CN103993037A - 一种快速石蒜转基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种石蒜的转基因方法，为提高石蒜重要生物碱含量、改良石蒜品质及相关依赖于转基因技术的基础研究提供技术支撑。步骤包括：A.外植体消毒，B.愈伤的诱导，C.农杆菌侵染，D.抗性筛选，E.转基因石蒜愈伤组织的再生。本发明通过X-Gluc染色和PCR扩增检测两种方法验证转基因情况，抗性筛选有效，能保证抗性筛选后获得的为转基因植株。转基因方法不仅应用于植物性状改良及应用于性状改良的相关基础研究，而且可以应用于药用植物次生代谢物的生产研究。石蒜转基因体系的建立为提高石蒜重要生物碱含量、改良石蒜品质及相关依赖于转基因技术的基础研究提供技术支撑，同时对于石蒜属其他植物转基因体系的建立具有重要的借鉴意义。

Description

一种快速石蒜转基因的方法
技术领域
本发明涉及一种石蒜的转基因方法，属于植物改良和新品种开发技术领域。
背景技术
石蒜(Lycoris radiata)是观赏价值较高的一类草本花卉，具有花色鲜艳、花姿独特及花后观叶等特点，广泛应用于园林地被绿化及鲜切花生产。而且石蒜所含的特有生物碱还具有重要的药理价值。研究表明石蒜生物碱具有抗癌、消炎和胆碱酯酶抑制剂的作用，已被广泛应用于临床治疗。但石蒜中重要生物碱的含量很低，不能满足日益扩大的需求，而且过度采集严重破坏石蒜野生资源。因此，提高石蒜植株中重要生物碱的含量是当前石蒜开发利用迫切需要解决的问题。石蒜是我国石蒜属植物中分布范围最广、适应性最强的一个种，但是石蒜染色体核型为3倍体，不能通过常规的杂交手段来改良品质；而且即使是可以种子繁殖的其他石蒜属植物，从种子苗到开花至少需要3-4年，杂交育种周期很长。因此，石蒜转基因技术体系的建立，不仅是石蒜改良的必由之路，而且对于其他石蒜属植物的改良也具有高效优势，能够大大缩短育种进程。尽管石蒜组织培养及快繁技术已经成熟，愈伤组织诱导也有报道，但关于石蒜的转基因方法尚未见报道，而且石蒜属中也尚未有关于转基因方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用农杆菌介导法培育转基因石蒜的方法，为提高石蒜重要生物碱含量、改良石蒜观赏品质及相关依赖于转基因技术的基础研究提供技术支撑，同时对于石蒜属其他植物转基因方法的建立具有重要的借鉴意义。
本发明所提供的转基因技术，可包括以下步骤：
A外植体处理：选取多年生石蒜的鳞茎洗净，剥去外层鳞片，切除根部，切去鳞茎上半部分约1/2～2/3。将留有鳞茎盘的鳞茎均分为4～8块，用0.1％的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min，流水冲洗30～60min后，再在超净工作台上用75％的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含1％的次氯酸钠，无菌水冲洗4-5遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分；
B愈伤组织诱导：将灭过菌的小块鳞茎接种到愈伤诱导培养基中，配方如下：MS基本培养基中添加0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和浓度为0.1～3.0mg/L激动素，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下进行光照培养30～40天；
C农杆菌侵染：石蒜与农杆菌共培养用液体培养基悬浮制成携有目的基因的农杆菌菌液浸泡石蒜愈伤组织20-60min进行侵染，取出愈伤组织，接种于相应培养基上，再在22-26℃的条件下，进行侵染2-4天；所述石蒜愈伤农杆菌共培养液体培养基是在MS基本培养基上添加了浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和浓度为180-220μM的乙酰丁香酮，质量百分比浓度为0.8-1.2％的葡萄糖，浓度为0.08-0.12g/L的干酪素水解物；
D恢复培养：将农杆菌侵染后的石蒜愈伤组织置于不添加筛选剂的恢复培养基上，再在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下恢复培养6-14天；所述不添加筛选剂的恢复培养基是在MS基本培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和对农杆菌具有致死作用的抗生素；
E抗性筛选：将恢复培养的转基因愈伤组织转接至特定抗性的培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养10-20天，进行转基因愈伤组织的筛选；所述特定抗性培养基是MS基本培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和所转载体携有的抗性如卡那抗性；
F转基因组织GUS染色鉴定：将抗性筛选后的愈伤组织和未转基因的对照愈伤组织，通过X-Gluc染色后，显微镜观察；
G转基因石蒜愈伤组织的再生：一次抗性筛选后的愈伤组织转接至丛生芽诱导筛选培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养30-40天，进行丛生芽诱导与筛选；将获得丛生芽转接于生根筛选培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养20-30天，进行生根诱导与筛选；所述丛生芽诱导筛选培养基是在MS培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～3.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和所转载体携有的抗性；所述生根诱导筛选培养基是在MS培养基上添加浓度为0.1～5.0mg/L的萘乙酸和所转载体携有的抗性；
H转基因石蒜的PCR检测：获得的转基因石蒜植株，提取DNA，设计GUS基因引物扩增，电泳检测，鉴别转基因植株。
步骤A中的种子消毒用试剂0.1％的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min和含1％次氯酸钠灭菌30～60min。
步骤B所涉及到的培养基为MS基本培养基添加0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，添加0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和浓度为0.1～3.0mg/L激动素，pH值范围为5.8～7.0。
步骤C中所携带有目的基因的农杆菌的菌液制备方法可为：将OD650为0.6-0.8的携带有目的基因的农杆菌菌液中的菌体悬浮于0.5-1倍菌液体积的石蒜农杆菌共培养液用液体培养基中即可。可将石蒜愈伤置于灭菌的滤纸上，在22-26℃，进行进一步侵染；步骤C中用于侵染的农杆菌可为任意一种根癌农杆菌，如EHA105等；
步骤D中抗生素可为头孢青霉素、羧苄青霉素等；
步骤E中所用选择抗性为卡那霉素，所用浓度为：15-50mg/L；
步骤F中所用的GUS染色液为0.1M磷酸缓冲液含1-3mg/ml X-Gluc，37℃水浴8-16h染色，70％乙醇37℃水浴8-16h脱色后，体视镜观察拍照；
步骤H根据GUS基因设计引物，采用SDS法提取石蒜再生苗的总DNA，并以此为模板进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明提供一种利用农杆菌介导法培养转基因石蒜的方法，在实际应用方面，该方法将产生以下积极效果：(1)加速优良外源基因向石蒜的转移；(2)为改良石蒜重要生物碱的含量提供快速有效的方法；(3)为石蒜重要生物碱的生产提供新的思路。此外，本研究还对石蒜属其他植物的转基因方法的建立具有重要的借鉴意义。
附图说明
图1石蒜愈伤组织的诱导，图2诱导获得的石蒜愈伤组织，图3转基因石蒜愈伤组织的X-Gluc染色结果，图4转基因愈伤组织的分化及植株再生，图5转基因石蒜GUS基因的PCR扩增检测结果。
具体实施方式
下面结合石蒜的快速繁殖的实例说明本发明的具体实施方式。
实例1石蒜愈伤组织的诱导
1取石蒜的地下鳞茎，剥去外层鳞片，切除根部，切去鳞茎上半部分约1/2～2/3。将留有鳞茎盘的鳞茎均分为4～8块，用0.1％的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min，流水冲洗60min后，再在超净工作台上用75％的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含1％次氯酸钠溶液消毒30～60min，无菌水冲洗4-5次，最后用无菌滤纸吸干鳞茎表面水分。
2将消毒好的石蒜鳞茎小块直接接种到愈伤诱导培养基中：MS基本培养基中添加，6-卞基腺嘌呤0.5-3.0mg/L，0.5-3.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和0.1～3.0mg/L激动素，蔗糖30g/L，适当pH值；培养温度25±1℃，光照时间10～16h，进行光照培养，诱导愈伤组织见图1。
实例2转基因石蒜的培育
1农杆菌侵染
培养获得愈伤组织(图2)，分成0.1-0.3cm3的小块。将OD650值为0.5携带有目的基因的农杆菌EHA105/pBI121菌液中的菌体悬浮于1倍体积的添加乙酰丁香酮的愈伤液体培养基。将石蒜愈伤组织浸泡于上述愈伤农杆菌培养液中30-50分钟，进行侵染，取出愈伤组织，置于无菌滤纸上，在25℃，黑暗条件下共培养3天进行进一步侵染；所述石蒜愈伤农杆菌共培养液体培养基是在MS基本培养基上添加了浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和浓度为180-220μM的乙酰丁香酮，质量百分比浓度为0.8-1.2％的葡萄糖，浓度为0.08-0.12g/L的干酪素水解物。
2恢复培养
将步骤1中获得的农杆菌侵染后的石蒜愈伤组织置于不添加抗生素筛选剂的恢复培养基上，在25℃，光照10～16小时/天的条件下，恢复培养7天；所述不添加筛选剂的恢复培养基是在MS基本培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和对农杆菌具有致死作用的头孢青霉素。
3愈伤组织的抗性筛选
将步骤2中恢复培养的愈伤组织转接到带有特定抗性的培养基上，在25℃，光照10～16小时/天的条件下培养15天，进行转基因愈伤组织筛选；所述特定抗性培养基是MS基本培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素，载体携有的抗性为卡那霉素抗性，卡那霉素浓度15-40mg/L。
4愈伤组织的再生诱导
将3中获得转基因愈伤组织转接到带有特定抗性的丛生芽诱导培养基上，在25℃，光照10～16小时/天的条件下培养30天，进行丛生芽的诱导与筛选；诱导获得丛生芽接种于带有特定抗性的生根培养基上诱导生根，最终获得转基因石蒜再生植株(图4)；所述丛生芽诱导筛选培养基是在MS培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～3.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和浓度为15-40mg/L的卡那霉素，；所述生根诱导筛选培养基是在MS培养基上添加浓度为0.1～5.0mg/L的萘乙酸和浓度为15-40mg/L卡那霉素。
实例3转基因石蒜检测
1、转基因石蒜愈伤组织的X-Gluc染色
对实例2中步骤3中获得抗性愈伤组织进行X-Gluc染色，染色步骤如下：组织浸泡于含1-3mg/ml X-Gluc的0.1MPH7.0的磷酸缓冲液中，37℃水浴，16小时；进而放于70％的乙醇中37℃水浴，16小时。染色结果如图3所示(左下方为转基因愈伤组织，右上方为未转基因的对照愈伤组织)
2、转基因石蒜的PCR检测
对转基因石蒜再生苗用PCR方法进行检测，根据载体上携带的GUS基因序列设计引物，理论扩增产物大小为516bp，引物序列如下：
引物1(上游引物)：5’-ATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGA
引物2(下游引物)：5’-GTCGTGCACCATCAGCACGTTATCGA
采用SDS法提取石蒜再生苗的总DNA，并以此为模板，在引物1和引物2的引导下，对转基因植株中的进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃5min,然后94℃30s,58℃30s,72℃30s,共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(泳道M：DNAmarker DL2000，泳道1-4：不同待测植株，泳道5：未转基因对照，泳道6：阴性对照)，可扩增出大小为516bpDNA片段的为阳性转基因植株。
以上实例的石蒜转基因实例见附图。

Claims (3)

1.石蒜的转基因方法，其特征在于： 
A外植体消毒：选取多年生石蒜的鳞茎洗净，剥去外层鳞片，切除根部，切去鳞茎上半部分约1/2～2/3。将留有鳞茎盘的鳞茎均分为4～8块，用0.1％的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min，流水冲洗30～60min后，再在超净工作台上用75％的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含1％的次氯酸钠，无菌水冲洗4-5遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分； 
B愈伤诱导：将消毒过的小块鳞茎接种到以下培养基中：MS基本培养基添加0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤和0.1～5.0mg/L-二氯苯氧乙酸和浓度为0.1～3.0mg/L激动素，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下进行光照培养30～40天； 
C农杆菌侵染：石蒜与农杆菌共培养用液体培养基悬浮制成携有目的基因的农杆菌菌液浸泡石蒜愈伤组织20-60min，进行侵染，取出愈伤组织，接种于相应培养基上，再在22-26℃的条件下，进行侵染2-4天；所述石蒜愈伤农杆菌共培养液体培养基是在MS基本培养基上添加了浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素，浓度为180-220μM的乙酰丁香酮，质量百分比浓度为0.8-1.2％的葡萄糖，浓度为0.08-0.12g/L的干酪素水解物； 
D恢复培养：将农杆菌侵染后的石蒜愈伤组织置于不添加筛选剂的恢复培养基上，再在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下恢复培养6-14天；所述不添加筛选剂的恢复培养基是在MS基本培养基基础上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和对农杆菌具有致死作用的抗生素； 
E抗性筛选：将恢复培养的转基因愈伤组织转接至特定抗性的培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养10-20天，进行转基因愈伤组织的筛选；所述特定抗性培养基是MS基本培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和所转载体携有的抗性如卡那霉素抗性； 
F转基因石蒜愈伤组织的再生：一次抗性筛选后的愈伤组织转接至丛生芽诱导筛选培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养30-40天，进行丛生芽诱导与筛选；进一步将获得丛生芽转接于生根筛选培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养20-30天，进行生根诱导与筛选，所述丛生芽诱导筛选培养基是在MS培养基基础上添加浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～3.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和所转载体携有的抗性；所述生根诱导筛选培养基是在MS培养基基础上添加浓度为0.1～5.0mg/L的萘乙酸和所转载体携有的抗性。 
2.根据权利要求1所述石蒜的转基因方法，其特征在于步骤A中的种子消毒用试剂0.1％的安 利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min和1％次氯酸钠灭菌30～60min。 
3.根据权利要求1所述的石蒜的转基因方法，其特征在于步骤B中所涉及到的pH值范围为5.8～7.0。 
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