CN108901844A - 一种构建石蒜属遗传转化体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种石蒜属遗传转化体系的构建方法，属于遗传学技术领域。一种石蒜属遗传转化体系的构建方法，向石蒜属愈伤组织中用基因工程的手段导入目标外源基因，再经过分化培养和壮苗培养，得到石蒜属试管苗，从而带有目标外源基因控制生物学性状的石蒜属新品种。采用本发明提供的构建方法具有重复性好、成功率高的特点，成功率达到60～80％。石蒜属遗传转化体系的建立为石蒜属的新品种培育开辟了新途径。
Description
技术领域
本发明属于遗传学技术领域，具体涉及一种构建石蒜属遗传转化体系的方法。
背景技术
石蒜属(Lycoris Herb.)隶属石蒜科(Amaryllidaceae)，多年生草本植物。鳞茎卵球形，春季出叶，叶带状，伞形花序有小花4～6朵；花黄色、红色、白色；花被裂片强度反卷和皱缩。花期7～8月。花茎挺拔，花形优美，花色艳丽。本属所有种类均具有很高的观赏价值，现已逐渐成为新型的鲜切花、园林地被和盆栽的球根花卉。
但是目前，我国对于石蒜属植物的利用仅限于对野生资源的驯化和栽培。对于石蒜属新品种的培育和推广仅处于起步阶段。目前仅有江苏省中国科学院植物研究所通过杂交育种和系统选育获得省级新品种各1个；杭州植物园通过系统选育国际登录新品种4个。由于本属部分种类属杂交起源，可育性较差，通过杂交育种获得新品种比较困难；即使杂交成功，也是重复率差，阳性率低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种构建石蒜属遗传转化体系的方法，为石蒜属的新品种培育开辟了新途径。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种构建石蒜属遗传转化体系的方法，包括以下步骤：
(1)将外源基因与载体依次经酶切、连接和筛选，得到重组载体；
(2)将所述重组载体导入农杆菌感受态细胞中，振荡培养2～3h，离心，收集菌体，将所述菌体涂布在含50～150mg/L卡那霉素抗性的平板上，筛选单菌落，得到阳性重组农杆菌；
(3)将阳性重组农杆菌转接到LB液体培养基中，25～29℃，180～220rpm，摇床培养16h以上，培养至菌液的OD600值达0.4～0.6，得到阳性重组农杆菌菌液；
(4)将所述阳性重组农杆菌菌液侵染石蒜属愈伤组织25～35min，得到侵染后的石蒜属愈伤组织；
(5)所述侵染后的石蒜属愈伤组织接种于MS培养基上，在24～26℃条件下暗培养2～4d，得到暗培养的石蒜属愈伤组织；
(6)将所述暗培养的石蒜属愈伤组织接种于含有抗生素的平板上进行愈伤组织的分化培养；每隔19～22d进行一次继代培养，直至愈伤组织分化得到丛生芽；
(7)将所述丛生芽接种到含有抗生素的壮芽培养基上进行壮芽培养，期间每隔19～22d继代一次，直至获得小鳞茎；
(8)将所述小鳞茎再次接种于生根培养基上进行生根培养，得到具有3～5条根的试管苗。
优选的，所述步骤(6)中含有抗生素的平板中抗生素包括以下浓度的组分：200～300mg/L卡那霉素和特美汀150～250mg/L；
所述平板中的培养基为包含以下含量组分的MS培养基：30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、6.0mg/L 6-BA、1.5mg/LNAA和1.0mg/L多壁碳纳米管；培养基的pH值为5.6～5.8。
优选的，所述步骤5)中暗培养的温度为24～26℃。
优选的，所述步骤6)中继代培养的光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为16h。
优选的，所述步骤(7)中壮芽培养基包括以下含量的组分的MS培养基：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、2.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA；所述壮芽培养基的pH值为5.6～5.8。
优选的，所述步骤(7)中壮芽培养和步骤(8)中共培养的条件如下：培养温度为24～26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
优选的，所述步骤(4)中石蒜属愈伤组织的制备方法如下：
S1.将石蒜属小鳞茎转接到诱导培养基上，在24～26℃条件下暗培养28～32d，得到淡黄色的愈伤组织团块；
S2.将所述淡黄色的愈伤组织团块进行继代培养，直至诱导出的愈伤组织团块直径超过1cm结束培养。
优选的，所述诱导培养基包括以下含量的MS培养基：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6.0mg/L 6-BA和1.5mg/LNAA。
优选的，所述步骤(1)中外源基因包括花青素合成相关基因、加蓝他敏合成相关基因或GUS基因。
优选的，所述步骤(1)中转入GUS基因的载体为pEF-3-GUS-2；转入花青素合成相关基因所用载体为pCAMBIA2301；所述转入花青素合成相关基因插入载体的多克隆位点为SalI和XbaI。
本发明提供了一种石蒜属遗传转化体系的构建方法，本发明向石蒜属愈伤组织中用基因工程的手段导入目标外源基因，再经过分化培养和壮苗培养，得到石蒜属试管苗，得到带有目标外源基因控制生物学性状的石蒜属新品种。采用本发明提供的构建方法具有重复性好、成功率高的特点，成功率达到60～100％。石蒜属遗传转化体系的建立为石蒜属的新品种培育开辟了新途径。
进一步的，本发明提供的构建方法进一步限定了愈伤组织的诱导方法，由于现有技术中石蒜属的组织培养技术比较滞后，石蒜属愈伤组织的成功诱导培养克服了现有技术中的技术障碍，为石蒜属组织培养提供了技术基础。本发明提供的构建方法以石蒜属愈伤组织为起始材料构建遗传转化体系，提高了转化成功率，为石蒜属遗传转化体系的构建提供了稳定的标准的操作流程。
进一步的，本发明提供的构建方法进一步限定了外源基因的种类，石蒜属鳞茎中所含多种生物碱(如加兰他敏)，是临床上治疗老年痴呆症的有效活性成分，但含量极低，通过石蒜属遗传转化体系的建立，转入加蓝他敏合成途径中的一个或者多个基因提高加蓝他敏的含量；外源基因为花青素合成相关基因时可以改良石蒜属花色或叶色。可见本发明提供的构建方法有利于丰富石蒜属的品系，为新型的鲜切花、园林地被和盆栽的球根花卉提供很大的观赏和药用价值。
附图说明
图1为本发明中GUS基因和MYB119基因在载体中插入位置示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种石蒜属遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：
(1)将外源基因与载体依次经酶切、连接和筛选，得到重组载体；
(2)将所述重组载体导入农杆菌感受态细胞中，振荡培养2～3h，离心，收集菌体，将所述菌体涂布在含50～150mg/L卡那霉素抗性的平板上，筛选单菌落，得到阳性重组农杆菌；
(3)将阳性重组农杆菌转接到LB液体培养基中，25～29℃，180～220rpm，摇床扩摇16h以上，至菌液的OD600值达0.4～0.6，得到阳性重组农杆菌菌液(4)将所述阳性重组农杆菌菌液侵染石蒜属愈伤组织25～35min，得到侵染后的石蒜属愈伤组织；
(5)所述侵染后的石蒜属愈伤组织接种于MS培养基上，在24～26℃条件下暗培养2.5～4d，得到暗培养的石蒜属愈伤组织；
(6)将所述暗培养的石蒜属愈伤组织接种于含有抗生素的平板上进行分化培养，每隔19～22d进行一次继代培养，得到丛生芽；
(7)将所述丛生芽接种到壮芽培养基上进行壮芽培养30～35d，期间每隔19～22d继代一次，直至获得小鳞茎；
(8)将所述小鳞茎再次接种于生根培养基上进行生根培养，得到试管苗。
本发明将外源基因与载体依次经酶切、连接和筛选，得到重组载体。在本发明中，所述外源基因优选包括花青素合成相关基因或加蓝他敏合成相关基因或GUS基因。
在本发明中，所述花青素合成相关基因优选为MYB119。所述MYB119的来源优选委托基因合成公司进行合成。在MYB119合成的同时，在其核苷酸序列两端添加酶切位点SalI和XbaI，所述MYB119的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.3所示(含有酶切位点)。
在本发明中，将所述花青素合成基因与载体分别进行双酶切。在本发明实施例中，所述载体为pCAMBIA2301(自带GUS报告基因)。
当以花青素合成基因为外源基因构建遗传转化体系时，优选将GUS基因作为报告基因与花青素合成基因同时在载体构建中，得到重组载体。所述GUS基因和MYB119在载体上插入位点如图1所示。
酶切后，本发明对花青素合成基因酶切产物和载体酶切产物进行连接，得到连接产物。所述连接用酶优选为T4连接酶。所述连接的条件如下：25℃反应15min。所述GUS基因的酶切产物和载体酶切产物的体积比为3:1。所述花青素合成基因酶切产物的浓度优选为20ng/L。
得到连接产物后，本发明将所述连接产物进行筛选。所述筛选的方法包括如下步骤：将所述连接产物导入农杆菌中，得到的农杆菌涂在含有抗生素的平板上培养，挑选白色单菌落经扩大培养后经阳性克隆检测，得到重组载体。
本发明中，当以GUS基因作为外源基因时，说明遗传转化体系构建的具体方法。转入GUS基因的重组载体为pEF-3-GUS-2。所述pEF-3-GUS-2购自Addgene公司。
在本发明中，所述导入的方法优选采用42℃热激30s的方法导入。所述农杆菌优选为农杆菌菌株EHA105感受态细胞。导入连接产物的农杆菌在不含抗生素的平板上适应性振荡培养1h。所述适应性振荡培养有利于使导入连接产物的农杆菌进行恢复活性。所述含有抗生素的平板中的抗生素优选为50mg/L的Km。培养的温度优选为37℃，所述培养的时间优选为8～12h。
所述阳性克隆检测的方法优选包括菌落PCR检测阳性克隆，测序验证。测序后的序列与GUS基因序列一致，说明连接产物为重组载体。
得到重组载体后，本发明将所述重组载体导入农杆菌感受态细胞中，振荡培养2～3h，离心，收集菌体，将所述菌体涂布在含50～150mg/L卡那霉素抗性的平板上，筛选单菌落，得到阳性重组农杆菌。
在本发明中，所述感受态细胞溶液的体积和重组载体的质量比为100μL：0.01～1.0μg。所述感受态细胞农杆菌菌株EHA105感受态细胞。本发明对所述农杆菌菌株EHA105感受态细胞的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的商品购买途径。振荡培养的温度优选为28℃。所述离心的转速优选为6000rpm。所述离心的时间优选为1min。所述平板的培养基为LB培养基。所述筛选单菌落包括菌落PCR检测阳性克隆，送去测序验证。具体方法同上述方案的筛选过程。
得到阳性重组农杆菌后，本发明将所述阳性重组农杆菌侵染石蒜属愈伤组织30～40min，得到侵染后的石蒜属愈伤组织。
在本发明中，所述石蒜属愈伤组织的制备方法如下：
S1.将石蒜属小鳞茎转接到诱导培养基上，在24～26℃条件下暗培养28～32d，得到淡黄色的愈伤组织团块；
S2.将所述淡黄色的愈伤组织团块进行继代培养，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块。
在本发明中，所述诱导培养基优选包括以下含量的MS培养基：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6.0mg/L6-BA和1.5mg/LNAA。所述暗培养的温度优选为25℃。所述暗培养的时间优选为30d。所述继代培养的条件同暗培养。所述继代培养用培养基同诱导培养基。
在本发明中，所述侵染优选将体积约1cm3石蒜属愈伤组织放入含有转化的农杆菌MS液体培养基中，不停的晃动，有利于转化的农杆菌侵入愈伤组织。
得到侵染后的石蒜属愈伤组织后，本发明所述侵染后的石蒜属愈伤组织接种于MS培养基上，在24～26℃条件下暗培养3d，得到暗培养的石蒜属愈伤组织。所述暗培养有利于使石蒜属愈伤组织在短时间内恢复活力。所述暗培养的温度优选为25℃。
暗培养的石蒜属愈伤组织后，本发明将所述暗培养的石蒜属愈伤组织接种于含有抗生素的平板上暗培养，每隔20d进行一次继代培养，得到丛生芽。
在本发明中，所述含有抗生素的平板中抗生素优选包括以下浓度的组分：200～300mg/L卡那霉素和特美汀150～250mg/L，更优选为250mg/L卡那霉素和特美汀200mg/L。所述平板中的培养基为包含以下含量组分的MS培养基：30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、6.0mg/L 6-BA、1.5mg/LNAA和1.0mg/L多壁碳纳米管；培养基的pH值为5.6～5.8。
在本发明中，所述分化培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。所述继代培养的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为16h。所述继代培养的温度同上述分化培养的条件。
得到丛生芽后，本发明将所述丛生芽接种到壮芽培养基上进行壮芽培养30～35d，期间每隔19～22d继代一次，直至获得小鳞茎。
在本发明中，所述壮芽培养基优选包括以下含量的组分的MS培养基：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、2.0mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA；所述壮芽培养基的pH值为5.6～5.8。
在本发明中，所述壮芽培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。所述壮苗培养的时间优选为32～34d。所述壮芽培养优选在光照条件下进行。光照强度100～300μmol·m-2·s-1，更优选为150～250μmol·m-2·s-1。光照时间16h。
得到小鳞茎后，本发明将所述小鳞茎接种于生根培养基上进行生根培养，得到试管苗。生根培养基包括以下含量的组分的MS培养基：40g/L蔗糖、7.5g/L琼脂和1.5g/L多壁碳纳米管。所述生根培养的温度24～26℃，更优选为25℃。光照强度100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1。光照时间16h。共培养30d后，即可长成直径1～2mm根系3～5条的试管苗。
得到试管苗后，本发明优选对所述试管苗进行转基因植株的鉴定。所述鉴定包括染色鉴定和测序验证。所述染色鉴定剪取上述试管苗叶片0.3cm，置于GUS染液中，37℃染色12h以上。之后使用无水乙醇进行脱色。叶片出现蓝色则表明报告基因成功的整合到植物基因组中，该植物即为转基因植株。采用本技术进行石蒜属转基因，阳性植物的染色率为60～65％。所述测序验证包括将所有染成蓝色的植株进行PCR扩增。所述PCR扩增用引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如下：5’-GCTGGTCACCAATTCACACG-3’(SEQID No.1)；所述反应引物的核苷酸序列如下：5’-AGAACACGGGGGACTCTTGA-3’(SEQ IDNo.2)。所述染成蓝色的植株均可扩增出GUS基因，扩增率100％。
下面结合实施例对本发明提供的一种构建石蒜属遗传转化体系的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
石蒜GUS转基因体系的建立
1愈伤组织的诱导将中国石蒜无菌小鳞茎转接到蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+6.0mg/L 6-BA+1.5mg/LNAA培养基上。2周后，小鳞茎的周围出现白色的突起，此为愈伤组织的萌动，20d可见白色的突起周围出现淡黄色的组织，30d后可见淡黄色的愈伤组织团块，此时再次进行继代培养，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块。培养温度25±1℃，暗培养。
2载体构建
(1)将克隆载体EF-3-GUS-21μL，作为重组质粒带入农杆菌中。
(2)转化：取-70℃保存的农杆菌菌株EHA105，冰上融化，至半融化状态时加入4μL的连接产物，轻弹混匀，冰浴20-30min，42℃热激30s，立即放于冰上2min，在超净工作台中加入250μL的无抗性的LB液体培养基，200rpm，37℃摇菌培养1小时。
(3)涂板：离心后去上清液，留取100μL菌液均匀涂于50mg/LKm抗性的平板上，37℃培养8-12小时。
(4)阳性克隆检测：挑取白色单菌落，接种在含有50mg/LKm的LB液体培养基中，250rpm，37℃摇菌培养4小时，PCR检测阳性克隆，测序验证。
3农杆菌的转化
(1)取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于手心片接待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中；
(2)取100μL感受态细胞加入0.01-1.0μg质粒，手指轻敲管底混匀，依次于冰上、液氮中、37℃水浴和冰浴中各静置5min；
(3)加入无菌LB液体培养基，于28℃度震荡培养2～3小时；
(4)6000rpm离心1min收菌，取50μL上清液轻轻吹打重悬菌块涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板上，倒置于28℃摇床上培养2-3天
(5)阳性克隆检测：
挑取白色单菌落，接种在含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，250rpm，37℃摇菌培养4小时，用引物进行PCR检测阳性克隆，送去测序验证。
4愈伤组织的侵染将大小约1cm3石蒜属愈伤组织放入含有转化的农杆菌MS液体培养基中，侵染30min，期间不停的晃动，有利于转化的农杆菌侵入愈伤组织；
5共培养将侵染后的石蒜属愈伤组织取出，无菌滤纸吸干愈伤组织表面的侵染液，接种于含有MS培养基的平板上，暗培养3d。培养温度25±1℃。
6筛选培养及愈伤组织的分化暗培养结束后，将侵染后的愈伤组织接种于含有抗生素平板上。培养基配方：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+6.0mg/L6-BA+1.5mg/LNAA+多壁碳纳米管1.0mg/L。抗生素的种类和浓度分别为：卡那霉素250mg/L，特美汀200mg/L。培养温度25±1℃，培养条件：暗培养。之后，每隔20d继代一次。愈伤组织分化后，则开始进行光照培养，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。直至分化出丛生芽。
7壮芽培养：从生芽转接到壮芽培养基上，进行壮芽培养。培养基配方：蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。30～60d后，即可长成直径1-2mm根系3-5条的试管苗。
9生根培养从生芽转接到上述壮芽培养基上。30d后再次在转接到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+2.0mg/L IBA培养基上，进行生根培养。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。30d后，即可长成直径1-2mm根系3-5条的试管苗。
10转基因植株的鉴定
(1)染色鉴定剪取上述试管苗叶片0.3cm，置于GUS染液中，37℃染色12h以上。之后使用无水乙醇进行脱色。叶片出现蓝色则表明报告基因成功的整合到植物基因组中，该植物即为转基因植株。采用本技术进行石蒜属转基因，阳性植物的染色率为70～80％。
(2)测序验证：采用天根生化科技(北京)有限公司生产的快速PCR试剂盒，对染色成蓝色的植株进行转基因植株的PCR验证，所用GUS引物为：
上游引物5’-GCTGGTCACCAATTCACACG-3’(SEQ ID No.1)
下游引物5’-AGAACACGGGGGACTCTTGA-3’(SEQ ID No.2)
PCR结果表明，所有染色成蓝色的植物均可扩增出GUS基因。所用PCR体系：MasterMix 10μL，双向引物(10μL)各0.5μL，模板DNA 1.0μL(20ng/L)，双蒸水20μL。PCR程序，94℃3min，94℃30s，55℃30s，721min，35个循环，72℃5min。PCR结束后，取5μL产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。所有染成蓝色的植株均可扩增出GUS基因，扩增率100％。
实施例2
石蒜花青素合成相关基因转基因体系的建立
1愈伤组织的诱导将石蒜无菌小鳞茎转接到蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+6.0mg/L6-BA+1.5mg/LNAA培养基上。2周后，小鳞茎的周围出现白色的突起，此为愈伤组织的萌动，20d可见白色的突起周围出现淡黄色的组织，30d后可见淡黄色的愈伤组织团块，此时再次进行继代培养，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块。培养温度25±1℃，暗培养。
2载体构建
基因与载体的来源：石蒜花青素合成基因MYB119采用基因合成公司按照序列表中SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列进行合成，所述核苷酸序列两端添加酶切位点SalI和XbaI。选用自带GUS报告基因的pCAMBIA2301质粒为载体。将GUS基因作为报告基因。所述GUS基因和MYB119在载体上连接的顺序如图1所示。
(1)连接：MYB119基因3μL(20ng/L)，克隆载体pCAMBIA23011μL，T4连接酶，总体积4μL，25℃反应15min。
(2)转化：取-70℃保存的农杆菌菌株EHA105，冰上融化，至半融化状态时加入4μL的连接产物，轻弹混匀，冰浴20～30min，42℃热激30s，立即放于冰上2min，在超净工作台中加入250μL的无抗性的LB液体培养基，200rpm，37℃摇菌培养1小时。
(3)涂板：离心后去上清液，留取100μL菌液均匀涂于50mg/LKm抗性的平板上，37℃培养8～12小时。
(4)阳性克隆检测：挑取白色单菌落，接种在含有50mg/LKm的LB液体培养基中，250rpm，37℃摇菌培养4小时，PCR检测阳性克隆，测序验证。
3农杆菌的转化
(1)取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于手心片接待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中；
(2)取100μL感受态细胞加入0.01-1.0μg质粒，手指轻敲管底混匀，依次于冰上、液氮中、37℃水浴和冰浴中各静置5min；
(3)加入无菌LB液体培养基，于28℃度震荡培养2～3小时；
(4)6000rpm离心1min收菌，取50μL上清液轻轻吹打重悬菌块涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板上，倒置于28℃摇床上培养2～3天
(5)阳性克隆检测：
挑取白色单菌落，接种在含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，250rpm，37℃摇菌培养4小时，用引物进行PCR检测阳性克隆，送去测序验证。
4愈伤组织的侵染将大小约1cm3石蒜属愈伤组织放入含有转化的农杆菌MS液体培养基中，侵染30min，期间不停的晃动，有利于转化的农杆菌侵入愈伤组织；
5共培养将侵染后的石蒜属愈伤组织取出，无菌滤纸吸干愈伤组织表面的侵染液，接种于含有MS培养基的平板上，暗培养3d。培养温度25±1℃。
6筛选培养及愈伤组织的分化暗培养结束后，将侵染后的愈伤组织接种于含有抗生素平板上。培养基配方：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+6.0mg/L6-BA+1.5mg/LNAA+多壁碳纳米管1.0mg/L。抗生素的种类和浓度分别为：卡那霉素250mg/L，特美汀200mg/L。培养温度25±1℃，培养条件：暗培养。之后，每隔20d继代一次。愈伤组织分化后，则开始进行光照培养，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。直至分化出丛生芽。
7壮芽培养：从生芽转接到壮芽培养基上，进行壮芽培养。培养基配方：蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。30～60d后，即可长成直径1-2mm根系3～5条的试管苗。
9生根培养从生芽转接到上述壮芽培养基上。30d后再次在转接到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+2.0mg/L IBA培养基上，进行生根培养。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。30d后，即可长成直径1-2mm根系3～5条的试管苗。
10转基因植株的鉴定
(1)染色鉴定剪取上述试管苗叶片0.3cm，置于GUS染液中，37℃染色12h以上。之后使用无水乙醇进行脱色。叶片出现蓝色则表明报告基因成功的整合到植物基因组中，该植物即为转基因植株。采用本技术进行石蒜属转基因，阳性植物的染色率为60～65％。
(2)测序验证：采用天根生化科技(北京)有限公司生产的快速PCR试剂盒，对染色成蓝色的植株进行转基因植株的PCR验证，所用GUS基因引物为：
上游引物5’-GCTGGTCACCAATTCACACG-3’(SEQ ID No.1)
下游引物5’-AGAACACGGGGGACTCTTGA-3’(SEQ ID No.2)
PCR结果表明，所有染色成蓝色的植物均可扩增出GUS基因。所用PCR体系：MasterMix 10μL，双向引物(10μL)各0.5μL，模板DNA 1.0μL(20ng/L)，双蒸水20μL。PCR程序，94℃3min，94℃30s，55℃30s，721min，35个循环，72℃5min。PCR结束后，取5μL产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。所有染成蓝色的植株均可扩增出GUS基因，扩增率100％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
杭州植物园（杭州市园林科学研究院）
<120> 一种构建石蒜属遗传转化体系的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctggtcacc aattcacacg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaacacggg ggactcttga 20
<210> 3
<211> 855
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgacatgg taggctcatt aggagtaagg aaaggtgcat ggacggagga ggaagatata 60
cttctaagga agtgcgttga gaaatatggt gaaggaagat ggcatgaagt tccttccaga 120
gcaggcttga atcgatgcag gaaaagctgc agaatgaggt ggttgaatta tcttaagcca 180
aatgtcaaga gaggacagtt ttcggtggac gaagtggact tgattatcag actacacaag 240
ttgcttggca ataggcaagt gaaaatgtgg tcattgatag ctggtagact ttcaggaaga 300
acagcgaatg atgtaaagaa ttattggaac tcaaaccagc gtaagaaggt gatttctagc 360
actgatgaag ttcaatcaaa accaaaagca aaatcaatca caagagacaa cataataaag 420
cctcaacctt ggaagttcag aaatttattc tggttaagag gaaaaagtac tccacttatt 480
aatgttggtt ctcaatatgg ggacgatctt tgtaagccat gttattcaac agtatcgcca 540
ccttccgaca ttaatgaagt tgaaagtata tggtgggaaa gctcgttaga tgacaaagaa 600
attaatcaaa cgatcaacag cagttgtctg ggttctgttt ctgtttcagc agcagcagct 660
tacctagagt ccagcgaaag tcattttgta aagaacaacg caccaagagg gataaaaact 720
ggggacgtgt tctatgaaca aggacaaaat tgttggagtg acatttcttt ggatgcagac 780
ctttggaatc taatcaatac agaactagat caacaacaac ctgaaggact tcagtctata 840
atgttgtaat ctaga 855
Claims (10)
1.一种石蒜属遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将外源基因与载体依次经酶切、连接和筛选，得到重组载体；
(2)将所述重组载体导入农杆菌感受态细胞中，振荡培养2～3h，离心，收集菌体，将所述菌体涂布在含50～150mg/L卡那霉素抗性的平板上，筛选单菌落，得到阳性重组农杆菌；
(3)将阳性重组农杆菌转接到LB液体培养基中，在25～29℃，180～220rpm条件下摇床培养16h以上，培养至菌液的OD600值达0.4～0.6，得到阳性重组农杆菌菌液；
(4)用所述阳性重组农杆菌菌液侵染石蒜属愈伤组织25～35min，得到侵染后的石蒜属愈伤组织；
(5)所述侵染后的石蒜属愈伤组织接种于MS培养基上，在24～26℃条件下暗培养2～4d，得到暗培养的石蒜属愈伤组织；
(6)将所述暗培养的石蒜属愈伤组织接种于含有抗生素的平板上进行愈伤组织的分化培养；每隔19～22d进行一次继代培养，直至愈伤组织分化得到丛生芽；
(7)将所述丛生芽接种到含有抗生素的壮芽培养基上进行壮芽培养，期间每隔19～22d继代一次，直至获得小鳞茎；
(8)将所述小鳞茎再次接种于生根培养基上进行生根培养，得到具有3～5条根的试管苗。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中含有抗生素的平板中抗生素包括以下浓度的组分：200～300mg/L卡那霉素和特美汀150～250mg/L；
所述平板中的培养基为包含以下含量组分的MS培养基：30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、6.0mg/L 6-BA、1.5mg/L NAA和1.0mg/L多壁碳纳米管；培养基的pH值为5.6～5.8。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中暗培养的温度为24～26℃。
4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中继代培养的光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为8h。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中壮芽培养基包括以下含量的组分的MS培养基：蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L、2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA；所述壮芽培养基的pH值为5.6～5.8。
6.根据权利要求1或5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中壮芽培养和(8)中生根培养条件独立如下：培养温度为24～26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中石蒜属愈伤组织的制备方法如下：
S1.将石蒜属小鳞茎转接到诱导培养基上，在24～26℃条件下暗培养28～32d，得到淡黄色的愈伤组织团块；
S2.将所述淡黄色的愈伤组织团块进行继代培养，当愈伤组织团块长至直径超过1cm时结束培养。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述诱导培养基包括以下含量组分的MS培养基：蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L、6.0mg/L 6-BA和1.5mg/L NAA。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中外源基因包括加蓝他敏合成相关基因、花青素合成相关基因或GUS基因。
10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中包含GUS基因的重组载体为pEF-3-GUS-2；转入花青素合成相关基因所用载体为pCAMBIA2301，所述花青素合成相关基因插入载体的多克隆位点为SalI和XbaI。
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| CN112237142B (zh) * | 2020-11-02 | 2022-04-26 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种建立中国石蒜或忽地笑再生体系的组培培养基及其方法 |
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