KR20050091335A - 캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법 - Google Patents

캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20050091335A
KR20050091335A KR1020040016722A KR20040016722A KR20050091335A KR 20050091335 A KR20050091335 A KR 20050091335A KR 1020040016722 A KR1020040016722 A KR 1020040016722A KR 20040016722 A KR20040016722 A KR 20040016722A KR 20050091335 A KR20050091335 A KR 20050091335A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
callus
pepper
medium
explants
shoots
Prior art date
Application number
KR1020040016722A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100522437B1 (ko
Inventor
한지학
이윤희
김주연
김효순
정민
최순호
양승균
Original Assignee
주식회사 농우바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 농우바이오 filed Critical 주식회사 농우바이오
Priority to KR10-2004-0016722A priority Critical patent/KR100522437B1/ko
Priority to EP04748401.9A priority patent/EP1722624B1/en
Priority to ES04748401.9T priority patent/ES2522993T3/es
Priority to PCT/KR2004/001686 priority patent/WO2005086993A1/en
Priority to CN2004800424287A priority patent/CN1925740B/zh
Publication of KR20050091335A publication Critical patent/KR20050091335A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100522437B1 publication Critical patent/KR100522437B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 고추 형질전환체의 대량 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 형질전환 효율이 높을 뿐 아니라 계통-비특이적으로 고추를 형질전환할 수 있다. 또한, 형질전환체를 제조하는데 걸리는 시간이 종래 고추 형질전환 방법에 비하여 단축되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 다양한 계통의 고추 형질전환체를 높은 효율로 대량 제조할 수 있다.

Description

캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법{Mass production method for developing pepper transgenic plants by callus induction}
본 발명은 고추 형질전환체의 대량 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
고추는 세계적으로 주요 작물 중 하나로 식품 또는 조미료로 널리 사용되고 있다. 또한, 고추는 산업적 염료에도 사용되는데, 특히 화장품 립스틱의 주원료로 사용된다. 국내에서 고추 산업화 관련 총 매출액은 약 2조원이며, 국내 채소 시장에서 가장 큰 종자시장을 형성하고 있다. 고추는 생명공학과 연결되어 상승효과를 통한 고부가가치를 누릴 수 있는 가장 적합한 작물이다.
고추를 생명공학적으로 이용하기 위한 첫 관문은 형질전환을 하는 것이다. 그러나, 고추는 형질전환이 매우 어려운 작물로 알려져 있다. 고추의 형질전환이 안 되는 이유는 크게 2가지로 고려되어진다. 첫째, 종자 계통에 따라 재분화의 성공률이 확연히 다르다는 것이다(Christopher T et al., Plant Cell Tiss Org. Cult., 46:245-250, 1996; Kim JY et al., J. of Plant Biotechnology, 4:129-134, 2002). 재분화율이 높은 계통들만이 형질전환율이 높으므로, 재분화율이 낮은 계통들을 형질전환하기가 매우 어렵다. 둘째는 작물마다 아그로박테리움의 감염율이 다르다는 것이다. 형질전환이 안 되는 작물들은 아그로박테리움의 필러스(pilus)가 외식체(explant)의 조직세포를 투과하지 못하거나 상기 조직세포에 착지가 잘 안되는 경우일 것으로 사료되고 있다.
지금까지 고추의 형질전환이 성공된 사례는 세계적으로 매우 드물다. 아그로박테리움을 이용한 고추 형질전환 방법은 미국에서 처음으로 발표되었으며(미국특허 제5,262,316호), 국내에서도 손성한 등에 의해 연구된 바 있다(대한민국 등록특허 제34473호). 그러나 상기 방법들은 형질전환율이 매우 낮고 재현성이 없으며 고추 형질전환체의 대량 생산이 어렵다는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 고추 형질전환체를 고효율로 대량 생산하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 고추의 외식체를 캘러스 유도 배지에서 전 배양한 후 아그로박테리움과 공동 배양하여 재분화를 유도하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 고추 형질전환체의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명에 따른 방법은
(a) 고추의 외식체(explant)를 캘러스 유도 배지에 치상하여 전 배양(pre-culture)하는 단계;
(b) 상기 전 배양한 외식체를 아그로박테리움과 공동 배양하는 단계;
(c) 상기 공동 배양한 외식체를 선별 배지에서 배양하여 형성된 캘러스를 선발하는 단계; 및
(d) 상기 캘러스를 절단하고 이를 신초 유도 배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명에서 '외식체(explant)'라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로, 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 방법은 크게 (a) 고추 외식체의 전 배양; (b) 형질전환(아그로박테리움과 공동 배양); (c) 캘러스 선발; 및 (d) 신초 형성이라는 일련의 과정을 포함한다. 이외 뿌리 형성 및 토양 순화 과정을 추가로 더 포함할 수 있다. 특히 본 발명의 방법은 고추 외식체를 캘러스 유도 배지에서 전 배양한 후 형질전환하여 캘러스를 인위적으로 형성시키고, 상기 캘러스로부터 식물체의 재분화를 유도한다는 점에 특징이 있다.
본 발명의 방법을 각 단계별로 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
(a) 캘러스 유도를 위한 외식체의 전 배양
본 발명의 방법은 먼저 고추의 외식체를 캘러스 유도 배지에서 전 배양한다. 이 때 캘러스의 유도를 촉진시키기 위하여 고추의 외식체에 상처를 가하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 방법에 사용되는 고추의 외식체로는 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 고추의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용할 수 있다.
본 발명에서 전 배양시 사용하는 캘러스 유도 배지는 캘러스를 유도하는 식물 호르몬을 포함하는 식물 배양용 배지(예: MS 배지, 1/2 MS 배지)를 말한다. 상기 캘러스를 유도하기 위한 식물 호르몬으로는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid), IAA(indole-3-acetic acid), 제아틴(zeatin), NAA(naphthalene acetic acid) 및 BA(benzylaminopurine)로 이루어진 군에서 선택된 하나를 사용할 수 있다. 각 호르몬의 바람직한 첨가농도는 다음과 같다: 0.01-5 ㎎/ℓ 2,4-D, 0.01-5 ㎎/ℓ IAA, 0.01-5 ㎎/ℓ 제아틴, 0.01-5 ㎎/ℓ NAA, 0.01-5 ㎎/ℓ BA. 가장 바람직하게는 1 ㎎/ℓ 2,4-D 또는 1 ㎎/ℓ IAA를 사용할 수 있다. 또한, 상기 나열된 호르몬을 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 0.1-5 ㎎/ℓ 2,4-D, 0.1-5 ㎎/ℓ IAA 및 0.01-2 ㎎/ℓ NAA로 이루어진 군에서 선택된 하나와 0.01-2 ㎎/ℓ 제아틴을 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 전 배양은 22-28℃에서 20-60시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 이 전 배양 기간 동안 호르몬의 영향으로 외식체의 상처 부위에서 캘러스가 유도된다.
(b) 형질전환(아그로박테리움과 공동 배양)
캘러스 유도 배지에서 전 배양한 외식체를 형질전환하기 위하여 아그로박테리움과 공동 배양한다. 공동 배양 하기 전에 고추에 도입하고자 하는 목적 유전자를 아그로박테리움에 도입하는 것이 필요하다. 아그로박테리움의 형질전환은 당업계에 공지된 방법을 통해 수행할 수 있다. 예를 들면, 동결-해동(freeze-thaw) 방법(Glevin et al., Plant molecular biology. Kluwer academic Publishers A3/7, 1988)을 이용할 수 있다. 이후, 목적 유전자가 도입된 아그로박테리움을 상기 전 배양한 고추의 외식체에 10-20분간 접종한 후 공동 배양한다. 이 때 공동 배양을 위한 배지로는 상기 (a) 단계에서 사용한 캘러스 유도 배지와 동일한 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 공동 배양은 22-28℃에서 40-80시간 동안 하는 것이 바람직하다.
(c) 캘러스 선발
아그로박테리움과 공동 배양한 고추의 외식체를 선별 배지에서 배양하여 형질전환된 캘러스를 선발한다. 이 때 선별 배지는 형질전환체의 선별을 위한 항생제와 캘러스 발달을 유도하기 위한 제아틴과 IAA를 포함하는 것이 바람직하다. IAA 대신 NAA를 사용할 수도 있다. 상기 항생제로는 아그로박테리움에 도입된 재조합 벡터에 존재하는 항생제 저항성 유전자에 해당하는 항생제를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 제아틴은 0.1-5 ㎎/ℓ의 농도로, IAA과 NAA는 0.01-1 ㎎/ℓ의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 2 ㎎/ℓ 제아틴과 0.3 ㎎/ℓ의 IAA을 혼합하여 사용할 수 있다. 아그로박테리움과 공동 배양한 외식체를 선별 배지에서 치상한 후 4-5주가 되면 캘러스가 자라나기 시작한다. 이후, 캘러스는 5-8주 더 배양하는 것이 바람직하다.
(d) 신초 형성
상기 (c) 단계에서 얻은 형질전환된 캘러스를 작은 조각으로 절단한다. 이후 절단한 캘러스를 신초 유도 배지에 치상하여 신초의 형성을 유도한다. 상기 신초 유도 배지는 제아틴을 단독으로 포함하거나, 제아틴과 IAA 또는 제아틴과 NAA의 혼합물을 포함하는 것이 바람직하다. 이 때 제아틴은 0.5-10 ㎎/ℓ의 농도로 사용하는 것이 바람직하며, IAA과 NAA는 0.01-0.2 ㎎/ℓ의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 2 ㎎/ℓ 제아틴과 0.01 ㎎/ℓ의 IAA를 혼합하여 사용할 수 있다. 신초 유도 배지에 치상 후 한 달이 지나면 신초가 형성된다. 이후, 신초를 신장시키기 위해 동일한 배지에서 약 두 달 정도 더 배양하는 것이 바람직하다.
(e) 뿌리 유도 및 토양 순화
신장된 신초를 뿌리 유도 배지에 치상하여 배양한다. 상기 뿌리 유도 배지는 식물 호르몬이 첨가되지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는 소량의 항생제를 포함하는 MS 기본 배지를 사용할 수 있다. 뿌리 유도 배지에 치상한 지 약 4-5주후면 뿌리가 형성된다. 이후, 뿌리가 약 4 -10 cm 정도 자라면 배지를 깨끗이 제거하고 화분으로 옮겨 심는다.
본 발명의 고추 형질전환 방법은 다음과 같은 장점이 있다.
첫째, 종래의 아그로박테리움 매개 형질전환 방법에 따라 고추의 외식체에서 직접적으로 신초를 유도하는 것은 형질전환이 거의 안 되는 반면, 본 발명의 방법에 따라 형질전환된 캘러스로부터 신초를 유도하는 것은 형질전환율이 현저히 높다.
둘째, 본 발명의 방법은 고추의 특정 계통에 한정되지 않는다(계통 비특이적). 따라서, 다양한 계통의 고추를 안정적으로 형질전환시킬 수 있다.
셋째, 본 발명의 방법은 외식체의 전 배양시에 캘러스 유도 호르몬을 첨가하여 배양하기 때문에 캘러스 유도에 소요되는 시간이 단축되어 종래 방법에 비해 단 시간내에 대량으로 형질전환체를 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법으로 각종 유용 유전자, 예컨대 식물 방어 기작 관련 유전자 또는 유용 대사산물의 생합성에 관여하는 유전자를 고추에 도입하여 각종 기능성 고추 형질전환체를 높은 효율로 대량 생산할 수 있다.
상기에서, 식물 방어 기작 관련 유전자는, 이에 제한되는 것은 아니나, 리보좀 불활성화 단백질(ribosome inactivating protein; RIP), 자스몬산 메칠화효소(jasmonic acid carboxyl methyltransferase), 트레할로스 생합성효소(trehalose synthase), 식물 디펜신 1.2(plant defensin 1.2), 티오닌 합성효소(thionine synthase), 글루카나제(glucanase), 키티나제 (chitinase), 페닐알라닌 암모니아 분해효소(phenylalanine ammonia lyase), 찰콘 합성효소(chalcone synthase), 글루타치온 전이효소(glutathione-S-transferase), 안쓰라니레이트 합성효소(anthranilate synthase), 저장 단백질(storage protein), 칼모듈린(calmodulin), 트립토판 합성효소(tryptophan synthase), 단백질 분해 억제자 Ⅱ(proteinase inhibitor Ⅱ), NO 합성효소(nitric oxide synthase), 시스테민(cystemine), 지방산 과산화효소(fatty acid peroxidase), 산화알렌 합성효소(allene oxide synthetase), PPI1(pepper-PMMV interaction 1 transcrition factor), WRKY 도메인 전사 조절 인자(WRKY domain transcription factor), PR 단백질(pathogen-responsive protein) 등의 유전자와 바이러스 외피 단백질 코딩 유전자를 포함한다. 상기 바이러스 외피 단백질 코딩 유전자의 예로는 TMV-CP, CMV-CP 및 PepMoV-CP 유전자를 들 수 있다. 또한, 유용 대사산물 생합성에 관여하는 유전자는, 이에 제한되는 것은 아니나, 타닌(tannin), 시나핀(sinapine), 사포닌(saponin), 알리신(allicin), 스피노신(spinosin), 신나믹산(cinnamic acid), 플라보노이드(flavonoid), 터페노이드(terpenoid), 카테킨(catechin), 비타민(vitamin), 페니실린(penicilline), 인돌(indole), 인슐린(insulin), 프로스타그란딘(prostaglandin), 텍솔(taxol), 알리솔(alisol), 리신(ricin), 카르테노이드 (cartenoid) 및 캡사이신 (capsisin)의 생합성에 관련된 유전자를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 모든 캡시쿰 속(Capsicum spp.)의 고추에 적용될 수 있다. 바람직하게는 캡시쿰 안누움(Capsicum annuum L.)일 수 있다. 그 예로는 칠리고추(chilli pepper, Capsicum annuum L. var.acuminatum), 단고추(sweet or bell pepper, Capsicum annuum L. var. grossum), 콘고추(cone pepper, Capsicum annuum L. var. conoides), 체리고추(cherry pepper, Capsicum annuum L. var. cerasiforme), 레드클러스터고추(red cluster pepper, Capsicum annuum L. var. fasciculatum) 및 긴고추(long pepper, Capsicum annuum L. var. longum)가 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 제아틴과 NAA 또는 제아틴과 IAA를 함유하는 배지에서 고추의 외식체를 전 배양한 후, 아그로박테리움으로 형질전환하였다. 이후, 고추의 재분화 과정에서 형질전환된 외식체의 상처부위로부터 신초가 직접적으로 형성되는 일반적인 경우(직접적인 신초 형성)와는 달리 상처부위에서 캘러스가 유도되고 이로부터 신초가 형성되는 경우(간접적인 신초 형성; 캘러스-매개 신초 형성(callus-mediated shoot formation))가 있음을 관찰하였다(도 1 및 도 2 참조). 상기 두 경우의 형질전환율을 조사한 결과, 직접적인 신초 형성은 그 빈도는 높으나, 신초로부터 뿌리가 유도되는 빈도가 낮을 뿐 아니라 형질전환된 개체가 하나도 없는 것으로 나타났다(표 1 및 표 3 참조). 반면, 캘러스를 통한 간접적인 신초 형성의 경우에는 외식체의 상처부위로부터 캘러스가 유도되는 빈도는 매우 드물었으나, 유도된 캘러스로부터 신초가 형성되고, 이로부터 뿌리가 유도되는 빈도는 높았다(표 2 참조). 또한, 캘러스로부터 형성된 신초의 형질전환율을 조사한 결과, P915 계통 고추의 경우에는 0.19%이었으며, P409 계통의 경우에는 0.03%(3/37,500)이었다(표 4 참조). 이로부터 본 발명자들은 고추의 형질전환에 있어서 형질전환된 캘러스로부터 신초가 형성되는 경우에는 형질전환 효율이 높다는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 본 발명에서 처음으로 규명한 것이다.
본 발명의 다른 실시예에서는 고추의 외식체로부터 더 효율적으로 캘러스를 유도하기 위하여 고추의 외식체를 다양한 식물 호르몬을 함유하는 배지에서 전 배양한 후, 아그로박테리움과 공동 배양하였다. 이 때 상기 식물 호르몬으로는 2,4-D, IAA 및 2,4-D와 제아틴의 혼합물을 각각 사용하였다. 이후, 형질전환된 외식체를 선별 배지에서 배양하여 형질전환된 캘러스를 선발하였다(도 3 및 도 4 참조). 캘러스를 작은 조각으로 절단한 후, 신초 유도 배지에 치상하여 신초를 형성시켰다(도 5 참조). 이후 신초로부터 뿌리를 유도한 후 순화과정을 거쳐 완전한 식물체로 재분화시켰다(도 6 참조).
고추의 외식체를 2,4-D, IAA 및 2,4-D와 제아틴의 혼합물을 각각 함유하는 배지에서 전 배양한 경우의 캘러스 유도율을 조사한 결과, 고추 계통 별로 약간의 차이가 나기는 하지만 전체적으로 약 13%의 비율로 캘러스가 유도되었다(표 6 참조). 이는 제아틴과 NAA(또는 IAA)를 함유하는 배지에서 전 배양한 경우의 캘러스 유도율(0.19%)에 비해 약 10배 이상 높은 수치이다. 또한, 형질전환에 사용된 전체 외식체의 수를 기준으로 캘러스로부터 형성된 신초의 형질전환율을 조사한 결과 약 1%이었다(표 7 참조). 이는 제아틴과 NAA(또는 IAA)를 함유하는 배지에서 전 배양한 경우의 캘러스-매개 신초 형질전환율(0.19%)보다 약 5배 정도 높은 수치이다. 또한, 2,4-D, IAA 및 2,4-D와 제아틴의 혼합물을 각각 함유하는 배지에서 전 배양한 경우에는 실험에 사용된 8계통의 고추가 모두 안정적으로 형질전환됨을 확인하였다(표 6 및 도 7 내지 도 9 참조). 이와 같은 본 발명의 방법은 고추의 외식체를 캘러스 유도 배지에서 전 배양함으로써 종래 알려진 형질전환 방법에 비해 시간을 단축시킬 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
캘러스 유도 신초 형성을 통한 고추의 형질전환 1
<1-1> 외식체의 준비 및 전 배양
4종의 근교 계통(inbred line) - P915, P409, P410 및 P101 - 의 칠리고추 종자((주)농우바이오)들을 실험에 사용하였다. 종자들의 표면을 95% 에탄올로 30초 동안 소독한 후, 다시 50% 표백제(유한락스)로 10분 동안 소독하였다. 이후, 멸균수로 3회 세척하였다. 멸균된 종자들을 1/2 MS 배지(1/2 MS, 1.5% sucrose, 0.8% agar, pH 5.8)에 치상한 후, 25℃의 광 조건 하에서 발아시켰다. 이후, 8-10일령의 식물체로부터 자엽과 하배축을 절제하고 이를 외식체로 사용하였다. 약 190,000개의 외식체들을 칼로 상처낸 후, 전 배양 배지(pre-culture medium)(2 ㎎/ℓ 제아틴과 0.05 ㎎/ℓ NAA(또는 0.1 ㎎/ℓ IAA)를 포함하는 MS 기본 배지)에 치상하여 2-36시간 동안 22-28℃의 광 조건에서 배양하였다.
<1-2> 아그로박테리움과 공동 배양
TMV-CP 유전자(GenBank accession No.: L35074; Park et al., 1997) 또는 PPI1 유전자(GenBank accession No.: AF430372; Lee et al., 2002)를 코딩하는 DNA 단편을 pCAMBIA 2300 벡터에 삽입하였다. 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였다. 형질전환된 아그로박테리움을 50 ㎎/ℓ 카나마이신(kanamycin), 50 ㎎/ℓ 리팜피신(rifampicin) 및 100 μM 아세토시링곤(acetosyringone)을 포함하는 YEP 배지에서 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후, MS 기본 배지로 O.D 600 값이 0.3-0.5가 되도록 희석하였다. 배양 현탁액을 100 μM 아세토시링곤을 포함하는 MS 액체 배지와 혼합한 후, 이를 상기 실시예 <1-1>에서 전 배양한 외식체에 10-20분 동안 접종하였다. 이후, 상기 실시예 <1-1>에서 사용한 전 배양 배지와 동일한 조성의 배지에서 38-96시간 동안 암 조건에서 공동 배양하였다. 아그로박테리움과 공동 배양한 외식체를 500-800 ㎎/ℓ 세포탁심(cefotaxime) 또는 릴라실린(lilacilline)을 포함하는 1/2 MS 액체 배지로 3회 세척하였다.
<1-3> 신초 형성(shoot formation)
형질전환체를 선발하기 위하여 상기 실시예 <1-2>에서 아그로박테리움과 공동 배양한 외식체를 2 ㎎/ℓ 제아틴, 0.05 ㎎/ℓ NAA(또는 0.1 ㎎/ℓ IAA), 80-100 ㎎/ℓ 카나마이신 및 300 ㎎/ℓ 세포탁심(또는 릴라실린)을 포함하는 MS 기본 배지(선별 배지)에서 6-8주 동안 배양하였다. 배양한 지 4-5주 째에 몇몇 외식체에서는 상처 부위 주변에 캘러스와 유사한 조직이 생기는 것을 관찰할 수가 있었다. 이후, 신초를 유도하기 위하여 상기 외식체들을 2 ㎎/ℓ 제아틴, 0.01 ㎎/ℓ NAA(또는 0.01 ㎎/ℓ IAA), 60-100 ㎎/ℓ 카나마이신 및 300 ㎎/ℓ 세포탁심을 포함하는 MS 기본 배지(신장 배지)로 옮겨 7-10주 동안 배양하였다.
<1-4> 뿌리 유도 및 토양 순화
신장된 신초를 20-30 ㎎/ℓ 카나마이신 및 200 ㎎/ℓ 세포탁심을 포함하는 MS 기본 배지(뿌리 유도 배지)에 치상하여 6-8주 동안 배양하였다. 이렇게 재분화된 식물체를 화분(zippy pot soil)으로 옮겨 25℃, 16시간의 광 조건 하에서 2주 동안 배양하였다.
본 발명자들은 상기 실험에서 외식체로부터의 신초 형성에 있어 두 가지 양상이 나타남을 확인할 수 있었다. 하나는 일반적인 양상으로 외식체의 상처 부위로부터 신초(또는 다수 신초)가 직접적으로 형성되는 것이고(직접적인 신초 형성), 다른 하나는 외식체의 상처 부위 주변에 캘러스 조직이 형성된 후 이로부터 신초가 형성되는 것이다(간접적인 신초 형성; 캘러스-매개 신초 형성).
직접적인 신초 형성을 통한 재분화 과정은 대부분의 경우에서 관찰되었으며, 상기 과정은, 도 1에서 보는 바와 같이, 신초 형성, 다수신초, 신장, 단일신초 신장 및 뿌리 형성의 5단계로 관찰되었다. 반면, 캘러스를 통한 간접적인 신초 형성을 통한 재분화 과정은 매우 드물게 관찰되었는데, 이는 자엽의 상처 부위으로부터 캘러스가 자연적으로 유도되는 것이 용이하지 않기 때문이라 사료된다. 간접적인 신초 형성을 통한 재분화 과정은, 도 2에서 보는 바와 같이, 캘러스 형성, 캘러스 발달, 신초 형성, 단일 신초 신장 및 뿌리 형성의 5단계로 관찰되었다.
<시험예 1>
실시예 1의 형질전환 방법의 신초 형성 빈도 조사
<1-1> 직접적인 신초 형성의 빈도
4계통의 고추로부터 얻은 총 151,700개의 외식체를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 형질전환한 후 외식체의 상처 부위로부터 직접적으로 신초가 형성되는 빈도를 조사하였다. 신초 유도 배지(shooting medium) 상에서 직접적으로 신초가 발생하는 빈도는 5.3%(8,089/151,700)이었다(표 1 참조). 그러나 뿌리 유도 배지(rooting medium) 상에서 생존하는 신초의 수는 약 17.4%(1,407/8,089) 이었다. 하기 표 1 및 표 2에 기재된 각 계통의 수치는 사용한 각 호르몬의 결과를 합계한 것이다 .
직접적인 신초 형성의 빈도
유전자 외식체의 수 신초의 수 뿌리를 형성한 신초의 수
P915 P409 P410 P101 P915 P409 P410 P101 P915 P409 P410 P101
TMV-CP 30,512 26,039 24,107 21,983 2,106 1,017 1,697 628 392 156 311 49
PPI1 14,413 14,080 7,488 13,078 1,024 587 720 310 186 103 176 34
소계 44,925 40,119 31,595 35,061 3,130 1,604 2,417 938 578 259 487 83
총계 151,700 8,089 1,407
<1-2> 캘러스를 통한 간접적인 신초 형성의 빈도
4계통의 고추로부터 얻은 총 37,500개의 외식체를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 형질전환한 후 캘러스에 의해 매개되어 신초가 형성되는 빈도를 조사하였다. 외식체로부터 캘러스가 형성되는 빈도는 1.2%(459/37,500)로 매우 낮았다(표 2 참조). 그러나, 캘러스로부터 신초가 발달하는 빈도는 11.6%(53/459)이었으며, 상기 신초로부터 뿌리가 형성되는 빈도는 52.8%(28/53)이었다. 이는 직접적인 신초 형성을 통한 재분화 과정에서 신초 및 뿌리가 형성되는 비율과 비교할 때에 매우 높은 수치이다.
캘러스 발달 및 캘러스로부터 신초의 형성의 빈도
유전자 외식체의 수 형성된 캘러스의 수 캘러스로부터 형성된신초의 수 뿌리를 가진 신초의 수
P915 P409 P410 P101 P915 P409 P410 P101 P915 P409 P410 P101 P915 P409 P410 P101
TMV-CP 5,188 6,917 5,491 7,210 81 30 25 94 14 5 1 7 12 3 0 2
PPI1 2,903 3,056 3,798 2,937 107 46 17 59 15 4 2 5 7 2 1 1
소계 8,091 9,973 9,289 10,147 188 76 42 153 29 9 3 12 19 5 1 3
총계 37,500 459 53 28
상기 결과들로부터 고추 외식체의 재분화시 캘러스가 형성되기만 하면 캘러스로부터 신초와 뿌리가 높은 효율로 형성될 수 있음을 확인할 수 있었다.
<시험예 2>
실시예 1의 형질전환 방법의 효율 조사
상기 실시예 1에서 외식체의 상처 부위로부터 직접적으로 형성된 총 1,407개의 신초 및 캘러스로부터 간접적으로 형성된 총 28개의 신초의 형질전환율을 PCR 분석으로 조사하였다.
먼저 이 등의 방법(Lee et al., Plant Mol. Biol., 46:661-671, 2001)에 따라 고추의 게노믹 DNA를 분리하였다. TMV-CP 유전자의 삽입을 검출하기 위해서는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였으며, PPI1 유전자의 삽입을 검출하기 위해서는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 1분; 55℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 한 사이클로 하여 총 35회 반복 수행하였다.
그 결과, 외식체의 상처 부위로부터 직접적으로 형성된 총 1,407개의 신초 중에는 TMV-CP 유전자 또는 PPI1 유전자가 삽입된 신초가 하나도 없는 것으로 나타났다(표 3 참조). 하기 표 3 및 표 4에서 형질전환 효율은 PCR에서 양성으로 나타난 신초의 수를 사용된 외식체의 수로 나눈 값이다.
외식체의 상처 부위로부터 직접적으로 형성된 신초의 형질전환율
유전자 PCR 분석에서 양성으로 나타난 신초의 수
P915 P409 P410 P101
TMV-CP 0 0 0 0
PPI1 0 0 0 0
총계 0 0 0 0
형질전환 효율 0% 0% 0% 0%
반면, 캘러스로부터 간접적으로 형성된 신초의 형질전환율을 조사한 결과, P915 계통의 경우에는 0.19%(15/37,500)이었으며, P409 계통의 경우에는 0.03%(3/37,500)이었다(표 4 참조). 캘러스로부터 형성된 신초의 수에 대한 PCR에서 양성으로 나타난 신초의 수의 비율은 34%(18/53)이었다.
캘러스로부터 간접적으로 형성된 신초의 형질전환율
유전자 PCR 분석에서 양성으로 나타난 신초의 수
P915 P409 P410 P101
TMV-CP 10 2 0 0
PPI1 5 1 0 0
총계 15 3 0 0
형질전환 효율 0.19% 0.03% 0% 0%
상기 결과로부터 형질전환 후 캘러스로부터 신초가 형성되는 경우에는 형질전환될 가능성이 높다는 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 3>
실시예 1에서 얻은 형질전환 식물체의 TMV 저항성 조사
상기 실시예 1에서 캘러스에 의한 간접적인 신초 형성을 통하여 TMV-CP 유전자를 도입시킨 고추 형질전환체가 TMV에 대하여 저항성을 나타내는지를 조사하였다. T0 식물체를 자가교배하여 T1 식물체를 얻었다. 408 개체의 T1 식물체의 잎에 2주 간격으로 2회 TMV를 접종하였다. 두 번째 접종한 후 2주가 되었을 때 TMV-CP 항체를 이용하여 ELISA를 수행하였다(Shin R. et al., Mol. Plant Microbe. Interact., 15:983-989, 2002). 그 결과, 총 408 개체의 T1 식물체 중에서 28 개체가 TMV 감염에 대해 저항성인 것으로 나타났다(표 5 참조). 이병성 식물체에서는 잎에서 모자이크 반점이 관찰된 반면, 저항성 식물체에서는 관찰되지 않았다.
또한, 상기 시험예 2와 동일한 방법에 따라 식물체의 잎으로부터 분리한 게노믹 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과, 28 개체의 저항성 식물체에서는 TMV-CP 유전자가 모두 삽입되어 있는 것으로 확인되었다(결과 미도시).
TMV 저항성 조사
실험대상 식물체의 수 이병성 식물체의 수 저항성 식물체의 수
T1 408 380 28
비형질전환체 66 66 0
<실시예 2>
캘러스 유도를 통한 고추의 형질전환 2
<2-1> 외식체의 준비 및 전 배양
본 발명자들은 고추의 외식체로부터 캘러스를 보다 높은 수준으로 유도하기 위한 최적의 조건을 찾기 위하여 다양한 식물 호르몬을 함유하는 배지에서 외식체를 전 배양하였다.
먼저, 총 8종의 근교 계통 - P915, P318, P319, P409, P410, P784, P2377 및 PMAL - 의 칠리고추 종자((주)농우바이오)의 표면을 95% 에탄올로 30초 동안 소독한 후, 다시 50% 유한락스로 10분 동안 소독하였다. 이후, 멸균수로 3회 세척하였다. 멸균된 종자들을 1/2 MS 배지(1/2 MS+1.5% sucrose+0.8% agar, pH 5.8)에 치상한 후, 25℃의 광 조건에서 발아시켰다. 이후, 8-10일경의 식물체로부터 자엽을 절제하였다. 자엽을 칼로 상처낸 후, 이를 다양한 조합의 식물 호르몬을 함유하는 캘러스 유도 배지(1 ㎎/ℓ 2,4-D, 1 ㎎/ℓ IAA 또는 1 ㎎/ℓ 2,4-D와 0.2 ㎎/ℓ 제아틴을 함유하는 MS 기본 배지)에 치상하여 전 배양하였다. 배양은 광조건에서 22-28℃을 유지하는 배양기에서 20-60시간 동안 수행하였다.
<2-2> 아그로박테리움과 공동 배양
GFP 유전자(GenBank accession No.: AY508125; (Haseloff J, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. Mar 18;94(6):2122-2127, 1997)를 pCAMBIA 2300 벡터에 삽입하였다. 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였다. 형질전환된 아그로박테리움을 50 ㎎/ℓ 카나마이신, 50 ㎎/ℓ 리팜피신 및 100 μM 아세토시링곤을 포함하는 YEP 배지에서 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후, MS 기본 배지로 O.D 600 값이 0.3-0.6이 되도록 희석하였다. 배양 현탁액을 100 μM 아세토시링곤을 포함하는 MS 액체 배지와 혼합한 후, 이를 상기 실시예 <2-1>에서 전 배양한 자엽에 20분 동안 접종하였다. 이후, 상기 실시예 <2-1>에서 사용한 전 배양 배지와 동일한 조성의 배지에서 48-70시간 동안 암 조건에서 공동 배양하였다. 아그로박테리움과 공동 배양한 자엽을 500-800 ㎎/ℓ 세포탁심(cefotaxime)을 포함하는 1/2 MS 액체 배지로 3회 세척하였다.
<2-3> 캘러스 선발
형질전환체를 선발하기 위하여 상기 실시예 <2-2>에서 아그로박테리움과 공동 배양한 자엽을 2 ㎎/ℓ 제아틴, 0.3 ㎎/ℓ IAA, 80 ㎎/ℓ 카나마이신, 100 ㎎/ℓ 세포탁심 및 300 ㎎/ℓ 릴라실린(lilacilline)을 포함하는 MS 기본 배지(선별 배지)에 치상하여 배양기(16시간 광:8시간 암)에서 4-5주 동안 배양하였다. 이 배양 과정에서 캘러스가 자라나기 시작하였다. 도 3은 선별 배지에서 치상한 후 2주 동안 성장한 캘러스의 사진을 나타낸 것이다. 캘러스는 이후 5-8주 동안 더 배양하였다. 형질전환된 캘러스의 배양시간에 따른 성장 모습을 UV 하에서 현미경으로 관찰한 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4에서 보는 바와 같이, GFP를 발현하는 형질전환체는 성장하면서 계속적으로 GFP의 발현을 보여주고 있어 유전적 안정성이 있음을 확인할 수 있었다.
<2-4> 신초 형성
성장한 캘러스를 작은 조각으로 자른 후 2 ㎎/ℓ 제아틴, 0.01 ㎎/ℓ IAA, 30-60 ㎎/ℓ 카나마이신 및 300 ㎎/ℓ 세포탁심을 포함하는 MS 기본 배지(신초 유도 배지)에 치상하여 약 한 달간 배양하였다. 이후 형성된 신초를 신장시키기 위해 약 2달간 더 배양하였다. 형질전환된 캘러스로부터 신초가 형성되는 과정을 도 5에 나타내었다.
<2-5> 뿌리 유도 및 토양 순화
신초로부터 뿌리를 유도하기 위하여 신초를 20-30 ㎎/ℓ 카나마이신 및 200 ㎎/ℓ 세포탁심을 포함하는 MS 기본 배지에서 배양하였다. 약 4-5후에 상기 신초로부터 뿌리가 형성되었다. 뿌리가 약 10cm 정도 성장했을 때 배지를 제거하고 화분(zippy pot)에 옮겨 심었다. 며칠 동안은 배양기에서 배양한 후, 온실로 옮겨 배양하였다. 화분으로 옮겨 심은 후 1개월된 형질전환 고추 식물체의 모습을 도 6에 나타내었다.
<시험예 4>
실시예 2에서 얻은 형질전환체의 검증(PCR 분석)
상기 실시예 2에서 얻는 형질전환체 중 UV 하에서 GFP를 발현하는 캘러스와 GFP를 발현하지 않는 캘러스에서 게노믹 DNA를 각각 추출하였다. 이후, 추출된 DNA를 주형으로 하고 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 60℃에서 1분; 94℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 한 사이클로 하여 총 35회 반복수행하였다. 그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, GFP를 발현하는 캘러스에서만 GFP 유전자에 해당하는 약 720bp 크기의 밴드가 검출되었다.
또한, GFP를 발현하는 캘러스로부터 재분화된 여러 계통의 어린 식물의 잎으로부터 추출한 게노믹 DNA를 대상으로 상기와 동일한 방법대로 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, P410, P915, P318 및 P319 계통에 모두 GFP 유전자가 안정하게 도입되었음을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 따른 형질전환 방법이 계통 특이적이지 않음을 나타낸다.
<시험예 5>
실시예 2에서 얻은 형질전환체에 도입된 GFP 유전자의 카피수 확인(서던 블럿)
상기 실시예 2에서 얻은 고추 형질전환 식물체(T0) 14 개체에서 게노믹 DNA를 추출하여 서던 블럿을 수행함으로써 삽입된 GFP 유전자의 카피(copy)수를 조사하였다.
각 게노믹 DNA 30 ㎍을 BamHⅠ과 XbaⅠ으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔 상에서 20V로 20시간 동안 전기영동하였다. 이후, DNA를 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후, 32P-dCTP로 라벨링한 GFP 유전자를 첨가하여 65℃에서 16시간 동안 혼성화시켰다. 그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이, 14 개체 중 4 개체는 GFP 유전자가 게놈 상에 2 카피 존재하고 나머지 개체들은 1 카피가 존재하는 것으로 사료된다. 또한, 각 형질전환체의 밴드 위치가 다른 것으로 미루어 볼 때 각 형질전환체들은 캘러스 오리진(callus origin)이 서로 다른 것을 알 수 있었다.
<시험예 6>
실시예 2의 형질전환 방법의 효율 조사
<6-1> 캘러스 유도율 조사
총 8계통의 고추를 이용하여 상기 실시예 2의 방법으로 캘러스 유도를 시도한 결과, 각 계통마다 차이가 나기는 하지만 전체적으로 약 13%의 비율로 모든 계통에서 캘러스가 유도됨을 확인하였다(표 6 참조). 특히 2,4-D와 IAA를 단독으로 처리한 경우가 2,4-D과 제아틴을 혼합처리한 경우보다 더 높은 캘러스 유도율을 보였다(결과 미도시). 또한, 상기 실시예 2의 캘러스 유도율은 상기 실시예 1의 캘러스 유도율(1.2%; 표 2 참조)과 비교할 때 약 10배 이상 높은 수치이다.
또한, 현미경 하에서 GFP를 발현하는 캘러스는 형질전환에 사용된 전체 외식체를 기준으로 4.7%이었으며, 외식체로부터 유도된 총 캘러스를 기준으로 약 36.1%(233/645)이었다(표 6 참조). 이로부터 외식체로부터 캘러스가 유도되기만 하면 형질전환율이 매우 높다는 것을 다시 확인할 수 있었다. 하기 표 6에 기재된 각 계통의 수치는 전 배양시 사용한 각 호르몬의 결과를 합계한 것이다.
캘러스 유도율 및 GFP 발현에 따른 형질전환율
계통(유전형) 외식체(자엽)의 수 유도된 캘러스의 수(%) GFP를 발현하는 캘러스의 수(%)
P915 1343 202(15.0) 68(5.1)
P318 853 27(3.2) 9(1.1)
P319 596 186(31.2) 82(13.8)
P409 933 77(8.3) 27(2.9)
P410 402 76(18.9) 19(4.7)
P784 56 5(8.9) 2(3.6)
P2377 312 43(13.8) 22(7.1)
PMAL 415 29(7.0) 4(1.0)
총계 4910 645(13.1) 233(4.7)
<6-2> 캘러스로부터의 신초 형성율 및 형질전환율 조사
아그로박테리움과의 공동 배양 후 약 5개월 동안 외식체로부터 유도된 캘러스로부터 신초가 형성되는 빈도를 조사한 결과, 37.7%이었다(표 7 참조). 캘러스로부터 형성된 신초를 대상으로 PCR 분석을 통하여 GFP 유전자의 도입율을 조사하였다. 그 결과, 캘러스로부터 형성된 신초에서 GFP 유전자가 삽입된 비율이 45%이었다(표 7 참조). GFP 유전자의 고추 형질전환율은 실험에 사용된 전체 외식체 수를 기준으로 하여 약 1%(27/2792)인 것으로 조사되었다. 이는 상기 실시예 1의 형질전환율(0.19%)보다 약 5배 이상 높은 수치이다(표 4 참조).
캘러스로부터의 신초 형성율 및 형질전환율
계통(유전형) 캘러스로부터 형성된 신초의 수 PCR 분석에서 양성반응을 보인 신초의 수
P915 12/68 2
P318 8/9 4
P319 40/82 21
총계 60/159 (37.7%) 27/60(45.0%)
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 고추 외식체를 캘러스 유도 배지에서 전 배양한 후 형질전환하여 캘러스를 인위적으로 형성시키고, 상기 캘러스로부터 식물체의 재분화를 유도하였다. 본 발명에 따른 방법은 형질전환 효율이 매우 높을 뿐 아니라 계통-비특이적으로 고추를 형질전환할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 고추 형질전환체를 제조하는데 걸리는 시간을 종래 방법에 비하여 단축시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 다양한 계통의 고추 형질전환체를 높은 효율로 대량 제조할 수 있다.
도 1은 직접적인 신초 형성을 통한 재분화 과정을 단계별로 나타낸 사진이다. 빨강색 점선은 다음 단계의 배양을 위해 절단한 부위를 나타낸다.
A: 직접적인 신초 형성 B: 다수 신초 형성
C: 신장 D: 단일 신초 신장
E: 뿌리 형성
도 2는 캘러스에 의해 매개되는 간접적인 신초 형성을 통한 재분화 과정을 단계별로 나타낸 사진이다. 빨강색 점선은 다음 단계의 배양을 위해 절단한 부위를 나타낸다.
A: 캘러스 형성 B: 캘러스 발달
C: 신초 형성 D: 단일 신초 신장
E: 뿌리 형성
도 3은 본 발명에 따라 선별 배지에서 2주 동안 성장한 캘러스(화살표로 표시함)의 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 방법으로 형질전환된 캘러스가 성장하면서 GFP를 계속적으로 발현하는 모습을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 방법으로 형질전환된 캘러스로부터 신초가 형성되는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 뿌리 유도 후 화분으로 옮겨 심은 지 1개월된 본 발명에 따른 고추 형질전환체의 모습을 나타낸 것이다.
도 7은 GFP를 발현하는 캘러스(레인 1-9)와 GFP를 발현하지 않은 캘러스(레인 10-15)로부터 추출한 게노믹 DNA로 PCR을 수행한 결과이다
+: GFP 클론 M: 분자량 마커
도 8은 GFP를 발현하는 캘러스로부터 재분화된 어린 식물체의 잎에서 추출한 게노믹 DNA로 PCR을 수행한 결과이다.
+: GFP 클론 M: 분자량 마커
레인 1-9: P410 계통 레인 10-15: P915 계통
레인 16-21: P318 계통 레인 22-28: P319 계통
-: 비형질전환체
도 9는 본 발명의 방법으로 제조된 고추 형질전환체로부터 얻은 게노믹 DNA를 대상으로 서던 블럿을 실시한 결과이다
레인 1-2: P915 계통 레인 3-6: P318 계통
레인 7-14: P319 계통 레인 15: 비형질전환체
<110> NONG WOO BIO CO. LTD <120> Mass production method for developing pepper transgenic plants by callus induction <130> NP04-0015 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 1 atgacgcaca atcccactat 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 2 cgaacccctg aaaataat 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 3 atgacgcaca atcccactat 20 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 4 gtaccacttg aagaagc 17 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 5 atgacgcaca atcccactat 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 6 catgtggtct ctcttttcgt tgg 23

Claims (12)

  1. (a) 고추의 외식체(explant)를 캘러스 유도 배지에 치상하여 전 배양(pre-culture)하는 단계;
    (b) 상기 전 배양한 외식체를 아그로박테리움과 공동 배양하는 단계;
    (c) 상기 공동 배양한 외식체를 선별 배지에서 배양하여 형성된 캘러스를 선발하는 단계; 및
    (d) 상기 캘러스를 절단하고 이를 신초 유도 배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고추 형질전환체의 대량 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 외식체는 상처를 가한 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 외식체는 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 캘러스 유도 배지는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid), IAA(indole-3-acetic acid), 제아틴(zeatin), NAA(naphthalene acetic acid) 및 BA(benzylaminopurine)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 캘러스 유도 배지는 0.01-5 ㎎/ℓ 2,4-D, 0.01-5 ㎎/ℓ IAA, 0.01-5 ㎎/ℓ 제아틴, 0.01-5 ㎎/ℓ NAA 및 0.01-5 ㎎/ℓ BA로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 배지는 1 ㎎/ℓ 2,4-D 또는 1 ㎎/ℓ IAA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 혼합물은 0.1-5 ㎎/ℓ 2,4-D, 0.1-5 ㎎/ℓ IAA 및 0.01-2 ㎎/ℓ NAA로 이루어진 군에서 선택된 하나와 0.01-2 ㎎/ℓ 제아틴의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 공동 배양은 상기 (a) 단계의 캘러스 유도 배지와 동일한 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 선별 배지는 0.1-5 ㎎/ℓ 제아틴과 0.01-1 ㎎/ℓ IAA의 혼합물 또는 0.1-5 ㎎/ℓ 제아틴과 0.01-1 ㎎/ℓ NAA의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 신초 유도 배지는 0.5-10 ㎎/ℓ 제아틴, 0.5-10 ㎎/ℓ 제아틴과 0.01-0.2 ㎎/ℓ IAA의 혼합물 및 0.5-10 ㎎/ℓ 제아틴과 0.01-0.2 ㎎/ℓ NAA의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 신초를 뿌리 유도 배지에서 배양하여 뿌리를 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고추는 캡시쿰 속(Capsicum spp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
KR10-2004-0016722A 2004-03-12 2004-03-12 캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법 KR100522437B1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2004-0016722A KR100522437B1 (ko) 2004-03-12 2004-03-12 캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법
EP04748401.9A EP1722624B1 (en) 2004-03-12 2004-07-09 Method for preparing transgenic pepper using callus induction
ES04748401.9T ES2522993T3 (es) 2004-03-12 2004-07-09 Método para preparar pimientos transgénicos utilizando la inducción del callo
PCT/KR2004/001686 WO2005086993A1 (en) 2004-03-12 2004-07-09 Method for preparing transgenic pepper using callus induction
CN2004800424287A CN1925740B (zh) 2004-03-12 2004-07-09 利用愈伤组织诱导培育转基因辣椒的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2004-0016722A KR100522437B1 (ko) 2004-03-12 2004-03-12 캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050091335A true KR20050091335A (ko) 2005-09-15
KR100522437B1 KR100522437B1 (ko) 2005-10-19

Family

ID=35064489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2004-0016722A KR100522437B1 (ko) 2004-03-12 2004-03-12 캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1722624B1 (ko)
KR (1) KR100522437B1 (ko)
CN (1) CN1925740B (ko)
ES (1) ES2522993T3 (ko)
WO (1) WO2005086993A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100949345B1 (ko) * 2007-10-25 2010-03-26 경상대학교산학협력단 파프리카의 미세번식 방법
CN110305884A (zh) * 2019-08-05 2019-10-08 云南省烟草农业科学研究院 一种提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1及其克隆方法与应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286526B (zh) * 2011-08-12 2013-01-16 江苏省农业科学院 一种快速获得辣椒转基因植株的方法
CN116656724A (zh) * 2023-07-06 2023-08-29 上海迈其生物科技有限公司 一种的生菜遗传转化方法
CN116724894B (zh) * 2023-08-09 2023-10-20 山东寿光蔬菜种业集团有限公司 一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法
CN117561981A (zh) * 2024-01-17 2024-02-20 浙江大学海南研究院 一种辣椒的愈伤组织再生体系建立方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5262316A (en) * 1991-11-22 1993-11-16 Dna Plant Technology Corporation Genetically transformed pepper plants and methods for their production

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100949345B1 (ko) * 2007-10-25 2010-03-26 경상대학교산학협력단 파프리카의 미세번식 방법
CN110305884A (zh) * 2019-08-05 2019-10-08 云南省烟草农业科学研究院 一种提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1及其克隆方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN1925740A (zh) 2007-03-07
KR100522437B1 (ko) 2005-10-19
CN1925740B (zh) 2010-06-02
ES2522993T3 (es) 2014-11-20
WO2005086993A1 (en) 2005-09-22
EP1722624A1 (en) 2006-11-22
EP1722624B1 (en) 2014-10-15
EP1722624A4 (en) 2007-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7186889B2 (en) Method for genetic transformation of woody trees
KR101348905B1 (ko) 난초류의 종자 형질전환 방법
JPH07509138A (ja) 培養ダイズ細胞のａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の改良法
Akasaka-Kennedy et al. Efficient plant regeneration and Agrobacterium-mediated transformation via somatic embryogenesis in melon (Cucumis melo L.)
AU2001279510A1 (en) Method for genetic transformation of woody trees
Setiari et al. Micropropagation of Dendrobium phalaenopsis orchid through overexpression of embryo gene AtRKD4
Mercuri et al. Modification of plant architecture in Limonium spp. induced by rol genes
Maligeppagol et al. Genetic transformation of chilli (Capsicum annuum L.) with Dreb1A transcription factor known to impart drought tolerance
Tsai et al. Plant regeneration and stable transformation in the floricultural plant Cleome spinosa, a C 3 plant closely related to the C 4 plant C. gynandra
KR20050091335A (ko) 캘러스 유도를 이용한 고추 형질전환체의 대량 생산 방법
KR100804766B1 (ko) Ｃｍｖ 병원형 감염에 내성인 형질전환 고추
KR100402513B1 (ko) 유전자 조작을 통한 식물체의 효과적인 형질전환 방법
KR101239643B1 (ko) 장미 스위트엘로우 체세포배(배발생캘러스 포함)를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법
JP4228044B2 (ja) シバ属植物の再分化植物体及び形質転換植物体
US7026529B2 (en) Methods for Agrobacterium-mediated transformation of dandelion
JP2008259497A (ja) アグロバクテリウムを介したダイズ国内品種の形質転換体作出方法並びに形質転換体当代及び後代の種子を短期間で獲得する方法
JP2001029075A (ja) 単子葉植物の超迅速形質転換法
Moore et al. Agrobacterium-mediated transformation of grapefruit (Citrus paradisi Macf.) with genes from citrus tristeza virus
JP2010227033A (ja) 植物形質転換体の作出方法、及び、植物形質転換体
KR100496029B1 (ko) 들깨 형질전환 방법과 그에 의해 생산된 제초제 저항성들깨
WO2024117677A1 (ko) 가뭄내성 증진을 위한 CaAIBZ1 유전자교정 고추의 제조방법
US20090288231A1 (en) Method for transforming plant of the family araceae
KR101174491B1 (ko) 아그로박테리움을 이용한 배추의 형질전환 효율을 증가시키는 방법
KR101198648B1 (ko) 직접 신초 유도를 통한 오이 계통의 형질전환 방법 및 상기방법에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체
KR100496028B1 (ko) 제초제 저항성 고추 식물체의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120927

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131014

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140917

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150916

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160913

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170912

Year of fee payment: 13

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180911

Year of fee payment: 14

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190926

Year of fee payment: 15