CN105165634A

CN105165634A - 一种文心兰无毒种苗生产方法

Info

Publication number: CN105165634A
Application number: CN201510733070.2A
Authority: CN
Inventors: 林明光; 刘福秀; 王安石; 韩松
Original assignee: Postentry Quarantine Station For Tropical Plant Hainan Entryexit Inspection And Quarantine Bureau
Current assignee: Postentry Quarantine Station For Tropical Plant Hainan Entryexit Inspection And Quarantine Bureau
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明属植物栽培技术领域，涉及一种文心兰无毒种苗生产方法，是建设具有遮雨、防虫、遮阳、控温控湿的母本园，将检测确定不带有CymMV和ORSV二种病毒的目标母本作为繁殖母株保存于母本园中，在母本园中选取花梗芽进行组培快繁。本发明简单高效、经济适用、易于操作，彻底解决了文心兰无毒种苗工厂化生产的技术难题，为改善文心兰的健康状况，提高文心兰的生长速度，增强文心兰的生长势提供了技术支撑，为文心兰种苗的企业化生产提供基础保障，有效推动我国无毒种苗生产技术的发展，实现降低成本、提高产量、增加收入的目标，从而实现经济、社会和生态效益三者有机结合。

Description

一种文心兰无毒种苗生产方法

技术领域

本发明属植物栽培技术领域，涉及一种种苗的生产方法，具体是一种文心兰无毒种苗生产方法。

背景技术

文心兰是文心兰属(Oncidium)植物总称，其花姿优美、分枝性高、花朵数多、花色亮丽抢眼，甚具喜气，是独具优势的鲜切花品种，在西洋插花或是节庆活动上常广泛地应用，市场潜力巨大。

世界栽培的文心兰切花品种以南茜(OncidiumGowerRamsey)及其变异品种仍为文心兰主栽品种，由于品种间杂交不育和自交不亲和，生产上所需的种苗主要通过组培快繁技术进行培育。组织培养技术在克隆亲本植物性状同时，也复制其亲本单株所感染的病毒病。病毒病是文心兰生产上重要病害，可感染兰花病毒种类至少有20多种，兰花病毒广泛分布于全世界各个兰园，其中最常见的和经济意义最大的要数建兰花叶病毒(Cymbidiummosaicvirus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontolossumringspotvirus,ORSV)。CymMV在叶片和花瓣上造成变色和向下凹陷的坏死斑块，花朵受害形成畸形和花色条斑。ORSV在叶片上形成条状或线状花叶，或形成菱形或环形的斑点，有时在花瓣上也能见到花斑或环斑。且这两种病毒通常在文心兰上复合感染，复合感染这两种病毒的花朵能产生棕色的坏死条斑，造成更为严重的危害。

文心兰生产上使用携带CymMV和ORSV病毒的种苗极为普遍，严重影响后续的生长发育、开花品质和鲜切花产量。文心兰感染病毒初期并不表现明显症状，容易被栽培者疏忽，外表健康的植株很难确定是否携带病毒，而一旦母株感染了病毒，所有后代就都会带毒，而且地区间频繁地引种与品种交流也增加了病毒传播的机会。感染病毒的植株通常都能长出看起来很健康的新叶，但开出的花却表现出坏死斑等影响市场价值的症状。为解决文心兰工厂化育苗过程中种苗带毒率高的问题，筛选出未感染病毒的母本植株对于生产高质量无毒种苗，以满足国内外鲜切花和种苗市场的需要是非常重要的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种文心兰无毒种苗生产方法，解决了文心兰无毒种苗工厂化生产的技术难题，为改善文心兰的健康状况，提高文心兰的生长速度，增强文心兰的生长势提供了技术支撑，有效推动我国无毒种苗生产技术的发展，实现经济、社会和生态效益三者有机结合。

本发明所采用的技术方案：

一种文心兰无毒种苗生产方法，其具体步骤如下：

1、无病毒母本园的建设与管理

建设具有遮雨、防虫、遮阳、控温控湿的母本园，温度控制在25～30℃。冬季的阳光直射，夏季遮光率60～70％，其他季节遮光率40％。

从大田采集优良性状或变异单株或引进的目标母本，经检测确定不带有CymMV和ORSV二种病毒后作为繁殖母株保存于母本园中，管理过程中采取隔离、消毒措施，避免目标母本被病毒感染。

2、文心兰病毒检测

从田间收集或引种具有优良性状的繁殖母株样品，采用双抗体夹心法(DAS-ELISA)检测CymMV和ORSV。选取有病毒感染症状植株的具有明显症状叶片，或无病毒感染症状植株的完全展开的淡绿期叶片，样品采集时，用灭菌的手术剪剪取叶片1片置于封口袋中-20℃保存，最多存放7d。每个样品设置2个重复。两种病毒的检测结果均为阴性的样品进入母本园，任一病毒检测结果出现阳性均不能入园。组培快繁前用同样的方法对所用母本植株进行CymMV和ORSV检测，两种病毒的检测结果均为阴性的植株方能进行组培操作，任一病毒检测结果出现阳性均应淘汰并移出母本园。

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测技术检测组培母瓶的带毒情况。两种病毒的检测结果均为阴性的组培瓶进入下一步扩繁操作，任一病毒检测结果出现阳性均淘汰。

3、花梗芽组培快繁

在母本园中选取花梗清洗后消毒，选择带有休眠芽的花梗，以休眠芽为中心点上下各2.0～2.5cm处切成长4.0～5.0cm的小段，剥去休眠芽上的苞片，露出花芽，消毒后晾干备用。

将带有休眠芽的花梗小段放入诱导培养基中培养，诱导培养35～40d后把已经转化成营养芽的小段转入继代培养基中进行增殖培养(没有转化成营养芽的小段重新切段转入诱导培养基继续诱导，以35～40d为一个诱导培养周期，转接3次后约95％的休眠芽转化为营养芽，把经过三次诱导所获得的营养芽进行增殖培养)。所述诱导培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加6-BA2.0mg·L^-1、TDZ1.0mg·L^-1、NAA0.2mg·L^-1、卡拉胶8.0g·L^-1、蔗糖25g·L^-1，pH为5.6。所述继代培养基是以MS为基本培养基，并添加6-BA3.0mg·L^-1、NAA0.3mg·L^-1、椰子水100mL·L^-1、卡拉胶8.0g·L^-1、蔗糖25g·L^-1，pH为5.6。

继代增殖培养过程中，增殖培养初期20～25d为一个转接周期，由于原球茎生长对营养的消耗量较大，较短的转接周期利于原球茎保持最好的增殖生长状态，待原球茎增殖生成后40～45d为一个循环周期继代转接一次，直至丛生芽生成。

将继代增殖所获得的丛生芽转入壮苗培养基中进行壮苗培养，50～60d为一个周期转接一次，待小苗株高达到3.0cm以上时转入生根培养基进行培养，株高在3.0cm以下的小苗继续进行壮苗培养。所述壮苗培养是以MS为基础培养基，并添加香蕉浆50g·L^-1、卡拉胶8.0g·L^-1、蔗糖25g·L^-1，pH为5.6。

经壮苗培养株高达到3.0cm以上、有5～6片叶的小苗切分成独立的植株，转入生根培养基进行生根培养；经生根培养60d后，待小苗长出7～9片叶，3～6条根时即可移出培养室进行炼苗移栽。所述生根培养基是以1/2MS为基础培养基，并添加NAA0.5mg·L^-1、香蕉浆50g·L^-1、卡拉胶8.0g·L^-1、蔗糖25g·L^-1，pH为5.6。

上述培养过程中，培养条件：培养温度为23～27℃，光照强度2000～2500Lux；每天光照时间为10～12小时。

所述香蕉浆是取香蕉果肉打成浆状。

本发明所具有的技术优势：

本发明简单高效、经济适用、易于操作，彻底解决了文心兰无毒种苗工厂化生产的技术难题，为改善文心兰的健康状况，提高文心兰的生长速度，增强文心兰的生长势提供了技术支撑，为文心兰种苗的企业化生产提供基础保障，有效推动我国无毒种苗生产技术的发展，实现降低成本、提高产量、增加收入的目标，从而实现经济、社会和生态效益三者有机结合。

附图说明

图1是各种文心兰种苗的生长情况对比。

A：本发明生产的无毒种苗；B：携带CymMV的种苗；C：携带ORSV的种苗；D：CymMV和ORSV复合感染的种苗。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1、选取具有遮雨、防虫(防虫网为100目)、移动式遮阳网和水帘风机或空调、喷灌设施等调节温湿度的隔离环境作为母本园。温度控制在25～30℃。冬季的阳光直射，夏季遮光率60～70％，春秋季遮光率40％；

S1：母本入园前，采用双抗体夹心法(DAS-ELISA)按照Liuetal.(2013)的方法检测CymMV和ORSV。每个样品设置2个重复。读取405nm的吸收值，参照Satula等(1986)的方法，吸收值在阴性对照的2倍以上视为阳性。两种病毒的检测结果均为阴性的样品进入母本园待用，任一病毒检测结果出现阳性均不得进入母本园；

S2：对进入母本园内的所有无病毒繁殖母株进行独立编号，植株间不得相互接触。栽培期间若发现可疑植株应立即按S1的方法进行病毒检测，检测结果为阳性者，为绝对避免碰触其他植株，立即用报纸等包裹后移出母本园，原置放位置进行消毒处理。母本园每半年按S1的方法例行一次病毒检测；

S3：母本园中所需的器材和工具等的使用前以及场地表面均应进行消毒处理。器材和工具等的消毒，根据实际情况，可采取如下四种消毒方法之一。一是干热消毒法，利用烘箱在180℃至少维持2.5小时；二是湿热消毒法，以沸水煮沸至少15分钟；三是火焰消毒法，将工具上接触过植物汁液的部位以火焰烧烤至少10秒。四是化学药品消毒法，以3％氢氧化钠或磷酸三钠溶液浸渍至少1分钟。场地外表面消毒，先用清水洗涤干净，再以0.5％漂白水喷湿表面处理，母本园地板应定期消毒。其他人为接触频繁的部位，如门把、电器开关、浇水喷头手把、扫帚手把或工作台面等，定期以0.5％漂白水充分擦拭；

S4：母本园严格管控人员出入。严禁工作人员在对母株进行修剪、交配授粉或整理等操作时，有任何人为接触植株的行为，使用的工具应经消毒处理，单株单剪，随株更换，不得重复使用。操作时应配戴抽换式手套，且必须随植株更换；

S5：随时保持母本园内整洁，植株残体随时清除。所使用的工具如扫帚、垃圾桶、浇水喷头等独立配置，不与一般栽培场所混用。所使用盆钵、介质、器具及花梗固定用器材等采用全新资材。设置管理纪录簿，仔细记录母本编号、移入日期、存放位置及病虫害防治措施等。

2、拟用于无毒苗生产的候选母本使用前按S1的方法进行病毒检测，取确认阴性母本花梗清洗干净后送入接种室作为外殖体进行组培扩繁操作。先用75％的酒精对花梗进行喷淋，然后置于超净工作台上用浸在75％酒精里的湿棉球对整个花梗进行进一步的表面清洁消毒，待稍干后用无菌手术刀将带有休眠芽的花梗，以休眠芽为中心点上下各约2.0cm处切成长4.0cm左右的小段，剥去休眠芽上的苞片，露出花芽。置于75％的酒精有浸泡10秒，移至0.1％的升汞溶液浸泡并轻摇12分钟，无菌蒸馏水清洗5次后于无菌吸水纸上晾干备用。

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测技术，参照刘福秀等(2014)的方法检测组培母瓶的带毒情况。扩增结果出现675bp条带视为CymMV阳性，出现524bp条带视为ORSV阳性。两种病毒的检测结果均为阴性的组培瓶进入下一步扩繁操作，任一病毒检测结果出现阳性均淘汰。

3、组织培养的培养条件：培养温度为23～27℃，光照强度2000～2500Lux；每天光照时间为10～12h。取香蕉果肉打成浆状，备用。

将带有休眠芽的花梗小段放入诱导培养基中培养，初代诱导35d后把已经转化成营养芽的部分转入继代培养基中进行增殖培养，仅萌发伸长没有转化成营养芽的部分重新切段转入诱导培养基继续诱导。以35～40d为一个诱导培养周期，转接3次后约95％的花梗芽转化为营养芽，把经过三次诱导所获得的营养芽进行增殖培养。诱导培养基：1/2MS+6-BA2.0mg·L^-1+TDZ1.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1+卡拉胶8.0g·L^-1+蔗糖25g·L^-1，pH为5.6。

继代增殖培养过程中，增殖培养初期25d为一个转接周期，由于原球茎生长对营养的消耗量较大，较短的转接周期利于原球茎保持最好的增殖生长状态，待原球茎增殖生成后45d为一个循环周期继代转接一次，连续转接不超过12代，直至丛生芽生成。以双芽或三芽为单位个体进行转接，四芽以上进行切分，切分时剥除小苗基部的叶片，使基部侧芽裸露出来，利于侧芽的萌发，提高增殖率。继代培养基：MS+6-BA3.0mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+椰子水100mL·L^-1+卡拉胶8.0g·L^-1+蔗糖25g·L^-1，pH为5.6。

将继代增殖所获得的丛生芽转入壮苗培养基中进行壮苗培养，50～60d为一个周期转接一次，待小苗株高达到3.0cm以上时可转入生根培养基进行培养，株高在3.0cm以下的小苗继续进行壮苗培养。壮苗培养：MS+香蕉浆50g·L^-1+卡拉胶8.0g·L^-1+蔗糖25g·L^-1，pH为5.6。

经壮苗培养株高达到3.0cm以上、有5～6片叶的小苗切分成独立的植株，转入生根培养基进行生根培养。12×15cm聚丙烯组培袋每袋放置10株小苗，500mL玻璃瓶每瓶放置25株。经生根培养60d后，具7～9片叶，3～6条根时即可移出培养室进行炼苗移栽。生根培养基：1/2MS+NAA0.5mg·L^-1+香蕉浆50g·L^-1+卡拉胶8.0g·L^-1+蔗糖25g·L^-1，pH为5.6。

对比试验：

从普通文心兰园中选取分别携带CymMV、ORSV及两种病毒复合感染的兰株花梗和本发明无毒母本园中的兰株花梗各10枝为外植体进行组织培养。于炼苗移栽前随机抽取每种组培小苗各100株，用RT-PCR检测小苗带病毒率。结果所有来自无毒母本园的样品均未检测到病毒，而其他样品的带毒率为57～71％，结果详见表1。健化培养240d后随机抽取每种组培小苗各1株，对比它们的生长情况，并拍摄照片如图1。

从表1可以看出，使用本发明生产的文心兰种苗不携带任何病毒，而采用传统方法生产的文心兰种苗的带毒率在57％以上。带毒种苗和无毒种苗在经健化培养240d后在生长势上就表现出了明显的差异，如图1所示，无毒苗的株高、假鳞茎大小、生长势等均明显优于带毒种苗。

表1本发明与传统方法生产的文心兰种苗带毒情况比较

注：CymMV和ORSV复合感染的样品中只要检出病毒(一种或两种)都算检出。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种文心兰无毒种苗生产方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)、无病毒母本园的建设与管理

建设具有遮雨、防虫、遮阳、控温控湿的母本园，温度控制在25～30℃；冬季的阳光直射，夏季遮光率60～70％，其他季节遮光率40％；

从大田采集优良性状或变异单株或引进的目标母本，经检测确定不带有CymMV和ORSV二种病毒后作为繁殖母株保存于母本园中，管理过程中采取隔离、消毒措施，避免目标母本被病毒感染；

2)、文心兰病毒检测

从田间收集或引种具有优良性状的繁殖母株样品，采用双抗体夹心法检测CymMV和ORSV；

采用反转录聚合酶链式反应检测技术检测组培母瓶的带毒情况，两种病毒的检测结果均为阴性的组培瓶进入下一步扩繁操作，任一病毒检测结果出现阳性均淘汰。

3)、花梗芽组培快繁

在母本园中选取花梗清洗后消毒，选择带有休眠芽的花梗，以休眠芽为中心点上下各2.0～2.5cm处切成长4.0～5.0cm的小段，剥去休眠芽上的苞片，露出花芽，消毒后晾干备用；

将带有休眠芽的花梗小段放入诱导培养基中培养，诱导培养35～40d后把已经转化成营养芽的小段转入继代培养基中进行增殖培养；所述诱导培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加6-BA2.0mg·L^-1、TDZ1.0mg·L^-1、NAA0.2mg·L^-1、卡拉胶8.0g·L^-1、蔗糖25g·L^-1，pH为5.6；所述继代培养基是以MS为基本培养基，并添加6-BA3.0mg·L^-1、NAA0.3mg·L^-1、椰子水100mL·L^-1、卡拉胶8.0g·L^-1、蔗糖25g·L^-1，pH为5.6；

继代增殖培养过程中，增殖培养初期20～25d为一个转接周期，待原球茎增殖生成后40～45d为一个循环周期继代转接一次，直至丛生芽生成；

将继代增殖所获得的丛生芽转入壮苗培养基中进行壮苗培养，50～60d为一个周期转接一次，待小苗株高达到3.0cm以上时转入生根培养基进行培养，株高在3.0cm以下的小苗继续进行壮苗培养。所述壮苗培养是以MS为基础培养基，并添加香蕉浆50g·L^-1、卡拉胶8.0g·L^-1、蔗糖25g·L^-1，pH为5.6；

经壮苗培养株高达到3.0cm以上、有5～6片叶的小苗切分成独立的植株，转入生根培养基进行生根培养；经生根培养60d后，待小苗长出7～9片叶，3～6条根时即可移出培养室进行炼苗移栽；所述生根培养基是以1/2MS为基础培养基，并添加NAA0.5mg·L^-1、香蕉浆50g·L^-1、卡拉胶8.0g·L^-1、蔗糖25g·L^-1，pH为5.6；

上述培养过程中，培养条件：培养温度为23～27℃，光照强度2000～2500Lux；每天光照时间为10～12小时；

所述香蕉浆是取香蕉果肉打成浆状。