CN111820128A - 一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法，涉及遗传转化技术领域。本发明所述建立方法，包括以下步骤：将金钗石斛无菌苗接种到诱导培养基上，得愈伤组织；将所述愈伤组织接种于继代培养基上，得继代愈伤组织；将目的基因转入所述继代愈伤组织中，得侵染愈伤组织；将所述侵染愈伤组织接种于1/2MS的平板培养基上；将经过所述共培养的侵染愈伤组织接种于分化培养基上，得丛生芽；将所述丛生芽接种于壮芽培养基上，得壮芽；将所述壮芽接种于生根和壮苗共培养基上，得转基因金钗石斛。本发明所述体系基于组培快繁体系建立，为利用分子生物学手段对金钗石斛观赏性状和药用特性进行遗传改良奠定了技术基础。

Description

一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法
技术领域
本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法。
背景技术
金钗石斛兰科石斛属又名万丈须、金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草等，为多年生草本，因形像古代头上的发钗而得名。金钗石斛茎丛生，上部稍扁而稍弯曲上升，高10～60cm，粗达1.4cm。总状花序从老茎中部以上部分发出，花大，白色带淡紫色先端，有时全体淡紫红色或除唇盘上具1个紫红色斑块外，其余均为白色；花型奇特，灰色淡雅，是优良的观赏植物种类。
金钗石斛为2015年版《中国药典》药材石斛的正品之一。性寒，味苦、淡、苦；入胃、肾经。石斛作为药用最早见载于《神农本草经》，距今有2000多年的历史。距今约1700年，在公元220～450年出版的《名医别录》中也有着对石斛药用的记载，可见其应用历史非常的悠久。
但无论作为观赏植物还是作为药用植物，目前，我国对金钗石斛种质资源的应用仍仅限于对野生资源的引种、驯化和栽培。对其观赏性状或药用成分及含量的改良仍处于探索阶段，尤其未见利用分子生物学手段对其进行遗传改良的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法，基于再生体系建立，为利用分子生物学手段对金钗石斛观赏性状和药用特性进行遗传改良奠定了技术基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种金钗石斛的转基因方法，包括以下步骤：(1)将金钗石斛无菌苗接种到诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖25～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 1.3～1.5mg/L和NAA 0.15～0.25mg/L；
(2)将步骤1)得到的所述愈伤组织接种于继代培养基上进行继代培养，得继代愈伤组织；所述继代培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L和NAA 0.05～0.15mg/L；
(3)将目的基因转入步骤2)得到的所述继代愈伤组织中，得侵染愈伤组织；
(4)将步骤3)得到的所述侵染愈伤组织接种于1/2MS的固体培养基上进行共培养；
(5)将经过步骤4)所述共培养的侵染愈伤组织接种于分化培养基上进行分化培养，得丛生芽；所述分化培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L、NAA 0.05～0.15mg/L、多壁碳纳米管0.8～1.5mg/L和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；所述分化培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为10～15d；所述光照培养的时间为20～25d，所述光照培养的光照度为100～300μmol·m-2·s-1，所述光照培养的光照时间为12～16h/d；
(6)将步骤5)得到的所述丛生芽接种于壮芽培养基上进行壮芽培养，得壮芽；所述壮芽培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.3～0.8mg/L、0.1mg/L NAA和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；
(7)将所述壮芽接种于生根和壮苗共培养基上进行生根和壮苗共培养，得转基因金钗石斛；所述生根和壮苗共培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L琼脂6～9g/L、6-BA 1.5～3mg/L、NAA 0.1～0.4mg/L和IBA 1.4～2.5mg/L。
优选的，步骤(1)所述诱导培养的培养温度为25±1℃，所述诱导培养的光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为14～20h/d。
优选的，步骤(2)所述继代培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±1℃。
优选的，步骤(3)所述目的基因转入采用农杆菌介导的方法。
优选的，步骤(4)所述共培养为暗培养，所述共培养的时间为65～80h。
优选的，步骤(6)所述壮芽培养的培养温度为25±1℃，所述壮芽培养的光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为14～20h/d。
优选的，步骤(7)所述生根和壮苗共培养的培养温度为25±1℃，所述壮芽培养的光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为14～20h/d。
优选的，步骤(7)得到所述转基因金钗石斛后，还包括转基因植株的鉴定。
优选的，所述鉴定为自主显色法。
优选的，所述染色鉴定时，愈伤组织分化出的芽发育成为分化出黄色植株即表明目的基因成功整合到植物基因组中。
本发明提供了一种金钗石斛的转基因方法，包括以下步骤：(1)将金钗石斛无菌苗接种到诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；(2)将所述愈伤组织接种于继代培养基上进行继代培养，得继代愈伤组织；(3)将GUS基因转入所述继代愈伤组织中，得侵染愈伤组织；(4)将所述侵染愈伤组织接种于1/2MS的平板培养基上进行共培养；(5)将经过所述共培养的侵染愈伤组织接种于分化培养基上进行分化培养，得丛生芽；(6)将所述丛生芽接种于壮芽培养基上进行壮芽培养，得壮芽；(7)将所述壮芽接种于生根和壮苗共培养基上进行生根和壮苗共培养，获得转基因金钗石斛。本发明所述建立方法，是基于金钗石斛的再生体系，建立的金钗石斛遗传转化体系，为从分子生物学水平对金钗石斛进行遗传改良奠定技术基础。
具体实施方式
本发明提供了一种金钗石斛的转基因方法，包括以下步骤：(1)将金钗石斛无菌苗接种到诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖25～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 1.3～1.5mg/L和NAA 0.15～0.25mg/L；
(2)将步骤1)得到的所述愈伤组织接种于继代培养基上进行继代培养，得继代愈伤组织；所述继代培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L和NAA 0.05～0.15mg/L；
(3)将目的基因转入步骤2)得到的所述继代愈伤组织中，得侵染愈伤组织；
(4)将步骤3)得到的所述侵染愈伤组织接种于1/2MS的固体培养基上进行共培养；
(5)将经过步骤4)所述共培养的侵染愈伤组织接种于分化培养基上进行分化培养，得丛生芽；所述分化培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L、NAA 0.05～0.15mg/L、多壁碳纳米管0.8～1.5mg/L和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；所述分化培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为10～15d；所述光照培养的时间为20～25d，所述光照培养的光照度为100～300μmol·m-2·s-1，所述光照培养的光照时间为12～16h/d；
(6)将步骤5)得到的所述丛生芽接种于壮芽培养基上进行壮芽培养，得壮芽；所述壮芽培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.3～0.8mg/L、0.1mg/L NAA和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；
(7)将所述壮芽接种于生根和壮苗共培养基上进行生根和壮苗共培养，得转基因金钗石斛；所述生根和壮苗共培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L琼脂6～9g/L、6-BA 1.5～3mg/L、NAA 0.1～0.4mg/L和IBA 1.4～2.5mg/L。
在本发明所述建立方法中，将金钗石斛无菌苗接种到诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖25～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 1.3～1.5mg/L和NAA 0.15～0.25mg/L。本发明对所述金钗石斛无菌苗的来源没有特殊限定，利用本领域的常规市售无菌苗即可。本发明所述诱导培养基中包括蔗糖，所述蔗糖的浓度优选为25～34g/L，更优选为28～32g/L，最优选为30g/L。
本发明所述诱导培养基中包括琼脂，所述琼脂的浓度优选为6.5～8.5g/L，更优选为7～8g/L，最优选为7.5g/L。
本发明所述诱导培养基中包括6-BA，所述6-BA的浓度为1.3～1.5mg/L，优选为1.4mg/L。本发明所述6-BA可发挥诱导愈伤组织的形成的作用。
本发明所述诱导培养基中包括NAA，所述NAA的浓度为0.15-0.25mg/L，优选为0.2mg/L。本发明所述NAA可发挥促进愈伤组织增殖的作用。本发明对所述诱导培养基中各成分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。
本发明在所述诱导培养基上对所述金钗石斛无菌苗进行诱导培养，所述诱导培养的温度优选为25±1℃。本发明所述诱导培养的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200～280μmol·m-2·s-1，最优选为250μmol·m-2·s-1。本发明所述诱导培养的光照时间优选为14～20h/d，更优选为15～18h/d，最优选为16h/d。在本发明中，经所述诱导培养基诱导培养3周后，假根的周围出现绿色的突起，此为愈伤组织的萌动，4周后可见绿色的突起膨大形成绿色的愈伤组织。
得愈伤组织后，本发明将所述愈伤组织接种于继代培养基上进行继代培养，得继代愈伤组织；所述继代培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L和NAA 0.05～0.15mg/L。本发明所述继代培养基包含蔗糖，所述蔗糖的浓度优选为25～34g/L，更优选为28～32g/L，最优选为30g/L。
本发明所述继代培养基中包括琼脂，所述琼脂的浓度优选为6.5～8.5g/L，更优选为7～8g/L，最优选为7.5g/L。
本发明所述继代培养基中包括6-BA，所述6-BA的浓度优选为0.8～1.2mg/L，更优选为1.0mg/L。本发明所述6-BA可促进愈伤组织分化。
本发明所述继代培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为0.06～0.13mg/L，更优选为0.08～0.12mg/L，最优选为0.1mg/L。本发明所述NAA可发挥促进愈伤组织分化的作用。本发明对所述继代培养基中各成分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明在所述继代培养基上进行继代培养，所述继代培养优选为暗培养，所述暗培养的温度优选为25±1℃。
本发明在进行所述继代培养的过程中，优选还包括对金钗石斛愈伤组织进行壮观霉素抗性筛选，优选的包括：将所述金钗石斛愈伤组织接种到添加了不同浓度壮观霉素的所述继代培养基中，每个浓度的接种量不少于10块所述愈伤组织，每隔5d统计所述愈伤组织的存活率，30d后停止统计。本发明所述壮观霉素的浓度分别为50、100、150、200和250mg/L。结果表明：100mg/L为金钗石斛愈伤组织的壮观霉素致死浓度。
得继代愈伤组织后，本发明将目的基因转入所述继代愈伤组织中，得侵染愈伤组织。本发明对所述黄色基因转入的方法并没有特殊限定，优选采用农杆菌介导的方法，具体包括：载体构建和农杆菌的转化；本发明对所述目的基因的来源并没有特殊限定。
本发明对所述载体构建和农杆菌转化的方法并没有特殊限定，优选包括：
所述载体构建优选包括：
(1)连接：目的基因3μL(20ng/L)，克隆载体pCAMBIA2301 1μL，总体积4μL，25℃反应15min。
(2)转化：取-70℃保存的大肠杆菌DH5α，冰上融化，至半融化状态时加入4μL的连接产物，轻弹混匀，冰浴20～30min，42℃热激30s，立即放于冰上2min，在超净工作台中加入250μL的无抗性的LB液体培养基，200rpm，37℃摇菌培养1h。
(3)涂板：离心后去上清液，留取100μL菌液均匀涂于50mg/L Km抗性的平板上，37℃培养8～12h。
(4)阳性克隆检测：挑取白色单菌落，接种在含有50mg/LKm的LB液体培养基中，250rpm，37℃摇菌培养4h，PCR检测阳性克隆，测序验证。
所述农杆菌的转化优选包括：
(1)取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于手心片接待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中；
(2)取100μL感受态细胞加入0.01-1.0μg质粒，手指轻敲管底混匀，依次于冰上、液氮中、37℃水浴和冰浴中各静置5min；
(3)加入无菌LB液体培养基，于28℃度震荡培养2～3h；
(4)6000rpm离心1min收菌，取50μL上清液轻轻吹打重悬菌块涂布于含50mg/L壮观霉素的LB平板上，倒置于28℃摇床上培养2～3d。
(5)阳性克隆检测：
挑取白色单菌落，接种在含有50mg/L壮观霉素的LB液体培养基中，250rpm，37℃摇菌培养4h，用引物进行PCR检测阳性克隆，送去测序验证。
本发明所述侵染优选为将所述金钗石斛愈伤组织放入含有转化的农杆菌1/2MS液体培养基中，所述侵染的时间优选为20～30min，更优选为22～28min，最优选为25min。本发明在所述侵染过程中优选伴随晃动，有利于转化的农杆菌侵入愈伤组织。
得侵染愈伤组织后，本发明将所述侵染愈伤组织接种于1/2MS的平板培养基上进行共培养。本发明在所述接种前，优选还包括吸附所述侵染后愈伤组织表面的侵染液，本发明对所述吸附的方法并没有特殊限定，优选利用无菌滤纸进行。本发明将吸附侵染液后的侵染愈伤组织接种于含有1/2MS培养基的平板上进行共培养，所述共培养优选为暗培养，所述暗培养的时间优选为3d，所述暗培养的培养温度优选为25±1℃。
共培养完成后，本发明将经过所述共培养的侵染愈伤组织接种于分化培养基上进行分化培养，得丛生芽；所述分化培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L、NAA 0.05～0.15mg/L、多壁碳纳米管0.8～1.5mg/L和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；所述分化培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为10～15d；所述光照培养的时间为20～25d，所述光照培养的光照度为100～300μmol·m-2·s-1，所述光照培养的光照时间为12～16h/d。本发明所述分化培养基中包括蔗糖，所述蔗糖的浓度优选为25～34g/L，更优选为28～32g/L，最优选为30g/L。
本发明所述分化培养基中包括琼脂，所述琼脂的浓度优选为6.5～8.5g/L，更优选为7～8g/L，最优选为7.5g/L。
本发明所述分化培养基中包括6-BA，所述6-BA的浓度优选为0.9～1.1mg/L，更优选为1.0mg/L。本发明所述6-BA可发挥促进愈伤组织分化的作用。
本发明所述分化培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为0.06～0.14mg/L，更优选为0.08～0.12mg/L，最优选为0.1mg/L。本发明所述NAA可发挥促进愈伤组织分化的作用。
本发明所述分化培养基中包括多壁碳纳米管，所述多壁碳纳米管的浓度优选为0.85～1.4mg/L，更优选为0.9～1.2mg/L，最优选为1mg/L。本发明所述多壁碳纳米管可促进水分和养分的吸收从而促进细胞分化，同时多壁碳纳米管还能抑制农杆菌的生长和繁殖。本发明对所述分化培养基中各成分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。
本发明在所述分化培养基上进行分化培养，所述分化培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为10～15d，所述暗培养的温度优选为25±1℃；本发明在所述愈伤组织开始分化后，即转入光照培养，所述光照培养的时间优选为20～25d。本发明所述光照培养的光照度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200～280μmol·m-2·s-1，最优选为250μmol·m-2·s-1。本发明所述光照培养的光照时间优选为12～16h/d，更优选为16h/d。本发明在所述暗培养后，可每隔20d继代一次。本发明先暗后光可达到促进愈伤组织分化的效果。
得丛生芽后，本发明将所述丛生芽接种于壮芽培养基上进行壮芽培养，得壮芽；所述壮芽培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L、琼脂6～9g/L、6-BA0.3～0.8mg/L、0.1mg/L NAA和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀。本发明所述壮芽培养基中包括蔗糖，所述蔗糖的浓度优选为36～44g/L，更优选为38～42g/L，最优选为40g/L。
本发明所述壮芽培养基中包括琼脂，所述琼脂的浓度优选为6.5～8.5g/L，更优选为7～8g/L，最优选为7.5g/L。
本发明所述壮芽培养基中包括6-BA，所述6-BA的浓度优选为0.4～0.6mg/L，更优选为0.5mg/L。本发明所述6-BA可发挥幼苗生长的作用。
本发明所述壮芽培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为0.06～0.14mg/L，更优选为0.08～0.12mg/L，最优选为0.1mg/L。本发明所述NAA可发挥促进幼苗生长的作用。
本发明所述壮芽培养基中还包括抗生素，本发明所述壮芽培养基中各成分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。
本发明在所述壮芽培养基中进行壮芽培养，所述培养的培养温度优选为25±1℃。本发明所述壮芽培养的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选200～280μmol·m-2·s-1，最优选为250μmol·m-2·s-1。本发明所述壮芽培养的光照时间优选为14～20h/d，更优选为15～18h/d，最优选为16h/d。本发明所述壮芽培养的时间优选为25～40d，更优选为28～35d，最优选为30d。
得壮芽后，本发明将所述壮芽接种于生根和壮苗共培养基上进行生根和壮苗共培养，得转基因金钗石斛；所述生根和壮苗共培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 1.5～3mg/L、NAA 0.1～0.4mg/L和IBA 1.4～2.5mg/L。本发明所述生根和壮苗共培养基中包括蔗糖，所述蔗糖的浓度优选为36～44g/L，更优选为38～42g/L，最优选为40g/L。
本发明所述生根和壮苗共培养基中包括琼脂，所述琼脂的浓度优选为6.5～8.5g/L，更优选为7～8g/L，最优选为7.5g/L。
本发明所述生根和壮苗共培养基中包括6-BA，所述6-BA的浓度优选为1.6～2.8mg/L，更优选为1.8～2.5mg/L，最优选为2mg/L。本发明所述6-BA可发挥促进幼苗生长的作用。
本发明所述生根和壮苗共培养基中包括NAA，所述NAA的浓度优选为0.15～0.3mg/L，更优选为0.18～0.25mg/L，最优选为0.2mg/L。本发明所述NAA可发挥促进幼苗生长的作用。
本发明所述生根和壮苗共培养基中包括IBA，所述IBA的浓度优选为1.5～2.4mg/L，更优选为1.8～2.2mg/L，最优选为2mg/L。本发明所述IBA可发挥促进幼苗生根的作用。本发明对所述生根和壮苗共培养基中各成分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。
本发明利用所述生根和壮苗共培养基进行生根和壮苗共培养，所述生根和壮苗共培养的培养温度优选为25±1℃。本发明所述生根和壮苗共培养的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200～280μmol·m-2·s-1，最优选为250μmol·m-2·s-1。本发明所述生根和壮苗共培养的光照时间优选为14～20h/d，更优选为15～18h/d，最优选为16h/d。本发明所述生根和壮苗共培养的时间优选为25～40d，更优选为28～35d，最优选为30d。在本发明中，生根和壮苗共培养30d后，即可长成茎直径1～2mm、根系3～5条的试管苗。
本发明在得到所述转基因金钗石斛后，优选还包括转基因植株的鉴定，所述鉴定优选包括自行显色法。本发明所述鉴定，愈伤组织分化出的芽发育成为黄色植株即表明目的基因成功整合到植物基因组中，植株即为转基因植株。本发明对所述测序鉴定的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规测试方法进行鉴定即可。
下面结合实施例对本发明提供的金钗石斛遗传转化体系的建立方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
金钗石斛愈伤组织的诱导：将金钗石斛无菌苗转接到含蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.4mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA培养基上。3周后，假根的周围出现绿色的突起，此为愈伤组织的萌动，4周后，可见绿色的突起膨大形成绿色的愈伤组织。此时再次进行继代培养，诱导愈伤组织的增殖。培养温度25±1℃，暗培养。
金钗石斛愈伤组织壮观霉素抗性的筛选：将金钗石斛愈伤组织接种到添加了不同浓度壮观霉素的培养基中，每个浓度的接种量不少于10块，每隔5d统计愈伤组织的存活率，30d后停止统计。培养基配方：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。壮观霉素的浓度分别为50、100、150、200、250mg/L。结果表明：100mg/L为金钗石斛愈伤组织的壮观霉素致死浓度。
载体构建
基因与载体的来源：目的基因CYP76AD6按照序列表中所示的核苷酸序列进行人工合成。选用不含报告基因的pCAMBIA2301质粒为载体。
目的基因的序列如SEQ ID NO.1所示:
ATGGATAACGCAACACTTGCTGTGATCCTTTCCATTTTGTTTGTGTTTTACCACATTTTCAAATCCTTTTTCACCAATTCTTCATCTCGTAGGCTTCCTCCTGGTCCCAAACCCGTGCCAATTTTTGGCAACATTTTCGATCTTGGCGAAAAGCCTCATCGATCTTTTGCCAATCTATCTAAAATTCACGGCCCTTTGATTAGCCTAAAGTTAGGAAGTGTAACAACTATTGTTGTTTCCTCGGCCTCTGTGGCCGAGGAAATGTTCCTTAAAAATGACCAAGCACTTGCTAACCGAACCATTCCTGACTCGGTTAGGGCTGGTGACCACGACAAATTATCCATGTCGTGGTTGCCTGTTTCCCAAAAATGGAGAAATATGAGAAAAATCTCCGCTGTCCAATTACTCTCCAACCAAAAACTTGATGCTAGTCAACCTCTTAGACAAGCTAAGGTGAAACAACTTTTATCATACGTACAAGTTTGTTCCGAAAAAATGCAACCCGTCGATATTGGACGGGCCGCATTTACAACGTCACTTAATTTATTATCAAACACATTTTTCTCAATCGAATTAGCAAGTCATGAATCTAGTGCTTCCCAAGAGTTTAAACAACTCATGTGGAATATTATGGAGGAAATTGGAAGGCCTAATTATGCTGATTTTTTCCCTATTCTTGGTTACATTGATCCCTTTGGTATAAGACGTCGTTTGGCTGGTTACTTTGATAAACTCATTGATGTTTTCCAAGACATTATTCGTGAAAGACAAAAGCTTCGATCTTCTAATTCTTCCGGCGCAAAACAAACAAATGACATTCTTGATACTCTTCTTAAACTCCATGAAGATAATGAGTTGAGTATGCCTGAAATTAATCACCTTCTCGTGGATATCTTTGACGCCGGAACAGACACAACAGCAAGCACATTAGAATGGGCGATGGCCGAACTTGTGAAAAACCCGGAAATGATGACTAAAGTTCAAATTGAAATCGAACAAGCTCTTGGAAAAGATTGCTTAGACATACAAGAATCCGACATCTCAAAACTACCTTATTTACAAGCCATTATAAAAGAAACGTTACGTTTACACCCTCCTACTGTGTTTTTGCTGCCTCGAAAGGCAGACAATGACGTAGAGTTATATGGCTACGTTGTACCAAAGAATGCTCAAGTCCTTGTCAATCTTTGGGCAATTGGTCGTGATCCAAAGGTATGGAAAAATCCGGAAGTATTTTCTCCTGAAAGGTTTTTAGATTGCAATATCGATTATAAAGGACGAGATTTCGAACTTTTACCCTTTGGTGCTGGTAGAAGGATATGCCCTGGACTTACTTTGGCATATAGAATGTTGAACTTGATGTTGGCTACTCTTCTTCAAAACTACAATTGGAAACTTGAAGATGGTATCAATCCTAAGGATTTAGACATGGATGAGAAATTTGGGATTACATTGCAAAAGGTTAAACCTCTTCAAGTTATTCCAGTTCCCAGAAACTAG
(1)连接：目的基因CYP76AD63μL(20ng/L)，克隆载体pCAMBIA23011μL，总体积4μL，25℃反应15min。(2)转化：取-70℃保存的大肠杆菌DH5α，冰上融化，至半融化状态时加入4μL的连接产物，轻弹混匀，冰浴25min，42℃热激30s，立即放于冰上2min，在超净工作台中加入250μL的无抗性的LB液体培养基，200rpm，37℃摇菌培养1h。
(3)涂板：离心后去上清液，留取100μL菌液均匀涂于50mg/L Km抗性的平板上，37℃培养10小时。
(4)阳性克隆检测：挑取白色单菌落，接种在含有50mg/L Km的LB液体培养基中，250rpm，37℃摇菌培养4h，PCR检测阳性克隆，测序验证。
农杆菌的转化
(1)取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于手心片接待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中；
(2)取100μL感受态细胞加入0.05μg质粒，手指轻敲管底混匀，依次于冰上、液氮中、37℃水浴和冰浴中各静置5min；
(3)加入无菌LB液体培养基，于28℃度震荡培养2.5h；
(4)6000rpm离心1min收菌，取50μL上清液轻轻吹打重悬菌块涂布于含50mg/L壮观霉素的LB平板上，倒置于28℃摇床上培养2d。
(5)阳性克隆检测：
挑取白色单菌落，接种在含有50mg/L壮观霉素的LB液体培养基中，250rpm，37℃摇菌培养4h，用引物进行PCR检测阳性克隆，送去测序验证。
金钗石斛愈伤组织的侵染：将大小约1cm3金钗石斛愈伤组织放入含有转化的农杆菌1/2MS液体培养基中，侵染25min，期间不停的晃动，有利于转化的农杆菌侵入愈伤组织；
共培养：将侵染后愈伤组织取出，无菌滤纸吸干愈伤组织表面的侵染液，接种于含有1/2MS培养基的平板上，暗培养3d，培养温度25±1℃。
筛选培养及愈伤组织的分化：暗培养结束后，将侵染后的愈伤组织接种于含有抗生素平板上。培养基配方：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L多壁碳纳米管+壮观霉素100mg/L。暗培养，培养温度25±1℃。之后，每隔20d继代一次。愈伤组织分化后，则开始进行光照培养，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。直至分化出丛生芽。
壮芽培养：将丛生芽转接到壮芽培养基上，进行壮芽培养。培养基配方：蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+壮观霉素100mg/L。培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
壮苗和生根培养：从生芽转接到上述壮芽培养基上，30d后再次在转接到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2.0mg/L IBA培养基上，进行壮芽和生根共培养。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。30d后即可长成原球茎直径1～2mm，根系3～5条的试管苗。
转基因植株的鉴定
目的基因CYP76AD6的表型为黄色。侵染后呈黄绿色的愈伤组织或者由该黄绿色愈伤组织分化出的黄绿色的试管苗，即为转基因植株。
本发明提供了一种金钗石斛遗传体系的建立方法，所述体系基于再生体系建立，为利用分子生物学手段对金钗石斛观赏性状和药用特性进行遗传改良奠定了技术基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法
<141> 2019-04-11
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggataacg caacacttgc tgtgatcctt tccattttgt ttgtgtttta ccacattttc 60
aaatcctttt tcaccaattc ttcatctcgt aggcttcctc ctggtcccaa acccgtgcca 120
atttttggca acattttcga tcttggcgaa aagcctcatc gatcttttgc caatctatct 180
aaaattcacg gccctttgat tagcctaaag ttaggaagtg taacaactat tgttgtttcc 240
tcggcctctg tggccgagga aatgttcctt aaaaatgacc aagcacttgc taaccgaacc 300
attcctgact cggttagggc tggtgaccac gacaaattat ccatgtcgtg gttgcctgtt 360
tcccaaaaat ggagaaatat gagaaaaatc tccgctgtcc aattactctc caaccaaaaa 420
cttgatgcta gtcaacctct tagacaagct aaggtgaaac aacttttatc atacgtacaa 480
gtttgttccg aaaaaatgca acccgtcgat attggacggg ccgcatttac aacgtcactt 540
aatttattat caaacacatt tttctcaatc gaattagcaa gtcatgaatc tagtgcttcc 600
caagagttta aacaactcat gtggaatatt atggaggaaa ttggaaggcc taattatgct 660
gattttttcc ctattcttgg ttacattgat ccctttggta taagacgtcg tttggctggt 720
tactttgata aactcattga tgttttccaa gacattattc gtgaaagaca aaagcttcga 780
tcttctaatt cttccggcgc aaaacaaaca aatgacattc ttgatactct tcttaaactc 840
catgaagata atgagttgag tatgcctgaa attaatcacc ttctcgtgga tatctttgac 900
gccggaacag acacaacagc aagcacatta gaatgggcga tggccgaact tgtgaaaaac 960
ccggaaatga tgactaaagt tcaaattgaa atcgaacaag ctcttggaaa agattgctta 1020
gacatacaag aatccgacat ctcaaaacta ccttatttac aagccattat aaaagaaacg 1080
ttacgtttac accctcctac tgtgtttttg ctgcctcgaa aggcagacaa tgacgtagag 1140
ttatatggct acgttgtacc aaagaatgct caagtccttg tcaatctttg ggcaattggt 1200
cgtgatccaa aggtatggaa aaatccggaa gtattttctc ctgaaaggtt tttagattgc 1260
aatatcgatt ataaaggacg agatttcgaa cttttaccct ttggtgctgg tagaaggata 1320
tgccctggac ttactttggc atatagaatg ttgaacttga tgttggctac tcttcttcaa 1380
aactacaatt ggaaacttga agatggtatc aatcctaagg atttagacat ggatgagaaa 1440
tttgggatta cattgcaaaa ggttaaacct cttcaagtta ttccagttcc cagaaactag 1500

Claims (10)

1.一种金钗石斛的转基因方法，包括以下步骤：(1)将金钗石斛无菌苗接种到诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖25～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 1.3～1.5mg/L和NAA 0.15～0.25mg/L；
(2)将步骤1)得到的所述愈伤组织接种于继代培养基上进行继代培养，得继代愈伤组织；所述继代培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L和NAA 0.05～0.15mg/L；
(3)将目的基因转入步骤2)得到的所述继代愈伤组织中，得侵染愈伤组织；
(4)将步骤3)得到的所述侵染愈伤组织接种于1/2MS的固体培养基上进行共培养；
(5)将经过步骤4)所述共培养的侵染愈伤组织接种于分化培养基上进行分化培养，得丛生芽；所述分化培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L、NAA 0.05～0.15mg/L、多壁碳纳米管0.8～1.5mg/L和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；所述分化培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为10～15d；所述光照培养的时间为20～25d，所述光照培养的光照度为100～300μmol·m-2·s-1，所述光照培养的光照时间为12～16h/d；
(6)将步骤5)得到的所述丛生芽接种于壮芽培养基上进行壮芽培养，得壮芽；所述壮芽培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.3～0.8mg/L、0.1mg/L NAA和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；
(7)将所述壮芽接种于生根和壮苗共培养基上进行生根和壮苗共培养，得转基因金钗石斛；所述生根和壮苗共培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L琼脂6～9g/L、6-BA 1.5～3mg/L、NAA 0.1～0.4mg/L和IBA 1.4～2.5mg/L。
2.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导培养的培养温度为25±1℃，所述诱导培养的光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为14～20h/d。
3.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(2)所述继代培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±1℃。
4.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(3)所述目的基因转入采用农杆菌介导的方法。
5.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(4)所述共培养为暗培养，所述共培养的时间为65～80h。
6.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(6)所述壮芽培养的培养温度为25±1℃，所述壮芽培养的光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为14～20h/d。
7.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(7)所述生根和壮苗共培养的培养温度为25±1℃，所述壮芽培养的光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为14～20h/d。
8.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(7)得到所述转基因金钗石斛后，还包括转基因植株的鉴定。
9.根据权利要求8所述转基因方法，其特征在于，所述鉴定包括显色鉴定。
10.根据权利要求9所述转基因方法，其特征在于，所述鉴定时，分化出黄色的植株即表明目的基因成功整合到金钗石斛基因组中。
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