CN101139582B - 利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，该方法是采用将香蕉胚性悬浮细胞在酶解液中进行酶解获得原生质体，受体原生质体用碘乙酰胺进行处理，供体原生质体用紫外灯进行照射处理，将供体原生质体和受体原生质体混合后，用聚乙二醇法进行融合。融合产物悬浮于原生质体液体培养基中进行看护培养，获得的细胞团转移到体胚诱导培养基上进行培养至体胚萌发进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。本发明只有融合产物能够再生植株，减少了在培养过程中的工作量及获得苗后的筛选、鉴定的工作量；同时本发明所采用的培养基配方简单，便宜，解决了香蕉原生质体融合后融合产物培养过于繁琐的问题。
Description
技术领域
本发明属于香蕉体细胞杂交技术领域，特别涉及一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法。
背景技术
目前，栽培的香蕉病害猖獗，面临着包括真菌、细菌、病毒和生理性病害病以及线虫等种类繁多的病害威胁，特别是香蕉枯萎病第4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.Cybense Snyder&Hansed，race4)，已成为我国香蕉毁灭性的病害，加之寒害等非生物逆境的袭击，香蕉生产面临着严峻的考验，急需培育出品质优良的具有抗病、抗逆性的香蕉新品种。由于栽培蕉高度不育、无种子，因此通过传统杂交育种方法难于获得新品种，而利用体细胞杂交技术是获得高抗性香蕉新品种的育种途径之一。建立适合于目标基因型的稳定高效的香蕉原生质体培养及其融合再生系体系是进行香蕉体细胞杂交育种的前提。
目前所报道的香蕉体细胞杂交技术常采用对称电融合法或者对称PEG融合法将香蕉原生质体直接进行融合，融合产物悬浮于原生质体液体培养基中进行看护培养，获得的细胞团在体胚诱导培养基上进行体胚诱导并萌发，最后获得完整的植株；再生植株再经过RAPD、流式细胞技术或其它形态学方法进行筛选、鉴定，最后获得体细胞杂种。这些技术体系主要存在以下几方面的不足：①用于融合产物培养的原生质体液体培养基组成复杂，成份多达37种，且含有不少价格昂贵、不常用的试剂，如维生素A(VA)、维生素D3(VD3)、玉米素等；②融合产物的各个培养阶段所采用的培养基配方各不相同，使得原生质体融合工作繁琐、耗时；③原生质体融合后，如何筛选、鉴定体细胞杂种工作量大。由于上述现有技术的不足，限制了通过体细胞杂交技术培育香蕉新品种的进一步应用。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法。
本发明的目的通过下述方案实现：一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，包括如下步骤：
(1)香蕉原生质体的分离和纯化：将继代培养3～5d、直径200μm以下的香蕉胚性悬浮细胞(ECS)与酶解液混合，细胞密实体积(packed cellvolume，PCV)与酶解液体积比例为1∶3～5，在27±1℃、黑暗条件下，30～50rpm震荡8～10h进行酶解；将酶解后的混合物分离纯化得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体。
(2)香蕉受体原生质体的处理：将步骤(1)获得的香蕉受体原生质体采用最低致死剂量的碘乙酰胺(IOA)处理14～18min，将处理后的混合液用原生质体洗涤液洗涤2～3次，最后用原生质体液体培养基将处理过的原生质体稀释到浓度为105～106个/mL。
香蕉供体原生质体的处理：将步骤(1)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL，然后铺成薄层，以保证原生质体的厚度为1～2层细胞，在紫外灯下照射60～180s。
(3)原生质体的不对称融合：将步骤(2)处理后的受体原生质体和供体原生质体，按体积比1∶1混合得到原生质体悬液；将原生质体悬液采用聚乙二醇(PEG)融合法进行融合得到融合产物。
(4)融合产物的看护培养：将1.2％(w/v)、pH5.6～5.8的琼脂糖溶液灭菌后，温度降到30～35℃时，等体积加入到含15～20mL PCV％看护细胞的液体看护培养基中搅匀，凝固后，在其上覆盖一层消毒过的混合纤维素滤膜，将步骤(3)的融合产物转到混合纤维素滤膜上，在27±1℃、黑暗下培养，直到长出肉眼可见0.5～1.0mm的融合产物的细胞团；所述看护细胞为直径小于200μm的香蕉胚性悬浮细胞(ECS)。
(5)从融合产物获得细胞团的体胚诱导：将步骤(4)中获得的融合产物的细胞团转到体胚诱导培养基上，进行体胚诱导，得到直径约为1.0～1.5mm的成熟体胚。
(6)体胚的萌发与成苗：将步骤(5)中诱导得到的成熟体胚转移到体胚诱导培养基上，每隔15～20d继代一次直到体胚萌发，得到再生苗，将芽高2～3cm的再生苗进行培养，即可得到体细胞杂种植株。
为了更好地实现本发明，所述酶解液组成为：1.52％(w/v)KCl+0.98％(w/v)CaCl2+3.5％(w/v)纤维素酶R-10+1％(w/v)离析酶R-10+0.15％(w/v)果胶酶Y-23，pH5.6～5.8。
所述的原生质体液体培养基组成为：基本培养基+1mg L-12，4-D+100mg L-1MES+72g L-1葡萄糖，过滤灭菌前pH为5.6～5.8。
所述的体胚诱导培养基组成为：基本培养基+0.5mg L-16-BA+0.4mgL-1IAA+3g L-1Gelrite，pH为5.6～5.8，高温高压灭菌(121℃、1.06kg/cm2下灭菌15min)。
所述基本培养基(BM)：MS基本培养基+1mg L-1生物素+100mg L-1谷氨酰胺+100mg L-1麦芽提取物+45g L-1蔗糖。
步骤(4)中所述的含15～20mL PCV％看护细胞的液体看护培养基是按下述方法配制：取15～20mL香蕉ECS PCV(香蕉胚性悬浮细胞的细胞密实体积)用双倍质量浓度的看护培养基稀释到100mL；所述的看护培养基组成为：MS盐+Morel维生素+440mg L-1肌醇+2mg L-12，4-D+554mg L-1葡萄糖+40g L-1蔗糖+95g L-1麦芽糖，pH5.6～5.8，过滤灭菌。
所述的香蕉胚性悬浮细胞包括贡蕉[Musa acuminata cv.Mas(AA)]胚性悬浮细胞、龙芽蕉(Musa AAB Silk cv.Guoshanxiang)胚性悬浮细胞、大蕉[Musa paradisiaca Linn.cv.Da Jiao(ABB)]胚性悬浮细胞或巴西香蕉(Musa AAA Cavendish cv.Baxi)胚性悬浮细胞等。
所述紫外灯的功率20W、强度约为50μW/mm2。
所述步骤(1)中将酶解后的混合物分离纯化得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体是按下述方法进行的：将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的筛网过滤，以便高效率的纯化原生质体；将滤液于1500～2000rpm离心5～8min，沉淀用原生质体洗涤液悬浮；再于1500～2000rpm离心5～8min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，于1500～2000rpm离心5～8min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，即得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体。所述原生质体洗涤液组成为：1.52％(w/v)KCl+0.98％(w/v)CaCl2+100mg L-1MES+10％(w/v)甘露醇，pH5.6～5.8。
所述步骤(2)中将处理后的混合液用原生质体洗涤液洗涤2～3次是按下述方法进行的：将处理液于1500～2000rpm离心5～8min，沉淀用原生质体洗涤液悬浮；重复上述操作用原生质体洗涤液洗涤1～2次。
所述步骤(3)中将原生质体悬液采用聚乙二醇(PEG)融合法融合得到融合产物是按下述方法进行的：将上述原生质体悬液铺成均匀圆形，直径约1.5～2.5cm，静置20～30min；在原生质体悬液边缘处均匀滴加200～250μLPEG溶液，静置15～20min，促进原生质体融合；再向原生质体悬液边缘均匀滴加钙液400～500μL，静置10～15min；按上述操作重新滴加钙液1次，静置10～15min；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加1～1.5mL原生质体洗涤液，静置10～15min；然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体洗涤液；重复滴加-吸出原生质体洗涤液操作一次；在原生质体悬液边缘滴加1～1.5mL原生质体液体培养基，静置10～15min；然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基；再加入1～1.5mL原生质体液体培养基；混匀，调整原生质体密度为105～106个/mL，得到融合产物。
所述的PEG溶液组成为：2％(w/v)葡萄糖+1.5％(w/v)Ca(NO3)2+20～40％(w/v)PEG(6000)(聚乙二醇)，pH7.0。
所述的钙液组成为：4.5％(w/v)Ca(NO3)2，pH7.0。
本发明具有如下特点：
①本发明采用组成为MS基本培养基+1mg L-1生物素+100mg L-1谷氨酰胺+100mg L-1麦芽提取物+45g L-1蔗糖作为基本培养基(BM)。
②根据原生质体及原生质体融合产物的不同发育阶段，在基本培养基(BM)中添加不同浓度和种类的植物生长调节物质或其它有机物，用于原生质体及原生质体融合产物的不同发育阶段的培养，避免了现有报道的原生质体培养需要配制多种培养基的麻烦。如，在原生质体或原生质体融合产物培养形成细胞团阶段采用的原生质体液体培养基为：BM+1mg L-12，4-D+100mg L-1MES[2，-(N-吗啡啉)-乙基磺酸]+72g L-1葡萄糖。形成细胞团后的体胚发生阶段采用的体胚诱导培养基为：BM+0.5mg L-16-BA+0.4mg L-1IAA+3g L-1Gelrite。
③在原生质体进行融合之前，通过碘乙酰胺(IOA)处理受体原生质体使其细胞质代谢失活、通过紫外线(UV)照射处理供体原生质体使其染色体片段化而细胞核失活，融合后只有融合产物方可通过代谢互补进行植株再生，从而达到筛选细胞杂种的目的。
④受体原生质体的处理：为了减少融合后再生后代的筛选工作，常利用一些代谢抑制剂处理受体原生质体以抑制其分裂。线粒体氧化磷酸化和糖酵解都是细胞质中产生能量的过程。IOA抑制糖酵解过程，与磷酸甘油醛脱氢酶上的-SH发生不可逆的结合，抑制酶的活性，从而阻止3-磷酸甘油醛氧化生成3-磷酸甘油酸，使糖酵解不能进行，细胞生长发育的能量得不到供应。只有当受IOA处理的细胞和另外一个细胞质完整的细胞融合，代谢上得到互补，才能正常地生长。
供体原生质体的处理：采用UV照射供体原生质体，使其染色体被击成“小片段”，然后与一个染色体正常的受体细胞或原生质体融合。在适宜的条件下发生染色体重组，使供体染色体碎片“掺入”受体染色体中，从而形成具有受体整套染色体组，而仅有少量供体染色体片段的不对称杂种；同时还可以起到抑制供体原生质体发育而只有融合产物才能生长的作用。
⑤对供体原生质体进行紫外线照射处理使其染色体片段化，供体原生质体、受体原生质体融合后只有少量供体的遗传物质进入到融合产物中，获得不对称杂种植株。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)与文献报道的使用最成功的原生质体液体培养基相比，本发明的原生质体液体培养基组成简单，只需要26种化学药品，所使用的都为常规的便宜的药品(见表1)；采用现有技术的培养基每配制1L培养基耗费约10元(见表1)，采用本发明的培养基每配制1L培养基耗费约7元(见表2)，因此每配制1L培养基可节省费用30％。
从表3可知，采用本发明的原生质体液体培养基后，可增加原生质体在培养过程中的细胞分裂频率和细胞团形成频率，在其它香蕉品种中也获得了同样的效果。
表1现有报道的原生质体液体培养基配方(Assani et al.，2001)
表2本发明的原生质体液体培养基配方
表3本发明的原生质体液体培养基与现有技术的原生质体液体培养基对香蕉原生质体培养的影响
(2)在融合产物的细胞团形成阶段和体胚发生阶段采用了相同的基本培养基(BM)。但在细胞团形成阶段添加了葡萄糖、MES和2，4-D；在体胚发生阶段添加了NAA、BAP，可简化培养基的配制工作。
(3)受体原生质体和供体原生质体在融合前分别进行失活处理，可达到只有融合产物才能够再生植株，因此所获得的再生植株绝大多数为杂种，可减少培养过程的工作量及后期对杂种的筛选和鉴定工作；本发明重复性高。
(4)原生质体融合采用的是不对称的融合方式，所获得的杂种植株为不对称杂种。
附图说明
图1为香蕉原生质体不对称融合方案图。
图2为龙牙蕉和贡蕉原生质体融合并获得再生杂种植株的过程图。
图3为龙牙蕉和贡蕉融合产物再生杂种植株的RAPD鉴定图。
图4为龙牙蕉和大蕉融合产物再生杂种植株的ISSR鉴定图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所需培养基和各种溶液如下：
基本培养基(BM)：MS基本培养基(Murashige and Skoog，1962)+1mgL-1生物素+100mg L-1谷氨酰胺+100mg L-1麦芽提取物+45g L-1蔗糖。
原生质体液体培养基：BM+1mg L-12，4-D+100mg L-1MES+72g L-1葡萄糖，过滤灭菌前pH为5.6～5.8。
体胚诱导培养基：BM+0.5mg L-16-BA+0.4mg L-1IAA+3g L-1Gelrite，pH为5.6～5.8，高温高压灭菌(121℃、1.06kg/cm2下灭菌15min)。
看护培养基(Assani et al.，2001)：MS盐+Morel维生素(Morel andWetmore，1951)+440mg L-1肌醇+2mg L-12，4-D+554mg L-1葡萄糖+40gL-1蔗糖+95g L-1麦芽糖，pH5.6～5.8，过滤灭菌。
促进植株发育的培养基：MS基本培养基+0.1％活性炭，pH5.6～5.8。
酶解液：1.52％(w/v)KCl+0.98％(w/v)CaCl2+3.5％(w/v)纤维素酶R-10+1％(w/v)离析酶R-10+0.15％(w/v)果胶酶Y-23，pH5.6～5.8。
原生质体洗涤液：1.52％(w/v)KCl+0.98％(w/v)CaCl2+100mg L-1MES+10％(w/v)甘露醇，pH5.6～5.8。
PEG溶液：2％(w/v)葡萄糖+1.5％(w/v)Ca(NO3)2+20～40％(w/v)PEG(6000)pH7.0。
钙液：4.5％(w/v)Ca(NO3)2，pH7.0。
1.5mM的IOA(碘乙酰胺)：377mgIOA溶解于1L原生质体洗涤液。
实施例1
一种利用原生质体不对称融合技术获得龙牙蕉[Musa AAB Silk cv.Guoshanxiang]与贡蕉[Musa acuminata cv.Mas(AA)]体细胞杂种，技术方案如图1所示：
(1)龙牙蕉受体原生质体的分离和纯化：取继代培养3d的龙牙蕉ECS，用200μm的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团，过筛后取直径200μm以下的ECS，按照细胞密实体积(PCV)与酶解液体积比例为1∶3进行混合，在27±1℃、黑暗下，50rpm震荡8h进行酶解。将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的不锈钢筛网过滤，以便高效率的纯化原生质体。滤液经过1500rpm离心8min，沉淀用原生质体洗涤液重新悬浮；再经过1500rpm离心8min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，1500rpm离心8min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，得到龙牙蕉受体原生质体。
贡蕉供体原生质体的分离和纯化：取继代培养3d的贡蕉ECS，用200μm的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团，过筛后取直径200μm以下的ECS，按照细胞密实体积(PCV)与酶解液体积比例为1∶3进行混合，在27±1℃、黑暗下，50rpm震荡8h进行酶解。将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的不锈钢筛网过滤，以便高效率的纯化原生质体。滤液经过1500rpm离心8min，沉淀用原生质体洗涤液重新悬浮；再经过1500rpm离心8min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，1500rpm离心8min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，得到贡蕉供体原生质体。
(2)龙牙蕉受体原生质体的处理：将步骤(1)获得的受体原生质体采用最低致死剂量的1.5mM碘乙酰胺(IOA)处理15min，将处理后的混合液于1500rpm离心8min，沉淀用原生质体洗涤液悬浮；于1500rpm离心8min，沉淀用原生质体洗涤液悬浮；于1500rpm离心8min后沉淀用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL。
贡蕉供体原生质体的处理：将步骤(1)获得的供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL，放入培养皿，在皿底形成一薄层，以保证原生质体的厚度为1～2层细胞，将培养皿放在紫外灯管中心下方垂直8cm处照射60s；紫外灯功率20W、强度约为50μW/mm2。
(3)原生质体的不对称融合：将上述处理后的受体原生质体、供体原生质体，按体积比1∶1混合得到原生质体悬液。将混合后的原生质体悬液在培养皿中央铺成均匀圆形，直径约1.5～2.5cm，静置20min；在培养皿中央的原生质体悬液边缘处均匀滴加200μL浓度为20％(w/v)PEG溶液，静置20min，促进原生质体融合；向培养皿中央的原生质体悬液边缘均匀滴加钙液400μL，静置15min；按上述操作重新滴加钙液1次，静置15min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；重复滴加-吸出原生质体洗涤液操作一次；从原生质体悬液边缘加入1mL原生质体液体培养基，静置10min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；再按上述操作加入1mL原生质体液体培养基；混匀，调整原生质体密度为105～106个/mL。
(4)融合产物的看护培养：取直径小于200μm的贡蕉ECS作为看护细胞，用双倍质量浓度的液体看护培养基调整看护细胞浓度为20mL PCV％(取20mL贡蕉ECS PCV用双倍质量浓度的看护培养基稀释到100mL)。将琼脂糖用蒸馏水调整浓度为1.2％(w/v)，pH5.6～5.8，高温高压灭菌(121℃、1.06kg/cm2下灭菌15min)。当琼脂糖溶液温度下降到30～35℃时，立即等体积混入上述含20mL PCV％看护细胞的液体看护培养基中，搅匀，凝固后即成为厚度为4～8mm的固态看护细胞培养基，在其上覆盖一层消毒过的混合纤维素滤膜。将步骤(3)的融合产物转到混合纤维素滤膜上，在27±1℃、黑暗下培养，直到长出肉眼可见0.5～1.0mm的细胞团。
(5)从融合产物获得细胞团的体胚诱导：将体胚诱导培养基倒入培养皿中，凝固后，将在看护培养中获得的融合产物的细胞团转到体胚诱导培养基上，在27±1℃、黑暗下进行体胚诱导，直到获得直径约为1.0～1.5mm的成熟体胚。
(6)体胚的萌发与成苗：将成熟体胚转移到新鲜的体胚诱导培养基上，每隔15d继代一次直到体胚萌发。将芽高2～3cm的再生苗转移到促进植株发育的培养基中进行培养。培养条件为16h光照/8h黑暗光周期条件下进行，27±1℃。约1个月后可获得体细胞杂种植株。
(7)杂种的分子检测结果：如图3所示为龙牙蕉和贡蕉原生质体不对称融合获得再生植株的RAPD检测图，其中，M：DNA marker；Mas：贡蕉；G：龙牙蕉；H3～14：融合产物再生植株。a、所用引物为OPAC-04；b、所用引物为OPD-10；c、所用引物为OPR-02。RAPD-PCR检测表明部分贡蕉DNA条带出现在再生杂种植株中，证实部分贡蕉DNA已导入再生杂种植株中。所用引物从英骏(invitrogen)生物技术有限公司购得。
如图2所示为龙牙蕉和贡蕉原生质体不对称融合获得再生杂种植株的过程，其中：a、刚分离纯化的龙牙蕉原生质体，bar＝100μm：b、刚分离的贡蕉原生质体，bar＝50μm；c、在PEG的作用下，两个原生质体接近，bar＝50μm；d-e、两个原生质体进行融合，bar＝25μm；f、融合子，bar＝25μm；g、融合产物培养2～4h后，bar＝50μm；h、融合产物再生细胞团，bar＝50μm；i、融合产物获得的体胚，bar＝5mm；j、融合产物再生植株，bar＝10cm。
实施例2
本发明利用原生质体不对称融合技术获得龙牙蕉[Musa AAB Silk cv.Guoshanxiang]与大蕉[Musa paradisiaca Linn.cv.Da Jiao(ABB)]体细胞杂种，技术方案如图1所示：
(1)龙牙蕉受体原生质体的分离和纯化：取继代培养5d的龙牙蕉ECS，过筛后取直径200μm以下的ECS，按照细胞密实体积(PCV)与酶解液体积比例为1∶5进行混合，在27±1℃、黑暗下，30rpm震荡10h进行酶解。将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的筛网过滤，以便高效率的纯化原生质体。滤液于2000rpm离心5min，沉淀用原生质体洗涤液重新悬浮；再于2000rpm离心5min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，2000rpm离心5min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，得到龙牙蕉受体原生质体。
大蕉供体原生质体的分离和纯化：取继代培养5d的大蕉ECS，过筛后取直径200μm以下的ECS，按照细胞密实体积(PCV)与酶解液体积比例为1∶5进行混合，在27±1℃、30rpm震荡10h、黑暗下进行酶解。将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的筛网过滤，以便高效率的纯化原生质体。滤液经过2000rpm离心5min，沉淀用原生质体洗涤液重新悬浮；再经过2000rpm离心5min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，2000rpm离心5min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，得到大蕉供体原生质体。
(2)龙牙蕉受体原生质体的处理：将步骤(1)获得的受体原生质体采用最低致死剂量1.5mM碘乙酰胺(IOA)处理14min，将处理后的混合液于2000rpm离心5min，沉淀用原生质体洗涤液悬浮；按上述操作再用原生质体洗涤液洗涤2次，于2000rpm离心5min，沉淀再用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL。
大蕉供体原生质体的处理：将步骤(1)获得的供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL，放入培养皿，在皿底形成一薄层，以保证原生质体的厚度为1～2层细胞，将培养皿放在紫外灯管中心下方垂直8cm处照射120s；紫外灯功率20W、强度约为50μW/mm2。
(3)原生质体的不对称融合：将上述处理后的受体原生质体、供体原生质体，按体积比1∶1混合得到原生质体悬液。将混合后的原生质体悬液在培养皿中央铺成均匀圆形，直径约1.5～2.5cm，静置30min；在培养皿中央的原生质体悬液边缘处均匀滴加250μL浓度为30％(w/v)的PEG溶液，静置15min，促进原生质体融合；向培养皿中央的原生质体悬液边缘均匀滴加钙液500μL，静置10min；按上述操作重新滴加钙液1次，静置10min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；从原生质体悬液边缘加入1.5mL原生质体洗涤液，静置15min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；重复滴加-吸出原生质体洗涤液操作一次；从原生质体悬液边缘加入1.5mL原生质体液体培养基，静置10min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；再按上述操作加入1.52mL原生质体液体培养基；混匀，调整原生质体密度为105～106个/mL。
(4)融合产物的看护培养：取直径小于200μm的龙牙蕉ECS作为看护细胞，用双倍质量浓度的液体看护培养基调整看护细胞浓度为15mL PCV％(取15mL龙牙蕉ECS PCV用双倍质量浓度的看护培养基稀释到100mL)。将琼脂糖用蒸馏水调整浓度为1.2％(w/v)，pH5.6～5.8，高温高压灭菌(121℃、1.06kg/cm2下灭菌15min)。当琼脂糖溶液温度下降到30～35℃时，立即等体积混入上述的含15mL PCV％看护细胞的液体看护培养基中，搅匀，凝固后即成为厚度为4～8mm的固态看护细胞培养基，在其上覆盖一层消毒过的混合纤维素滤膜。将步骤(3)的融合产物转到混合纤维素滤膜上，在27±1℃、黑暗下培养，直到长出肉眼可见0.5～1.0mm的细胞团。
(5)从融合产物获得细胞团的体胚诱导：将体胚诱导培养基倒入培养皿中，凝固后，将在看护培养中获得的融合产物的细胞团转到体胚诱导培养基上，在27±1℃、黑暗下进行体胚诱导，直到获得直径约为1.0～1.5mm的成熟体胚。
(6)体胚的萌发与成苗：将成熟体胚转移到新鲜的体胚诱导培养基上，每隔20d继代一次直到体胚萌发。将芽高2～3cm的再生苗转移到促进植株发育的培养基中进行培养。培养条件为16h光照/8h黑暗光周期条件下进行，27±1℃。约1个月后可获得体细胞杂种植株。
(7)杂种植株的ISSR鉴定结果：如图4所示为龙牙蕉和大蕉原生质体不对称融合获得再生杂种植株的ISSR检测图。其中，M：DNA Marker，L：龙牙蕉；D：大蕉；图中1-21分别为龙牙蕉和大蕉的融合产物再生杂种植株；A：引物850；B：引物880。所用引物购自英骏(invitrogen)生物技术有限公司，引物序列参考文献(张青林和罗正荣，2004)
实施例3
本发明利用原生质体不对称融合技术获得巴西香蕉(Musa AAACavendish cv.Baxi)与大蕉[Musa paradisiaca Linn.cv.Da Jiao(ABB)]体细胞杂种，技术方案如图1所示：
(1)巴西香蕉受体原生质体的分离和纯化：取继代培养4d的巴西香蕉ECS，过筛后取直径200μm以下的ECS，按照细胞密实体积(PCV)与酶解液体积比例为1∶4进行混合，在27±1℃、黑暗下，40rpm震荡9h进行酶解。将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的筛网过滤，以便高效率的纯化原生质体。滤液于1800rpm离心6min，沉淀用原生质体洗涤液重新悬浮；再于1800rpm离心6min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，然后1800rpm离心6min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，得到巴西香蕉受体原生质体。
大蕉供体原生质体的分离和纯化：取继代培养4d的大蕉ECS，过筛后取直径200μm以下的ECS，按照细胞密实体积(PCV)与酶解液体积比例为1∶4进行混合，在27±1℃、黑暗下，40rpm震荡9h进行酶解。将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的筛网过滤，以便高效率的纯化原生质体。滤液经过1800rpm离心6min，沉淀用原生质体洗涤液重新悬浮；再经过1800rpm离心6min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，1800rpm离心6min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，得到大蕉供体原生质体。
(2)巴西香蕉受体原生质体的处理：将按照步骤(1)获得的香蕉受体原生质体采用最低致死剂量1.5mM碘乙酰胺(IOA)处理18min，将处理后的混合液于1800rpm离心6min，沉淀用原生质体洗涤液悬浮；按上述操作再用原生质体洗涤液洗涤1次，于1800rpm离心6min，沉淀再用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL。
大蕉供体原生质体的处理：将按照步骤(1)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL，放入培养皿，在皿底形成一薄层，以保证原生质体的厚度为1～2层细胞。将培养皿放在紫外灯管中心下方垂直8cm处进行辐射180s，紫外灯功率20W、强度约为50μW/mm2。
(3)原生质体不对称融合：将上述处理后的受体原生质体、供体原生质体，按1∶1体积比混合得到原生质体悬液。将混合后的原生质体悬液在培养皿中央铺成均匀圆形，直径约1.5～2.5cm，静置25min；在培养皿中央的原生质体悬液边缘处均匀滴加220μL浓度为40％(w/v)的PEG溶液，静置18min，促进原生质体融合；向培养皿中央的原生质体悬液边缘均匀滴加钙液450μL，静置12min；按上述操作重新滴加钙液1次，静置12min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；从原生质体悬液边缘加入1.2mL原生质体洗涤液，静置12min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；重复滴加-吸出原生质体洗涤液操作一次；从原生质体悬液边缘加入1.2mL原生质体液体培养基，静置10min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；再按上述操作加入1.2mL原生质体液体培养基；混匀，调整原生质体密度为105～106个/mL。
(4)融合产物的看护培养：取直径小于200μm的巴西香蕉ECS作为看护细胞，用双倍质量浓度的液体看护培养基调整看护细胞浓度为16mL PCV％(取16mL巴西香蕉ECS PCV用双倍质量浓度的看护培养基稀释到100mL)。将琼脂糖用蒸馏水调整浓度为1.2％(w/v)，pH5.6～5.8，高温高压灭菌(121℃、1.06kg/cm2下灭菌15min)。当琼脂糖溶液温度下降到30～35℃时，立即等体积混入上述含16mL PCV％看护细胞的液体看护培养基中，搅匀，凝固后即成为厚度为4～8mm的固态看护细胞培养基，在其上覆盖一层消毒过的混合纤维素滤膜。将上述步骤(3)的融合产物转到混合纤维素滤膜上，在27±1℃、黑暗下培养，直到长出肉眼可见0.5～1.0mm的细胞团。
(5)从融合产物获得细胞团的体胚诱导：将体胚诱导培养基倒入培养皿中，凝固后，将在看护培养中获得的融合产物的细胞团转到体胚诱导培养基上，在27±1℃、黑暗下进行体胚诱导，直到获得直径约为1.0～1.5mm的成熟体胚。
(6)体胚的萌发与成苗：将成熟体胚转移到新鲜的体胚诱导培养基上，每隔18d继代一次直到体胚萌发。将芽高2～3cm的再生苗转移到促进植株发育的培养基中进行培养。培养条件为16h光照/8h黑暗光周期条件下进行，27℃±1。约1个月后可获得体细胞杂种植株。
实施例4
本发明利用原生质体不对称融合技术获得贡蕉[Musa acuminata cv.Mas(AA)]与大蕉[Musa paradisiaca Linn.cv.Da Jiao(ABB)]体细胞杂种，技术方案如图1所示：
(1)贡蕉受体原生质体的分离和纯化：取继代培养4d的贡蕉ECS，过筛后取直径200μm以下的ECS，按PCV与酶解液体积比例为1∶4进行混合，在27±1℃、黑暗下，40rpm震荡9h进行酶解。将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的筛网过滤。滤液经过1800rpm离心6min，沉淀用原生质体洗涤液重新悬浮；再经过1800rpm离心6min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，1800rpm离心6min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，得到贡蕉受体原生质体。
大蕉供体原生质体的分离和纯化：取继代培养4d的大蕉ECS，过筛后取直径200μm以下的ECS，按细胞密实体积PCV与酶解液体积比例为1∶4进行混合，在27±1℃、黑暗下，40rpm震荡9h进行酶解。将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的筛网过滤。滤液经过1800rpm离心6min，沉淀用原生质体洗涤液重新悬浮；再经过1800rpm离心6min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，1800rpm离心6min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，得到大蕉供体原生质体。
(2)贡蕉受体原生质体的处理：将按照步骤(1)获得的贡蕉受体原生质体采用最低致死剂量1.5mM碘乙酰胺处理18min，将处理后的混合液于1800rpm离心6min，沉淀用原生质体洗涤液悬浮；按上述操作再用原生质体洗涤液洗涤1次，于1800rpm离心6min，沉淀再用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL。
大蕉供体原生质体的处理：将按照步骤(1)获得的大蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL，放入培养皿，在皿底形成一薄层，以保证原生质体的厚度为1～2层细胞。将培养皿放在紫外灯管中心下方垂直8cm处进行辐射120s，紫外灯功率20W、强度约为50μW/mm2。
(3)原生质体不对称融合：将上述处理后的受体原生质体、供体原生质体，按体积比1∶1混合得到原生质体悬液。将混合后的原生质体悬液在培养皿中央铺成均匀圆形，直径约1.5～2.5cm，静置25min；在培养皿中央的原生质体悬液边缘处均匀滴加220μL浓度为40％(w/v)的PEG溶液，静置18min，促进原生质体融合；向培养皿中央的原生质体悬液边缘均匀滴加钙液450μL，静置12min；按上述操作重新滴加钙液1次，静置12min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；从原生质体悬液边缘加入1.2mL原生质体洗涤液，静置12min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；重复滴加-吸出原生质体洗涤液操作一次；从原生质体悬液边缘加入1.2mL原生质体液体培养基，静置10min；沿原生质体悬液边缘吸出液体；再按上述操作加入1.2mL原生质体液体培养基；混匀，调整原生质体密度为105～106个/mL。
(4)融合产物的看护培养：取直径小于200μm的贡蕉ECS作为看护细胞，用双倍质量浓度的液体看护培养基调整看护细胞浓度为16mL PCV％。将琼脂糖用蒸馏水调整浓度为1.2％(w/v)，pH5.6～5.8，高温高压灭菌后，当琼脂糖溶液温度下降到30～35℃时，立即等体积混入上述含16mL PCV％看护细胞的液体看护培养基中，搅匀，凝固后即成为厚度为4～8mm的固态看护细胞培养基，在其上覆盖一层消毒过的混合纤维素滤膜。将步骤(3)的融合产物转到混合纤维素滤膜上，在27±1℃、黑暗下培养，直到长出肉眼可见0.5～1.0mm的细胞团。
(5)从融合产物获得细胞团的体胚诱导：将体胚诱导培养基倒入培养皿中，凝固后，将在看护培养中获得的融合产物的细胞团转到体胚诱导培养基上，在27±1℃、黑暗下进行体胚诱导，直到获得直径约为1.0～1.5mm的成熟体胚。
(6)体胚的萌发与成苗：将成熟体胚转移到新鲜的体胚诱导培养基上，每隔18d继代一次直到体胚萌发。将芽高2～3cm的再生苗转移到促进植株发育的培养基中培养。培养条件为16h光照/8h黑暗光周期条件下进行，27±1℃。约1个月后可获得体细胞杂种植株。
表4不同强度紫外线照射对香蕉原生质体不对称融合植株再生的影响(试验重复3次，取平均值)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)香蕉原生质体的分离和纯化：将继代培养3～5d、直径200μm以下的香蕉胚性悬浮细胞与酶解液混合，所述细胞密实体积与酶解液体积比例为1∶3～5，在27±1℃、黑暗条件下，30～50rpm震荡8～10h进行酶解；将酶解后的混合物分离纯化得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体；
(2)香蕉受体原生质体的处理：将步骤(1)获得的香蕉受体原生质体采用最低致死剂量的碘乙酰胺处理14～18min，将处理后的混合液用原生质体洗涤液洗涤2～3次，最后用原生质体液体培养基将处理过的原生质体稀释到浓度为105～106个/mL；
香蕉供体原生质体的处理：将步骤(1)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL，然后铺成薄层，在紫外灯下照射60～180s；
(3)原生质体的不对称融合：将步骤(2)处理后的受体原生质体和供体原生质体按1∶1体积比混合得到原生质体悬液；将原生质体悬液采用聚乙二醇融合法进行融合得到融合产物；
(4)融合产物的看护培养：将1.2％w/v、pH 5.6～5.8的琼脂糖溶液灭菌后，温度降到30～35℃时，等体积加入到含15～20mL细胞密实体积％看护细胞的液体看护培养基中搅匀，凝固后，在其上覆盖一层消毒过的混合纤维素滤膜，将步骤(3)的融合产物转到混合纤维素滤膜上，在27±1℃、黑暗下培养，直到长出0.5～1.0mm的融合产物的细胞团；所述看护细胞为直径小于200μm的香蕉胚性悬浮细胞；其中，所述的含15～20mL细胞密实体积％看护细胞的液体看护培养基是按下述方法配制：取15～20mL香蕉胚性悬浮细胞的细胞密实体积用双倍质量浓度的看护培养基稀释到100mL；所述的看护培养基组成为：MS盐+Morel维生素+440mg L-1肌醇+2mg L-1 2，4-D+554mg L-1葡萄糖+40g L-1蔗糖+95g L-1麦芽糖，pH 5.6～5.8，过滤灭菌；
(5)从融合产物获得细胞团的体胚诱导：将步骤(4)中获得的融合产物的细胞团转到体胚诱导培养基上，进行体胚诱导，得到直径为1.0～1.5mm的成熟体胚；
(6)体胚的萌发与成苗：将步骤(5)中诱导得到的成熟体胚转移到体胚诱导培养基上，每隔15～20d继代一次直到体胚萌发，得到再生苗，将芽高2～3cm的再生苗进行培养，即得到体细胞杂种植株；
所述的原生质体液体培养基组成为：基本培养基+1mgL-12，4-D+100mgL-1MES+72g L-1葡萄糖，过滤灭菌前pH为5.6～5.8；
所述的体胚诱导培养基组成为：基本培养基+0.5mgL-1 6-BA+0.4mg L-1IAA+3g L-1Gelrite，pH为5.6～5.8，高温高压灭菌；
所述基本培养基组成为：MS基本培养基+1mg L-1生物素+100mgL-1谷氨酰胺+100mg L-1麦芽提取物+45g L-1蔗糖。
2.根据权利要求1所述的一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，其特征在于：所述酶解液组成为：1.52％w/v KCl+0.98％w/v CaCl2+3.5％w/v纤维素酶R-10+1％w/v离析酶R-10+0.15％w/v果胶酶Y-23，pH5.6～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，其特征在于：所述的香蕉胚性悬浮细胞包括贡蕉胚性悬浮细胞、龙芽蕉胚性悬浮细胞、大蕉胚性悬浮细胞或巴西香蕉胚性悬浮细胞。
4.根据权利要求1所述的一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，其特征在于：所述紫外灯的功率20W、强度为50μW/mm2。
5.根据权利要求1所述的一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，其特征在于：所述步骤(1)中将酶解后的混合物分离纯化得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体是按下述方法进行的：将酶解后的混合物依次通过74μm、37μm、25μm的筛网过滤；将滤液于1500～2000rpm离心5～8min，沉淀用原生质体洗涤液悬浮；再于1500～2000rpm离心5～8min；沉淀用原生质体液体培养基悬浮，于1500～2000rpm离心5～8min，沉淀用原生质体液体培养基悬浮，即得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体；所述原生质体洗涤液组成为：1.52％w/v KCl+0.98％w/v CaCl2+100mg L-1MES+10％w/v甘露醇，pH5.6～5.8。
6.根据权利要求1所述的一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，其特征在于：所述步骤(2)中将处理后的混合液用原生质体洗涤液洗涤2～3次是按下述方法进行的：将处理液于1500～2000rpm离心5～8min，沉淀用原生质体洗涤液悬浮；再用原生质体洗涤液洗涤1～2次；所述原生质体洗涤液组成为：1.52％w/v KCl+0.98％w/v CaCl2+100mgL-1 MES+10％w/v甘露醇，pH5.6～5.8。
7.根据权利要求1所述的一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，其特征在于：所述步骤(3)中将原生质体悬液采用聚乙二醇融合法融合得到融合产物是按下述方法进行的：将原生质体悬液铺成均匀圆形，直径约1.5～2.5cm，静置20～30min；在原生质体悬液边缘处均匀滴加200～250μL聚乙二醇溶液，静置15～20min，促进原生质体融合；再向原生质体悬液边缘均匀滴加钙液400～500μL，静置10～15min；按上述操作重新滴加钙液1次，静置10～15min；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加1～1.5mL原生质体洗涤液，静置10～15min；然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体洗涤液；重复滴加-吸出原生质体洗涤液操作一次；在原生质体悬液边缘滴加1～1.5mL原生质体液体培养基，静置10～15min；然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基；再加入1～1.5mL原生质体液体培养基；混匀，调整原生质体密度为105～106个/mL，得到融合产物；所述的聚乙二醇溶液组成为：2％w/v葡萄糖+1.5％w/v Ca(NO3)2+20～40％w/v聚乙二醇，pH 7.0；所述的钙液组成为：4.5％w/v Ca(NO3)2，pH 7.0。
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| CN101139582A (zh) | 2008-03-12 |
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