本学科领域知识和技术的发展，已有多种转化表达载体进入到植物细胞的方法可供选用，但具体选用何种方法则要根据所选取的植物种类来决定。多种植物转化的操作方法可以在公开发表的文献报道中找到，如Miki and McHugh(2004)；Klein et al.(1992)；and Weising et al.(1998)。例如DNA载体可以通过新的技术方法被引进入到植物细胞的基因组DNA，这些技术方法诸如微粒-介导(轰击)传递技术(MicroprojectileBombardment System(Klein et al.1992)，原生质电穿孔方法(Fromm et al.，1985)，聚乙二醇(PEG)析出技术(Mathur and Koncz，1998)，直接基因转移技术(WO 85/01856 and EP-A-275 069)，生物体外原生质转化技术(美国专利号4,684,611)，植物细胞原生质或胚性愈伤组织显微注射技术(Crossway，1985)，及土壤农杆菌转化方法(Ishida et al，1996；美国专利5,591,616)。

一旦植物细胞组织被转化后，如果采用可选择标志基因，则细胞被置于的是选择介质。存留下来的细胞组织然后会以胚愈伤组织的形式增加，且会在液态介质中悬浮。在起始期内，细胞生长在植物生长激素和/或细胞分裂素繁殖介质中以促进细胞分裂。在本发明的实例当中在介质发生变化前，细胞生物量的数量得到增加。在本发明的一个重要的一个实例中，细胞生物量数目在换到新介质的一到两周时间内得到迅速增加。

在胚性细胞得到增殖之后，为促进体细胞胚发育达到成熟阶段，对细胞进行促进成熟处理，如在胚形成后期的处理。这将导致体胚体积增大，总蛋白和目标蛋白量的增加。一般而言，植物生长激素和细胞分裂素将由脱落酸所取代，同时加入渗压剂，如蔗糖(Lu and Thorpe，1987；Hakman andVon Arnold，1985；Beardmore and Charest 1995)及/或聚乙二醇(PEG)(Attreeand Fowke，1993)。移走植物生长激素和细胞分裂素会中止胚性细胞组织的繁殖。体细胞胚的进一步发育可以由加入脱落酸和渗压剂而得到促进。植物生长调节剂的变化可以作为体细胞胚发育进入成熟阶段的诱导信号(Bozhkov et al.，2002)。

脱落酸曾被报导在体细胞胚发生过程中起到非常重要的作用(Dunstanet al.，1988；Attree et al.，1990)。对针叶类，体胚发生需要外部的脱落酸加入以诱导体细胞胚的成熟。脱落酸还被证明能够增加储存蛋白和LEA蛋白的积累(Flinn et al.，1991)。黑云杉(picea mariana)储藏蛋白和LEA蛋白的积累被看作是植物(见Chugh and Khurana 2002综述)体细胞胚成熟完成的标志。

体细胞胚的发育，原则上基本类同于合子胚形成发育的过程(Steward，1958)。这里，当合子胚外植体暴露于植物生长素和/或细胞分裂素时可以引发胚胎形成物质的生成，或胚性体细胞组织的生成。直到发育到第一期的非成熟胚胎，胚性细胞组织有一个高密度的略微有些不规则形状的胚尖和胚柄。此时介质发生改变引发体细胞胚的成熟和第二期的组织发育，更接近球状发育，如球状体细胞胚(GSEs)。在第三期，体细胞呈拉长形状，这一形状在第四期变成早期的顶端分生组织，胚轴，胚根，及子叶。在第五期，胚胎器官显现出来。图1所示的是云杉体细胞胚在固体培养基上的发育过程，随着每一期的向前发展，蛋白质的含量在增加。

液体介质体细胞胚形成过程一般也经历三个阶段：诱导，繁殖和成熟。外部环境，如培养环境的化学和物理性质的变化控制每一步骤的进行。在体细胞被诱导成胚性体细胞的过程中，细胞获得胚形成能力，直接相比较，合子胚形成却没有相应部分。繁殖阶段，起始时是在半固体介质然后是液体介质，这里早期体细胞胚形成事件的发生类同于早期针叶合子胚的形成过程。在晚期体细胞胚成熟的阶段与针叶类晚期合子胚形成阶段相以。

用内生的储藏蛋白基因作为标志来寻踪体细胞胚或合子细胞胚的成熟程度应该更合适。例如，Chatthai et al 1988年所报道过几个针叶储存蛋白包括四个隐含2S种子储存蛋白同源型cDNA克隆(PM2S1，PM2S2，PM2S3和PM2S4)。可以追踪这些蛋白的表达增加(如用北方墨点分析)，而且当胚胎成熟时这些蛋白还会增加。

在一个重要的实例中，高收率的转基因细胞被确实，这些细胞被繁殖并被制作成种源细胞库(Masrer Cell Bank)，且通过使用超低温冷冻保存技术而得到长期的冷冻保存。超低温冷冻保存是基于减少直至最后中止储存的超低温生物体的代谢活动。低温长时间储存植物或植物细胞不会改变原本的基因，解冻后的细胞会很快恢复原有性质和生物合成能力，这在植物生殖，生物医学研究和基因工程诸方面有重要意义。在液氮温度零下196 C，几乎所有细胞的代谢活动都停止了。细胞能保持基因稳定，直到相当长时间后需要时，不发生体细胞克隆变异。对制药工业的蛋白质生产，拥有一个细胞库对植物悬浮培养蛋白制造系统是一个巨大优势。一旦冷冻的细胞解冻，该种源细胞就可以被放大到预想的数量，这些细胞经诱发可以形成体细胞胚，然后这些体细胞胚以批量生产方式收成。体细胞胚可以被储存，打碎然后提取蛋白。有关蛋白质的提取会有很多不同方式，这在我们目前的发明当中并不是关键，见例Heney and Orr(1981)。

在本发明的一个实例中，通过使用针叶类植物作为蛋白质生产的来源，工艺过程被优化以提高体细胞胚发生和蛋白的产率。针叶类植物在液体培养液中通过体细胞胚形成产生胚胎的能力不一。主要问题是成熟体细胞胚生成的数量很低，或者是某些胚性细胞组织在用促成熟条件培养后仍无体细胞胚生成。为了建立起一个在液体培养条件下有较高胚性细胞转化为体细胞胚发生率的生产平台，在本发明的一个实例当中，对100个胚性细胞组织进行胚胎产生能力的筛选。这一过程极大地增加体细胞胚形成能力的工艺途径。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为离体条件下针叶树种体细胞胚的发育过程；

其中a和b箭头指向的是在成熟介质之后的三到七天球型体细胞胚(第二期)，c箭头指向的是14天后(第三期)拉长了的球型胚胎；d箭头指向的是21天后(第四期)早期子叶体细胞胚；e和f箭头指向的是28天和40天时，发育成熟的体细胞胚(第五期)。

图2为白云杉细胞系WS30(A)和WS11(B)在悬浮培养中发育形成球型和心型体胚照片。

图3为在半干半湿的RAFT上，球形体胚继续发育形成有子叶结构的成熟体胚照片。

图4为农杆菌转化3天GUS基因的临时表达(X-GluC染色，蓝斑证实GUS表达)。

图5为稳定的转基因细胞组织，蓝色证实GUS基因的表达。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1  培养基的筛选

制备胚性细胞组织，需要采用胚性细胞组织诱导培养基诱导出胚性细胞组织，再采用体胚成熟培养基诱导胚性细胞发育成成熟体胚。本实施例以白云杉种子作为外植体，对上述两种培养基进行了筛选，具体详述如下。

1、外植体来源

白云杉种子通过加拿大新布郎施威克大西洋地区森林服务，国家树木种子中心获得，储藏温度保存在4℃。

2、外植体的消毒及处理

按以下顺序进行：

(1)75％的乙醇2分钟；

(2)6％的次氯酸钠(Chlorox)加数滴吐温20((Sigma)10分钟；

(3)用无菌的去离子水冲洗十分钟，一次；

(4)用无菌的去离子水冲洗三次；

(5)用无菌去离子水在培养皿中室温下浸泡4个小时以软化种子外壳；

(6)浸泡之后，合子胚在无菌条件下被分离出来。

3、胚性细胞组织诱导培养基的筛选

白云杉胚性细胞愈伤组织的诱导过程具体描述如下：

将消毒后的合子胚水平放在有半固体诱导培养基的培养皿中，然后置于25℃无光的条件下保存。三四周之后，在主外植体的表面出现明显的白色透明或浅棕色的组织——胚性(体)细胞组织(PEMs)。这些胚性细胞组织(PEMs)一旦长成直径大约5-10毫米时，就被转移到新鲜液体诱导培养基介质中增殖。每一合子胚形成的胚性细胞组织被指定为一个单独的胚性细胞系。

胚性细胞组织诱导培养基为半固体诱导培养基，其基本培养基采用1/2 Litvay(1/2 LV)培养基，具体配方如表1所示。

表11/2 Litvay培养基配方

在1/2 Litvay培养基中添加表2所示的不同浓度的生长激素2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和细胞激动素6-苄基腺嘌呤(BA)进行比较，结果如表2所示。

表2  不同浓度激素的诱导培养基产生胚性细胞组织的结果

由表2可知，在1/2 Litvay培养基中添加2，4-D浓度为1～20μmol，BA浓度为1～20μmol时，均可以诱导产生胚性细胞组织。当2，4-D浓度为10μmol，BA浓度为5μmol时，外植体被诱导形成胚性体细胞组织的成功率最高(30％)。因此，以下实验中使用的诱导培养基(IND)具体配方如下：

诱导成功的胚性细胞组织可以冷冻保存在液氮细胞库中(-196℃)。

4、体胚成熟培养基的筛选

将上述冷冻保存的胚性细胞组织解冻后，进行继代培养，具体操作如下：

将1克(鲜重)细胞接种至50毫升液体诱导培养基的三角瓶中，在黑暗条件下，25℃，以每分钟120转摇动进行悬浮培养。悬浮培养液中，大多数由胚性细胞团组成，生长周期为七天。

继代培养七日生长指数(GI)是7-10，即按起始和终止培养时重量计算：生长指数＝终止培养时的细胞鲜重/起始培养时的细胞鲜重。细胞的鲜重以每一生长周期增长七倍的速度递增，即1，7，49，329，2303，16121.....克。

培养14天后，经过真空过滤以完全去除残留的液体培养基，以2克细胞接种至50毫升液体培养基的比例接种至成熟培养基中，进行体胚成熟培养基的筛选，体胚发育悬浮培养的条件如下：黑暗，25℃，每分钟90转摇动。

体胚成熟培养基的基本培养基采用1/2 Litvay(1/2 LV)培养基，具体配方如表1所示。在1/2 Litvay培养基中添加表3所示的不同浓度的脱落酸(ABA)进行比较，结果如表3所示。成胚率的计算是根据在显微镜下观测的球形和心形结构的成熟胚的数量与没有形状的细胞组织的数量比，具体方法如下：1)将培养了14天的细胞悬浮液真空过滤，除去液体；2)称3x100mg的胚性细胞组织，放入3个小培养皿；3)加1mL的蒸馏水使体胚分散在水中；4)在显微镜下数成熟胚和非成熟胚；5)计算成胚率，为3个重复的平均值。

表3  不同浓度激素的成熟培养基产生胚性细胞组织的结果

由表3对脱落酸(ABA)的浓度与成熟体胚形成的影响测试结果可知，当ABA浓度为5～120μmol时，均可以诱导胚性细胞组织发育转换成成熟体胚细胞。当ABA浓度为60μmol时，胚性体细胞组织发育转换成成熟体胚的成功率最高，在10个被诱导的细胞系中，有7个细胞系的成胚率达到25％以上。因此，以下实验中使用的成熟培养基(MAT)具体配方如下：

5、体细胞胚成熟催化处理

为进一步增加体胚的蛋白含量，本发明采用RAFT(船式)培养方法(Attree et al 1990)来催化球形期体胚进入到伸长期体胚。

在实验当中，正在发育的球型期体胚(GSEs)被置放在RAFT上。RAFT是一种硬海绵制作的平笩，能吸附供体胚发育和成熟的营养液(MAT培养基)。这样，球形期体胚不再是悬浮在液体中，而是在半干半湿的静止状态进一步发育成成熟胚。

约14-21天，体胚趋向成熟，如图3所示。总蛋白含量可达到鲜重的6-9％。体胚细胞的蛋白质合成机制是胚性细胞固有的，这样每一个胚都可以被视作一个蛋白合成车间，同样外源的蛋白质产率将随着总蛋白含量的增加而递增。

实施例2  制备胚性细胞组织

本实施例进行了两批次(分别为400个种子和600个种子的合子胚)胚性细胞组织的制备。

外植体的来源及消毒方法、胚性细胞组织的诱导及体胚形成的具体操作过程与实施例1相同。

上述第一批次(400个种子的合子胚)胚性细胞组织的制备中，有115个胚性细胞组织被诱导成功，结果见表4。

表4  胚性细胞系的诱导数目及成功率

在表4中，生长指数：＝终止培养时的细胞鲜重/起始培养时的细胞鲜重，每周期为七天；干物质重(％)：＝细胞烘干后的干物质重量/细胞的鲜重(采用Ohaus水分分析仪测定，红外烘干)；成胚率(％)：＝成熟体胚的转化率＝成熟胚的数量/胚性细胞组织的总数，显微镜下观察；总蛋白含量：＝培养液中水溶性蛋白的含量(采用Sigma总蛋白试剂盒测定)。

第一批次诱导成功的100个胚性细胞组织经过14天的悬浮培养，有17个细胞系能够发育形成球型体胚，具体结果见表5，其中有4个细胞系体胚WS30、WS95、WS11和WS36的干物质重能达到大于或等于鲜重的20％，且总蛋白的含量可占鲜重的3～4.9％，其中细胞系WS30体胚的成胚率可达100％(结果如图2所示)，总蛋白含量达到鲜重的4.9％。

表5  体细胞胚的发育成胚率、干物质含量和总蛋白含量

上述第二批次(600个种子的合子胚)胚性细胞组织的制备中，有130个胚性细胞组织被诱导成功，将这些胚性细胞组织在体胚成熟培养基中悬浮培养，其中有45个细胞系可以产生成熟的体胚，具体结果见表6。

表6  胚性细胞系的诱导和体胚的发育成熟数目及成功率

对上述成功诱导出的45个体胚的干物质重和总蛋白含量进行测定，最后筛选出5个优良胚性细胞组织作为转化外源重组DNA的候选细胞组织，具体结果见表7。

表7  体细胞胚的发育成胚率、干物质含量和总蛋白含量

由此可知，只要有适量的外植体合子胚(400～1000个)，均可诱导筛选出适合用于转基因进行蛋白质制备的优良胚性细胞组织。

实施例3  白云杉胚性细胞的转基因

本实施例为采用不同的方法将目的基因转入上述实施例2中筛选出来具有生产潜力的白云杉胚性细胞组织WS30、WS95、WS11和WS36中。

1、土壤根癌农杆菌转化

本方法是采用农杆菌介导法将外源基因转入白云杉的胚性细胞组织(PEMs)中，并分析了有关因素对农杆菌转化的影响。

上述的4个具有生产潜力的细胞系WS30、WS95、WS11和WS36被用来作转化。采用的农杆菌株系是LBA4404(购自Invitrogen公司)，构建的两个质粒载体分别载有启动子Ubi3或H3，目的基因为葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase，GUS)或重组人类生长素(Human Growth Hormone，rHGH)基因(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示，所表达的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：2所示)，以及选择基因潮霉素磷酸转移酶(hygromycinephosphotransferase，HPT)。步骤详述如下：

(1)以在液体培养基中预培养5天的胚性细胞为受体，用载有目的基因和选择基因的农杆菌菌系感染胚性细胞，并在IND+100μmol/L乙酰丁香酮(Acetosyringon)固体培养基上共同培养3天，然后将农杆菌洗去。

(2)将被感染的胚性细胞置于含有IND+特美汀(400mg/L)的固体培养基上，5日后将细胞转移到含有5mg/L潮霉素(Hygromycin)的选择培养基IND中进行有选择的培养。

(3)将转GUS的细胞染色，以此来鉴定GUS在细胞质里的临时转化率，结果如图4所示。

(4)选择稳定转化细胞系的过程是，让细胞继续生长在含有潮霉素的选择培养基上，每两周转移到新鲜选择介质中。经过多次选择，在大约9周后可以形成稳定的转基因细胞系，见图5。

经聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫分析法(Enzyme-linkedimmunoassay，ELISA)检测(具体操作方法参见《分子克隆实验指南》(第二版)，美国冷泉港实验室出版社)，共获得了11个转基因系，具体如表8所示。

2、PDS-1000基因枪转化

上述载有外源基因的DNA质粒也可以通过基因枪的方法被直接打入胚性细胞的染色体中。

采用基因枪转化方法将上述的目的基因和选择基因的DNA直接插入白云杉胚性细胞。基因枪系统的原理是将微米大小的、包被有DNA的金微粒加速到所需要的速度，从而将基因导入细胞。

用于转基因的材料是已预培养5天的白云杉胚性细胞。在一个试管中，称50毫克(mg)的细胞并加入2毫升(mL)的IND培养液，震荡30秒使细胞悬浮在培养液中。在一个平底漏斗中加入一张直径为50mm的过滤纸，然后将2毫升悬浮的细胞均匀的撒在过滤纸上，真空抽去多余的液体。再将细胞连同过滤纸一起转移到含有IND+0.2M棉子糖+0.4％Gelrite的培养皿中。让细胞在培养基上适应1个小时，然后即可进行基因枪的轰击。金粉的配备是取清洗过的金粉50μl，加入5μl DNA(1μg/μl)。基因枪轰击细胞的压力是1100psi，轰击距离是6厘米。

将被轰击后的细胞连同培养皿放置到25℃生长箱中，在黑暗的条件下培养两天。然后将细胞转移到含有抗生素Hygromycin(5mg/L)的选择培养基上。每两个星期在同样的选择培养基上继代一次。经过多次选择，只有转基因成功的细胞可以存活在有抗生素的培养基中。

经PCR和ELISA检测，共获得了49个转基因系，具体如表8所示。

3、原生质体电穿孔技术

可采用原生质体电穿孔技术获得转化的胚性细胞，具体详述如下。

(1)原生质体的准备：1克的胚性细胞+5毫升酶溶液(0.6M甘露醇，5mM CaCl₂，10mM MES(吗啉乙烷磺酸)，1.67％(w/v)纤维素，0.67％(w/v)软化发酵素(macerase)及0.067％(w/v)果胶酶(Pectolase)Y-23))。

(2)在无光条件下轻微摇晃3个小时以做进一步的消化。原生质体通过过滤将未消化的细胞物和消化后的碎渣相分离，过滤是先通过100μm的尼龙滤膜，然后再用62μm的尼龙滤膜再过滤一次。原生质体被放置于一个15毫升的无菌尖底离心试管离心5分钟，300xg。上清液用移液管移去，沉淀的原生质体体用10毫升的洗涤液(0.6M mannitol，4mM MES pH5.7，20mM KCl)洗涤，离心5分钟。留存下来的原生质即可被用于电激转化。

(3)电穿孔：用微量离心管将30到50ugDNA接种物与300ul密度为5x10⁵到5x10⁶的原生质体细胞混合。样品置于冰上5分钟。电穿孔的条件如下：

电容量                             200μF

电压                               400V

电阻                               50ohms

时间常数                           ～5-10msec

样品后处理                         将样品放在冰上10分钟

将原生质体细胞转移到六孔的培养板上，每个孔加入1.5ml的原生质体培养介质(PCM)(配方见表9)，并在25℃，无光，每分钟40转的摇晃速度培养4个小时。原生质体被转移到含有PCM+1.6％的SeaPlaque^th琼脂糖的培养皿中(100x15毫米)，25℃暗培养。当见到新的细胞团时，证明细胞壁已恢复。此时将细胞团转移到上述的选择培养基上进行稳定转化细胞的筛选。

经PCR和ELISA检测，共获得了2个转基因系，具体如表8所示。

表8  稳定转基因蛋白细胞系

表9  原生质(PCM)培养介质配方(1L)

在优选的细胞系的生长发育过程中，被转化的目的基因的表达和重组蛋白的合成有两个阶段。在由胚性细胞组织(PEMs)为主要组成的放大期间，这些蛋白质的产率会比较低，约5-25mg/L，相当于烟草和稻米悬浮细胞中的表达水平。这些烟草和水稻细胞采用上述含有相同的核苷酸编码序列的人类生长素转化(基因枪和农杆菌介导转化)并在液体培养液中悬浮培养。在体细胞胚形成和成熟阶段，转基因蛋白的产率会增加，而在引进脱落酸和高渗透介质后的3～5周内，转基因蛋白会有进一步的增加，具体结果如表10所示。

表10  转基因蛋白HGH的产率

上述结果表明，针叶类体细胞胚悬浮培养系统是生产转基因药用蛋白的一个重大改革，是提高产率的有效途径。

序列表

<110>徐玉玲

     吕新波

     杨博文

     钟云翔

<120>一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法

<130>DIC09110209

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>663

<212>DNA

<213>rHGH

<400>1

atgggaaaaa tggcttctct atttgccaca tttttagtgg ttttagtgtc acttagctta    60

gcattcccaa ccattccctt atccaggctt tttgacaacg ctatgctccg cgcccatcgt    120

ctgcaccagc tggcctttga cacctaccag gagtttgaag aagcctatat cccaaaggaa    180

cagaagtatt cattcctgca gaacccccag acctccctct gtttctcaga gtctattccg    240

acaccctcca acagggagga aacacaacag aaatccaacc tagagctgct ccgcatctcc    300

ctgctgctca tccagtcgtg gctggagccc gtgcagttcc tcaggagtgt cttcgccaac    360

agcctggtgt acggcgcctc tgacagcaac gtctatgacc tcctaaagga cctagaggaa    420

ggcatccaaa cgctgatggg gaggctggaa gatggcagcc cccggactgg gcagatcttc    480

aagcagacct acagcaagtt cgacacaaac tcacacaacg atgacgcact actcaagaac    540

tacgggctgc tctactgctt caggaaggac atggacaagg tcgagacatt cctgcgcatc    600

gtgcagtgcc gctctgtgga gggcagctgc ggcttctcac catccccttc tcccagccca    660

tag                                                                  663

<210>2

<211>212

<212>PRT

<213>rHGH

<400>2

Met Gly Lys Met Ala Ser Leu Phe Ala Thr Phe Leu Val Val Leu Val

1               5                   10                  15

Ser Leu Ser Leu Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp

            20                  25                  30

Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr

        35                  40                  45

Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser

    50                  55                  60

Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro

65                  70                  75                  80

Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln

            100                 105                 110

Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp

        115                 120                 125

Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr

    130                 135                 140

Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe

145                 150                 155                 160

Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala

                165                 170                 175

Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp

            180                 185                 190

Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly

        195                 200                 205

Ser Cys Gly Phe

    210

Claims (85)

1.一种制备蛋白质的方法，其特征在于，所述方法是通过将含有需要制备的蛋白质基因转化到植物胚性细胞中进行培养到体细胞胚形成和成熟后来制备蛋白质的，所述方法包括以下步骤：

1)制备植物胚性细胞组织；

2)将需要制备的蛋白质基因转入步骤1)所制备的胚性细胞组织中；

3)培养步骤2)得到的胚性细胞组织，使其发育成熟为体细胞胚；

4)从步骤3)得到的体细胞胚中提取蛋白质；

所述步骤1)中制备植物胚性细胞组织的方法包括采用半固体培养基诱导体细胞分化成胚性细胞和采用液体培养基增殖的步骤；

所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法包括采用液体培养基悬浮培养的步骤,

其中，步骤1)制备植物胚性细胞组织使用的外植体为白云杉种子的合子胚。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述培养基为添加了1～20μmol/L生长素和/或1～20μmol/L细胞分裂素的1/2Litvay培养基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述的培养条件为：20～30℃，黑暗，90-120转/分钟摇床培养。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中将需要制备的蛋白质基因转入胚性细胞的方法选自：微粒-介导传递技术、原生质电穿孔方法、聚乙二醇析出技术、生物体外原生质转化技术、植物细胞原生质或胚性愈伤组织显微注射技术和土壤农杆菌转化方法。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中将需要制备的蛋白质基因转入胚性细胞的方法选自：微粒-介导传递技术、原生质电穿孔方法、聚乙二醇析出技术、生物体外原生质转化技术、植物细胞原生质或胚性愈伤组织显微注射技术和土壤农杆菌转化方法。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中将需要制备的蛋白质基因转入胚性细胞的方法选自：微粒-介导传递技术、原生质电穿孔方法、聚乙二醇析出技术、生物体外原生质转化技术、植物细胞原生质或胚性愈伤组织显微注射技术和土壤农杆菌转化方法。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法采用的液体培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法采用的液体培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法采用的液体培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法采用的液体培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法采用的液体培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法采用的液体培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

13.根据权利要求7-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

14.根据权利要求7-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法中采用液体培养基悬浮培养时的培养条件为：20～30℃，黑暗，60～120转/分钟摇床培养。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法中采用液体培养基悬浮培养时的培养条件为：20～30℃，黑暗，60～120转/分钟摇床培养。

16.根据权利要求7至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在超低温下冷冻保藏所述步骤1)中制备的胚性细胞组织或步骤2)中制备的转入蛋白质基因的胚性细胞组织的步骤。

17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在超低温下冷冻保藏所述步骤1)中制备的胚性细胞组织或步骤2)中制备的转入蛋白质基因的胚性细胞组织的步骤。

18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在超低温下冷冻保藏所述步骤1)中制备的胚性细胞组织或步骤2)中制备的转入蛋白质基因的胚性细胞组织的步骤。

19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在超低温下冷冻保藏所述步骤1)中制备的胚性细胞组织或步骤2)中制备的转入蛋白质基因的胚性细胞组织的步骤。

20.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述冷冻保藏温度为-196℃。

21.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述冷冻保藏温度为-196℃。

22.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述冷冻保藏温度为-196℃。

23.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述冷冻保藏温度为-196℃。

24.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

25.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

26.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

27.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

28.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

29.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

30.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

31.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

32.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

33.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

34.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

35.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养步骤2)得到的胚性细胞组织的方法还包括催化体细胞胚成熟的处理。

36.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

37.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

38.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

39.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

40.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

41.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

42.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

43.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

44.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

45.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

46.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

47.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，船式RAFT培养方法中的培养基为添加了生长抑制剂和/或渗压剂的1/2Litvay培养基。

48.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

49.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

50.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

51.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

52.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

53.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

54.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

55.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

56.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

57.根据权利要求45所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

58.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

59.根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述生长抑制剂为5～120μmol/L的脱落酸，所述渗压剂为蔗糖。

60.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

61.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

62.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

63.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

64.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

65.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

66.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

67.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

68.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

69.根据权利要求45所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

70.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

71.根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

72.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

73.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

74.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

75.根据权利要求51所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

76.根据权利要求52所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

77.根据权利要求53所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

78.根据权利要求54所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

79.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

80.根据权利要求56所述的方法，其特征在于，所述船式RAFT培养方法的培养条件为：20～30℃，黑暗，静置培养。

81.权利要求1至80中任一项所述的方法在制备蛋白质中的用途。

82.根据权利要求81所述的用途，其特征在于，所述蛋白质包括任何一种具有工业或药用价值的蛋白质或多肽。

83.根据权利要求82所述的用途，其特征在于，所述蛋白质或多肽为单克隆抗体和疫苗。

84.根据权利要求82所述的用途，其特征在于，所述蛋白质或多肽为重组人类生长素、人类生长素受体拮抗剂、胰岛素、细胞因子。

85.一种用于制备外源蛋白质的胚性细胞组织，其特征在于，所述胚性细胞组织是通过诱导白云杉种子的合子胚而形成。