KR101348905B1

KR101348905B1 - 난초류의 종자 형질전환 방법

Info

Publication number: KR101348905B1
Application number: KR1020110117507A
Authority: KR
Inventors: 빈철구; 김진기; 김수경; 노치웅; 최복경; 유재웅; 김두환
Original assignee: 경상남도
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2011-11-11
Publication date: 2014-01-09
Also published as: KR20130052194A

Abstract

본 발명은 난초류를 조직배양 없이 종자에 바로 형질전환하여 유전공학적으로 조작된 난초류를 개발하는 방법에 관한 것이다. 현재까지 난초류의 형질전환은 프로토콤 또는 PLB(원괴체상구체)를 통하여 이루어져 왔으나, 형질전환 효율, 카이메라 생성, 장기 배양에 따른 변이체 생성 등의 문제를 가지고 있다. 본 발명은 원하는 재조합유전자를 포함하는 아그로박테리움을 이용하여 난초류의 종자에 직접 형질전환하는 방법과 공정을 제공하는 것이다.

Description

난초류의 종자 형질전환 방법{Transformation Method using by Seed of Orchids}

본 발명은 난초류를 조직배양 없이 종자에 바로 아그로박테리움을 이용하여 형질전환하는 방법에 관한 것이다.

전통육종 기술외에 식물을 개량하기 위한 방법으로 '형질전환방법'이 제시되어 왔다. 이에 따라 효율적이고 신속한 형질전환방법의 개발은 이 분야에 있어서 매우 중요한 핵심적인 기술이다. 현재까지 식물의 형질전환방법은 직접적인 형질전환방법과 간접적인 형질전환방법으로 크게 나눌 수 있다.

직접적인 형질전환방법의 예로서는 엘렉트로포레이션(electroporation)법 (Shimamoto K. 등, Nature, 338 :274-276, 1989 ; 및 Rhodes C.A. 등, Science, 240 :204-207, 1989 참조), 미세입자투사법 (Christou P. 등, Bio/Technology, 9 :957-962, 1991 참조) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)법(Datta, S. K. 등, Bio/Technology, 8 :736-740, 1990 참조) 등을 들 수 있다. 간접적인 형질전환방법으로서는 아그로박테리움 매개 형질전환방법(이하 아그로박테리움 형질전환방법이라 칭함)을 들 수 있다. 아그로박테리움은 식물병원세균의 일종이다. 아그로박테리움은 식물에 감염하고, 스스로 지니는 플라스미드(예를 들면, Ti 플라스미드 또는 Ri 플라스미드)상에 존재하는 T-DNA 영역을 식물에 도입하는 성질을 지닌다. 아그로박테리움 형질전환방법에는 식물에 유전자를 도입하는 수단으로서 이 T-DNA 영역의 식물에 도입을 이용한다. 간단하게는 식물을 원하는 재조합 유전자를 포함하는 아그로박테리움에 감염시킨다. 감염 후 원하는 재조합 유전자는 아그로박테리움으로부터 식물 게놈에 도입된다.

직접적인 형질전환법 중 식물의 형질전환에 미세입자 투사법이 초기에 아그로박테리움법이 잘되지 않던 난초류를 포함한 단자엽을 위주로 시도되었으나, 형질전환체의 안정성 면에서 문제가 많았으며, 벼에서 아그로박테리움에 의한 형질전환이 성공하고 이후 다른 단자엽 식물에서도 아그로박테리움에 의한 형질전환이 일반화됨에 따라 식물에서 아그로박테리움을 이용한 형질전환법이 표준적인 방법으로 자리 잡았다. 아그로박테리움 형질전환방법은 쌍자엽 및 단자엽 식물에 충분히 확립되어 있고, 현재로서는 원하는 재조합 유전자를 발현하는 안정한 형질전환 식물이 다수 재배되고 있다.

난류의 형질전환에 있어서도 초기에 미세입자 투사법에 의한 형질전환이 성공하였으나 (Anzai H 등, 1996년 plant Tissue Culture letters 13: 265-271; Kuehnle AR 등, 1992년 plant cell report 11:484-488; Chia TF등, 1990년 Plant journal 6:441-446) 안정성과 효율면에서 개선의 여지가 있었다. 이후 아그로박테리움에 의한 형질전환이 호접란, 심비디움, 덴드로비움 등 난류에서 성공하였다 (Belarmino와 Mii, 2000년 Plant Cel Reports 19: 435-442; Knapp 등, 2000년 Plant Cel Reports 19: 893-898; Yu 등, 2001년 Plant Cel Reports 20:301-305; Chai 등, 2002 Scientia Horticulturae 96:213-224; Liau 등, 2003년 Plant Cel Reports 21: 993-998; Men 등, 2003 Plant Cel Reports 21: 592-598; Misiba 등, 2005 Plant Cel Reports 24: 297-303; Chan 등, 2005 Transgenic research 14:279-288). 현재까지 난초류의 형질전환은 신초의 정단 분열조직에서 유도된 원괴체상구체를 재료로 하여 행해졌다. 원괴체상구체(protocorm-like body: PLB)는 정단 또는 측아분열조직(axillary bud meristem)의 시험관내 배양으로 유도되어 지며, 기능적으로나 구조적으로 배아의 원괴체와 유사하다. 따라서 이를 재료로 하여 형질전환을 하기 위해서는 PLB의 유기 및 기내배양이 선결되어야 하며, 많은 시간과 노력이 필요하고 배양과정중의 변이체 생성이나 카이메라 가능성 등의 문제를 안고 있으며 형질전환 효율 또한 좋지 못하다.

난초류를 PLB를 이용하여 형질전환 하는데 있어서 다른 식물들과는 다른 몇가지 문제점이 존재한다. 첫째, 난초류 세포들은 증식속도가 느리다. 둘째, 난초류 세포들은 조직배양 하는데 있어 각종 조작에 잘 반응하지 않는다. 셋째, 분리된 분화세포로부터 식물 재발생이 난초류에서는 이루어지지 않는다. 넷째, 난초류 세포들은 가나마이신과 같은 항생물질을 이용한 선발이 용이하지 않다. 난초는 통상 가나마이신(kanamycin)같은 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계에 저항성이 높은 것으로 알려져 있으며, 형질전환 세포를 선발하기 위해서는 보통 500mg/L 이상의 가나마이신이 필요하다 (Chia 등, Plant Journal 6:441-446, 1994). 다섯째, 난초류 세포들에는 페놀산의 함량이 많으며 이들의 산화물은 세포들에 독이 된다. 마지막으로, 난초의 형질전환에 쓰이는 분열조직 (원괴체상구체)의 다중세포 구조 때문에, 야기된 형질전환 식물이 때로 형질전환 과 비-형질전환 부분을 지닌 키메라(chimera)가 될 수 있다. 난초류의 종자는 배유가 없는 배아 상태로 존재하며 일반적인 상황에서 발아가 잘 안되며, 영양배지에서 기내배양을 거쳐 원괴체로 자란 후 발달을 진행한다. 위에 재시한 PLB의 문제점을 개선하기 위해 2005년에 Mishiba 등이 (Plant Cell reports 24:297-303) 종자로부터 유도된 원괴체(protocorm)를 이용하여 형질전환에 성공한바 있으나 이 역시 21일 이상 배양한 원괴체를 대상으로 하였으며, 21일전 배양 원괴체나 배양전 종자는 형질전환시에 선발마커로 사용되는 하이그로마이신이나 가나마이신 처리에서 살아남지 못하여 형질전환이 불가능하다고 하였다. 일반적으로 난초류의 종자는 미숙성 상태로 배유가 없다. 따라서 자체 발아능이 거의 없으며 자연상태에서는 공생균과의 상호작용에 의해 기내에서는 세밀하게 조율된 영양물질 배지하에서만 발아가 가능하다(Joseph Arditti, 1967년, The Botanical Review 33:1-97). 그러므로 난초류 종자를 직접 아그로박테리움을 이용하여 감염시켜 형질전환을 수행하기위해서는 이러한 난초종자의 근원적인 문제점을 극복할 수 있는 방법이 개발되어야 한다.

본 발명은 상기 과제의 해결을 의도하기 위한 것이다. 본 발명의 목적은 난초류 식물의 아그로박테리움 형질전환방법의 개량을 제공하는 것이다.

본 발명은 난초류 식물의 형질전환방법에 관해 원하는 재조합 유전자를 포함하는 아그로박테리움으로 난초류 종자를 직접 감염하는 단계를 포함한다. 본 방법에 있어서 종자는 난초류 종자의 생물학적으로 연약한 문제를 극복하기 위하여 꼬투리를 디스크 형태로 절단 가공한 상태로 감염시키는 것을 말한다. 아그로박테리움으로 감염에 제공되는 종자는 형질전환시킨 단자엽식물은 바람직하게는 난과(Gramineae family)식물이고, 더욱 바람직하게는 호접란(Phalaenopsis L.) 이다.

본 발명의 방법에 의하면 종래의 아그로박테리움 형질전환방법보다도 효율이 양호하고 보다 신속하게 형질전환식물을 생성하는 것이 가능하다. 본 방법에 의한 방법은 형질전환하려는 식물시료를 재분화시키는 것과 같은 처리가 필요하지 않다.

종래의 방법은 아그로박테리움의 감염전에 PLB를 유도하기 위하여 통상 3 ~ 4 주간의 유도기간을 필요로 한다. 대조적으로 본 발명의 방법은 프로토콤 또는 PLB를 유도하는 공정을 필요로 하지 않고, 형질전환 식물을 제조하기 위해 필요한 시간을 단축하는 것이 가능하다. 더욱이 본 발명의 방법에 의하면 종래 방법에 비해 선별을 요하는 기간을 단축하는 것이 가능하고, 배양변이의 영향을 감소하는 것도 가능하다.

도 1(A)는 형질전환에 사용된 숙성된 호접란 꼬투리를 나타낸 사진이다.
도 1(B) 아그로박테리움을 효율적으로 감염하기 위해 난 꼬투리를 절편으로 자른 상태를 나타낸 사진이다.
도 2(A)는 아그로박테리움 감염 후 약 50일 후에 본 발명의 방법에 따라 얻어진 호접란의 발아 개체를 나타낸 것으로 생물의 형태를 나타낸 사진이다.
도 2(B)은 아그로박테리움 감염 후 약 120일 후 수태로 옮겨 활착한 상태의 형질전환체 이다.
도 3은 형질전환 여부를 GUS 유전자 부위를 이용 PCR 방법으로 검증한 결과이다.
도 4는 형질전환 여부를 GUS 유전자 발현에 의한 조직 염색법을 이용하여 검증한 결과이다

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 난초류 식물의 형질전환방법에 있어서, 원하는 재조합 유전자를 포함하는 아그로박테리움으로 본래의 종자를 감염시키는 공정을 포함하는 형질전환방법에 관한 것이다. 상기 종자는 수정 후 완숙된 꼬투리 상태이며, 특히 상기 종자는 꼬투리체로 소독 후 디스크 모양으로 절단한 절편으로 가공하는 것이다.

본 발명의 방법이 적용되는 '식물'은 난초류 식물이다. 본 발명의 방법이 적용되는 가장 바람직한 식물은 호접란이다.

본 발명의 목적, 장점 및 특성은 이하 명세서와 도면을 통해 더욱 명백히 할 것이다.

본 발명에 따라 난초류 종자를 직접 형질전환에 적용할 수 있음이 밝혀졌다. 이 방법을 이용하여 형질전환된 호접란를 개발할 수 있었다. 본 발명에 이용된 기술은 다른 난초류에서도 동일하게 적용될 수 있기 때문에, 이제는 유전공학적으로 난초류의 질병에 대한 저항성, 개화시기의 조작, 꽃의 색깔과 형태의 조작 및 다른 원예적가치가 있는 형질전환된 난초식물의 개발이 가능해진다. 이 방법은 모든 난초류와 특히 호접란 난초류에 적용가능하다.

본 발명에 사용되는 난초라는 용어는 종자식물문(Spermatophyta) 내의 난초목(Orchidales)에 관한 것이다. 본 발명의 실시에 이용되는 난초류의 예를 들면, 아시안터스(Acianthus), 에어라이드스(Aerides), 에노엑토실러스(Anoectochilus), 안셀리아(Ansellia), 아플렉트럼(Aplectrum), 아레터사(Arethusa), 칼란테(Calanthe), 케틀레야(Cattleya), 코엘로자인(Coelogyne), 코렐로이자(Corallorhiza), 심비디움(Cymbidium), 시프리페디움(Cypripedium), 크리토포디움(Crytopodium), 덴드로비움(Dendrobium), 에피덴드럼(Epidendrum), 구우디에라(Goodyera), 리스테라(Listera), 마코드스(Macodes), 온시디움(Oncidium), 팔라에높시스(Phalaenopsis), 폴리도타(Pholidota), 린코스타일리스(Rhynchostylis) 및 반다(Vanda) 속을 포함하는 난초과(Orchidaceae)이다. 본 발명의 실시를 위해서는 호접란이 바람직하다.

여기에 기재된 방법은 난초 식물의 게놈내로 외래 유전자들을 도입하는 것에 관한 것이다. 그러한 외래 유전자들은 다른 유기조직 즉, 동일하거나 다른 종으로부터 유래된 DNA 가 바람직하고, 이를 인위적인 조작을 통해 난초 세포로 도입시킨다. 외래 유전자들은 보통 그 생성물이 난초 세포의 전사 생성물 또는 관심 있는 단백질을 합성할 수 있는 염기서열을 포함한다.

(식물발현용 벡터의 제작)

식물에 원하는 재조합 유전자를 도입하기 위해서는, 원하는 재조합 유전자를 포함하는 적절한 식물발현용 벡터가 제작되어야 한다. 이와 같은 식물발현용 벡터는 통상의 지식을 가진 자가 주지의 유전자 조합기술을 이용하여 제조하여 얻는다. 아그로박테리움 형질전환방법에 있어서 사용하기 위한 식물형질발현용 벡터의 구축은 예를 들면, pCAMBIA계 벡터가 바람직하게 사용되지만 이것으로 한정하지는 않는다. 재조합 유전자는 식물에 도입하기를 원하는 임의의 DNA를 뜻한다. 본 발명에 있어서 원하는 재조합 유전자는 천연 또는 분리된 것으로 한정하지 않고, 합성 DNA도 포함하는 것이다. 합성 DNA란 예를 들면, 공지 서열의 유전자를 통상의 지식을 가진 자가 주지의 방법에 의해 합성 또는 변형한 것을 포함할 수 있다. 이 경우 SiRNA 또는 miRNA 등과 같이 작은 크기의 유전자 발현 억제 유전자의 경우에 효과적으로 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 원하는 재조합 유전자로서는 형질전환된 식물에 있어서 발현이 요망되는 것으로, 이 식물에 대해 내인성 또는 외인성인 임의의 DNA로 병저항성, 스트레스 저항성, 꽃의 모양 또는 색깔을 변형하는 유전자 및 이를 야기하는 전사조절인자 등을 들 수 있다. 또한 글루쿠로니데이즈(GUS)나 녹색형광 단백질(GFP) 등의 리포터 유전자를 형질전환 여부나 프로모터의 특성을 파악하기 위하여 사용 할 수 있다.

식물에 있어서 발현을 의도하는 경우, 원하는 재조합 유전자는 자기 프로모터(즉, 천연에 있어서 해당 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터)가 작동가능케 한 형태를 포함한다. 또한, 자기 프로모터를 포함하지 않는 경우에 있어서 자기 프로모터 이외의 프로모터를 더욱 포함하는 것이 요청되는 경우, 임의의 적절한 프로모터와 작동 가능케 연결 시킨다. 사용할 수 있는 프로모터로서는 구조적 프로모터 및 식물체 일부에 있어서 선택적으로 발현하는 프로모터와 유도성 프로모터를 들 수 있다. 식물발현용 벡터에 있어서, 더욱이 각종의 조절 엘레멘트가 숙주식물에 세포중에서 작동할 수 있는 상태로 연결시킨다. 조절 엘레멘트는 바람직하게는 선별마커 유전자, 식물 프로모터, 터미네이터 및 인핸서를 포함한다. 사용하는 식물발현용 벡터의 형태 및 조절 엘레멘트의 종류는 형질전환 목적에 부응하여 변환시켜 얻을 수 있으며 이는 통상의 지식을 가진자 간에 주지의 사실이다. '식물 프로모터'는 선별 마커 유전자에 작동가능하게 연결되며, 식물에서 발현하는 프로모터를 의미한다. 이와 같은 프로모터의 예로서는 칼리플라워 모자익 바이러스(CaMV) 35S 프로모터 및 노팔라인 신세테이즈 프로모터를 들 수 있으나 이들로 한정하는 것은 아니다.

'터미네이터'는 유전자의 단백질을 코드화시키는 영역의 다운스트림에 위치하고 DNA가 mRNA 전사되는 경우의 전사의 종결 및 폴리 A 서열의 부가에 관여하여 배열한다. 터미네이터의 예로서는 CaMV35S 터미네이터와 노팔라인 신세테이즈 터미네이터(Tnos)를 들 수 있으나 이들로 한정하는 것은 아니다.

'인핸서'는 목적유전자의 발현 효율을 높이기 위해 사용하는 것이다. 인핸서로서는 CaMV35S 프로모터 내의 업스트림 영역에 인핸서를 포함하는 것이 바람직하다. 인핸서는 한 개의 식물발현용 벡터에 있어서 다수의 인핸서를 사용할 수 있다.

'선별 마커 유전자'는 형질전환 식물의 선별을 용이하게 하기 위해서 사용할 수 있다. 하이그로마이신 내성을 부여하기 위해서 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT) 유전자, 및 가나마이신 내성을 부여하기 위해서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제Ⅱ (NPTⅡ) 유전자와 같은 약제 내성 유전자를 적절하게 사용할 수 있으나, 이것들로 한정하는 것은 아니다.

(식물의 형질전환)

식물의 형질전환에 사용되는 아그로박테리움 균주는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터 분리되고 개량된 LBA4404, EHA105 그리고 C58c1 등의 특정 셀라인들이다. 아그로박테리움은 원하는 재조합 유전자를 포함하는 식물발현용 벡터로 형질전환된 후 식물 감염에 사용된다. 형질전환된 아그로박테리움으로 종자를 감염시키는 것에 의해, 원하는 재조합 유전자를 식물에 도입 한다. 도입된 재조합 유전자는 식물중의 게놈에 인티그레이션(integration)되어 존재한다.

종자는 교배 후 숙성된 꼬투리를 수확하여 표면 살균후 2mm 두께의 디스크 형태로 절단하여 무균조작하에서 형질전환시킨 아그로박테리움에 감염시켜진다. 아그로박테리움 감염(공존배양)의 기간중에 종자는 암 조건 하에서 대체적으로 2 ~ 5일간, 바람직하게는 2일간 인큐베이션시킨다. 이 때 온도는 대체적으로 26 ~ 28℃이고 바람직하기로는 28℃이다. 그리고 종자는 배지중의 아그로박테리움을 제거하기 위해 적절한 살균제(예를 들면, 카르베니실린, 세포톡심)에 의해 처리된며, 형질전환된 개체만 선발하기위하여 선별마커 (예를 들면, 하이그로마이신 내성 등의 약제내성)를 이용하여 선별한다.

적절한 살균조건 및 선별조건 하에서 배양 후 선별된 형질전환 종자는 적절한 배지(예를 들면, MS 배지)에 이전시키고, 적절한 기간 인큐베이션 행한다. 식물체를 재생하기 위해서는 재분화시킨 형질전환체는 발근배지(rooting medium)(예를 들면, 식물조절물질을 포함하지 않는 MS 배지)에 이전시킨다. 뿌리의 발육을 확인한 후, 형질전환체는 화분으로 이식된다. 식물에 도입시킨 원하는 재조합 유전자는 식물에 있어서 원하는 목적(예를 들면, 목적하는 신규 형질 유전자의 과발현, 또는 이 내인성 유전자의 발현억제)으로 작용시킨다. 원하는 재조합 유전자가 식물에 도입되었는지 여부는 통상의 지식을 가진 자의 주지의 수법을 이용하여 PCR, 서던블롯 또는 노던블롯 등의 방법을 통하여 확인할 수 있다. 한편, 원하는 재조합 유전자의 도입에 따라 식물에 있어서 내인성 유전자의 발현억제가 소망되는 경우, 표적이 되는 내인성 유전자의 발현을 예를 들면, 상기 노던 블랏 또는 qRT-PCR를 사용하여 대조구와 발현량을 비교하여 시험한다.

(실시예)

이하 실시예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 이 실시예는 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 실시예로 사용된 재료, 시약 등은 특히 특정하지 아니한 한 상업적인 공급원으로부터 입수 가능한 것이다.

(절편제작)

본 발명의 방법에 따른 호접란 식물의 형질전환을 위해 호접란 품종 Taisuco Mushadian과 Sogo Musadian을 교배한후 140일후 꼬투리를 수확하여 아코올솜으로 표면소독 1회후 2.5% 소디움 하이포클로라이트(NaClO) 용액 중으로 25분간 흔들면서 소독한다. 고압멸균수로 3번 충분히 세척 후 꼬투리를 메스를 이용 수직으로 2mm 두께로 절단하여 절편상태로 만든다.

(식물발현용 벡터 제작)

아그로박테리움을 형질전환시키기 위한 식물발현용 벡터로서는 35S프로모터를 포함하는 GUS 유전자와 하이그로마이신 내성 유전자를 연결시킨 플라스미드인 pCAMBIA1301을 사용하여 아그로박테리움 C58c1 균주를 형질전환시킨다.

(아그로박테리움 감염)

형질전환시킨 아그로박테리움 현탁액에 2mm 두께 절편으로 자른 꼬투리를 5분간 침적시킨 후, 1/2MS 배지 (30g/L의 슈크로즈, 1g/L의 카사미노산, 100mM/L의 아세토시린곤, 2g/L의 겔란검, pH 5.8)에 옮긴후 암 조건하에서 2일간 28℃로 인큐베이션하여 공존배양시킨다.

(살균 및 선별)

공존배양 완료 후, 세척액(10mM MgSO4, 600mg/L 카르베니실린, 1% Tween20) 200ml을 이용하여 종자로부터 아그로박테리움을 3번 세척시킨다음 선택배지로 옮긴다.

선별배지: hyponex 3g, peptone 1.5g, 감자 100g, 수크로스 10g, 한천 8g, charcol 0.5g 카르베니실린(300mg/L) 및 하이그로마이신(25mg/L)

(재분화)

선발후 발아된 종자는 신초 및 뿌리유도 배지에서 재분화시킨다.

재분화 배지:(hyponex 3g, peptone 1.5g, 감자 100g, 수크로스 10g, 한천 8g, charcol 0.5g 카르베니실린(300mg/L) 및 하이그로마이신(25mg/L))상에 선별된 종자를 배치시키고, 2주간 27 ~ 32℃에서 인큐베이션시킨다.

(화분으로 옮겨심기)

재분화된 형질전환체를 발근배지(하이그로마이신 25mg/L을 보충시킨 호르몬을 함유하지 않은 MS 배지)에 이식시키고 뿌리의 발육을 확인한 후 형질전환체를 화분에 수태를 이용하여 옮겨심는다.

[산업상 이용 가능성]

본 발명에 의하면, 개량된 아그로박테리움 매개성의 난초류 식물의 종자 형질전환방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법에 있어서는 형질전환을 유도하는 식물의 본래의 종자가 원하는 재조합 유전자를 포함하는 아그로박테리움에 감염된다. 본 발명의 사용에 의해 높은 효율과 신속한 속도로 형질전환식물을 개발하는 것이 가능하다.

Claims

난초류 식물의 형질전환방법에 있어서,
상기 난초류 식물의 미숙된 종자를 꼬투리체로 소독하고 절단하여 상기 꼬투리의 일부와 상기 미숙된 종자가 분리되지 않은 디스크 모양의 절편으로 가공하는 단계; 및
원하는 재조합 유전자를 포함하는 아그로박테리움으로 상기 절편을 감염시키는 단계를 포함하는 난초류의 종자 형질전환 방법.
제 1항에 있어서, 상기 난초류는 아시안터스(Acianthus)속, 에어라이드스(Aerides)속, 에노엑토실러스(Anoectochilus)속, 안셀리아(Ansellia)속, 아플렉트럼(Aplectrum)속, 아레터사(Arethusa)속, 칼란테(Calanthe)속, 케틀레야(Cattleya)속, 코엘로자인(Coelogyne)속, 코렐로이자(Corallorhiza)속, 심비디움(Cymbidium)속, 시프리페디움(Cypripedium)속, 크리토포디움(Crytopodium)속, 덴드로비움(Dendrobium)속, 에피덴드럼(Epidendrum)속, 구우디에라(Goodyera)속, 리스테라(Listera)속, 마코드스(Macodes)속, 온시디움(Oncidium)속, 팔라에높시스(Phalaenopsis)속, 폴리도타(Pholidota)속, 린코스타일리스(Rhynchostylis)속 및 반다(Vanda) 속으로 구성된 류에서 선택됨을 특징으로 하는 난초류의 종자 형질전환 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 난초류는 팔레높시스(Phalaenopsis)속임을 특징으로 하는 난초류의 종자 형질전환 방법.
제1항에 있어서,
상기 절편을 감염시키는 단계에서, 상기 절편을 암조건이고, 26~28℃ 범위 내에서 2~5일간 인큐베이션시키는 난초류의 종자 형질전환 방법.