CN1144517C

CN1144517C - 不结球白菜非对称细胞融合获得再生植株的方法

Info

Publication number: CN1144517C
Application number: CNB991141253A
Authority: CN
Inventors: 侯喜林; 曹寿椿
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 1999-03-29
Publication date: 2004-04-07
Anticipated expiration: 2019-03-29
Also published as: CN1232608A

Abstract

本发明属于不结球白菜非对称细胞融合方法及其获得的再生植株，专用于新种质的创建。包括：原生质体的制备、OguCMS下胚轴原生质体核失活处理、保持系子叶原生质体的钝化处理(线粒体)、非对称原生质体的电融合和融合产物的培养。获得再生植株后代98H秋-45为新种质，其不育率、不育度均为100%，低温下苗期叶片不黄化，结实率与保持系相同，并极显著高于原不育材料；经PCR扩增cpDNA和mtDNA的电泳证实为体细胞杂种。

Description

不结球白菜非对称细胞融合获得再生植株的方法

一、技术领域

本发明属于一种不结球白菜非对称细胞融合及其获得的再生植株，专用于不结球白菜胞质雄性不育体细胞杂种新种质的创建。

二、技术背景

Ogura不育源是小仓于1968年在日本鹿儿岛一个萝卜品种留种田中发现的雄性不育个体(表现花蕾小，花柱弯曲，雄蕊瓣状化)，后经选育而成不育系。通过大量试验证明，其不育性是由细胞质基因和2对隐性细胞核基因共同控制，但不具有育性恢复基因。因小仓的拉丁语为Ogura，故把萝卜细胞质不育源称为Ogu CMS源。Ogu CMS现已传遍全世界，用于十字花科作物的雄性不育利用研究，在油菜上主要解决低温缺绿和育性恢复基因问题，在蔬菜作物上(甘蓝、大白菜、不结球白菜、花椰菜)主要解决低温缺绿和无蜜腺问题。

不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)原产中国，近年来，东南亚、日、美及欧洲等国广泛引种，已逐渐成为世界性蔬菜。我校蔬菜研究所自70年代中期以来，在国内外率先选育和利用雄性不育两用系进行制种，并先后育成“矮杂”、“矮抗”系列优良杂种大面积推广应用于生产，但两用系制种法拔除可育株不仅费工、费时、增加成本，且不易保证杂种纯度。而利用不结球白菜细胞质雄性不育系(CMS)则可以克服这些缺点。经由萝卜胞质不育转育获得的不结球白菜(CMS)系统却由于苗期低温黄化和花器蜜腺发育不良而难以应用于生产。研究表明，苗期黄化是该CMS系应用上的主要障碍，它主要是因为萝卜胞质与不结球白菜核之间的不协调而引起的不良反映。

我国的蔬菜原生质体融合研究不多，仅在胡萝卜和芹菜、甘蓝和大白菜、西瓜与甜瓜及野生甜瓜与栽种甜瓜之间已有报道，但没有再生成植株。叶志彪曾对核失活的萝卜OguCMS与细胞质受抑制的甘蓝类(花椰菜)原生质体进行了融合研究，用化学方法(PEG)诱导的融合，细胞分裂能力弱，不能再生出植株；用电融合的原生质体则再生出植株，但仍未见获得体细胞杂种的报道。美国E.Earle等人对源于OguCMS甘蓝不育材料已利用细胞融合的方法进行了改良，已基本上解决了苗期低温黄化的问题，但从方智远等人的报道中得知，将上述不育材料引入国内后观察，萝卜胞质甘蓝雄性不育系依然存在蜜腺小、不能正常吸引昆虫授粉以及花器官异常等缺陷。

三、发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供一种非对称细胞融合方法，获得体细胞杂种并再生植株，为创建不结球白菜胞质雄性不育新种质奠定基础。

技术方案：本发明所提供的不结球白菜非对称细胞融合获得再生植株方法：

1)原生质体的制备：取5d苗龄的不结球白菜OguCMS下胚轴和14～18d苗龄的保持系子叶，分别在1.0～2.0g/100ml纤维素酶+0.1～1.0g/100ml果胶酶+10mMCaCl₂·2H₂O+0.7mMKH₂PO₄+0.5M甘露醇的酶液中游离25～60h，500rpm下离心收集原生质体。

2)OguCMS下胚轴原生质体核失活处理：将获得的OguCMS下胚轴原生质体，调整其密度为1.5×10⁵个/ml，分装在小玻璃指形管中，10滴/管，以剂量率为15Gy/min的⁶⁰Co照射。设6种γ射线剂量100～350Gy为照射处理，以不照射为对照。辐照后5d，观察原生质体活力。

3)保持系子叶原生质体的钝化处理(线粒体)：碘乙酰胺(IOA)处理，IOA溶解于融合液(含0.5M甘露醇，0.5mMCaCl₂·2H₂O的重蒸水溶液)中，配成100mM的母液，用1NNaOH调pH为5.8，抽滤灭菌。使用时，在原生质体离心除去酶液后将适量的母液加入洗液中，调至所需浓度，在25℃条件下处理20min(包括离心所需的5min)，融合液洗涤两次备用。诺丹明(R-6G)溶解于含10.0g/100ml二甲基亚砜(DMSO)的融合液中，配成1mg/ml的母液，抽滤灭菌，处理方法同IOA，处理时间为30min(包括离心所需时间)。

4)非对称原生质体的电融合和融合产物的培养：将核失活的OguCMS下胚轴原生质体与钝化线粒体后的保持系子叶原生质体按体积比1∶1的比例混合，在融合电极间进行融合。融合产物与等量的2倍改良KM8P培养基混合后，进行液体浅层培养或包埋培养，60h左右进行第一次分裂，前2周为暗培养，之后于散射光下培养，1个月后获得肉眼可见的愈伤组织，并将其增殖，转移到分化培养基中分化出不定芽，不定芽生根后，形成完整幼苗，经炼苗后，转移到盆钵中栽培，选出ZS₂、ZS₆、ZS₈三株不育，用保持系花粉授粉，分别收获种子。

上述不结球白菜非对称细胞融合方法获得的再生植株，其特征在于：该材料的不育率、不育度均为100％，低温下苗期叶片不黄化，并有4个蜜腺，自然条件下结实率与保持系相同，并极显著高于原不育材料；细胞核染色体为2n＝20，与保持系相同；胚根和子叶的POD同工酶与保持系和原不育系有显著差异，EST同工酶在下胚轴中差异较大；叶绿体DNA和线粒体DNA总量介于保持系和原不育材料二者之间，经PCR扩增叶绿体NDA和线粒体DNA的电泳证实其为体细胞杂种，其后代98H秋-45为不结球白菜胞质雄性不育种质。

有益效果：本发明所用植物OguCMS不育材料为91H秋～100(90H秋～88×90H秋～89)，低温下黄化，无蜜腺；保持系为91H秋～21(90H秋～89)。采用南京农业大学细胞遗传研究所研制的“南京CY-II”型细胞融合仪，其交流输出电压为0～40V，频率50～2000KHz；直流方波脉冲电压为0～500V，脉冲幅宽5μs～2ms，脉冲次数1～9次可调。电极为两块平行放置的铜片嵌在25×76mm的光滑有机玻璃中，电极间距为2mm，容积为100μl，使用时将电极浸泡在75％酒精中30min，取出后用无菌重蒸水洗3次，融合液洗1次，备用。

国内外研究表明，芸薹属的CMS特性(如油菜、甘蓝、结球白菜)均与线粒体有关。而线粒体控制的CMS性的产生，则可能导致叶绿体DNA发生相应的变化，因此异源胞质系统发育上最常见的异常现象就是叶绿素缺乏症和雄性不育，这些异常可能是核与异源胞质之间功能性不亲和的结果。国内外众多研究者试图通过常规手段从芸薹属作物品种中去筛选“缺绿”的校正基因和CMS性状的恢复基因以改变胞质遗传背景，结果均告失败。这是因为通过有性杂交，杂种的细胞质几乎全由母本提供，其结果有两种：①后代的胞质得不到改善；②完全改变，从而导致不育性的丧失。因此必须采用既能保持不育胞质，又能使胞质背景得到一定程度改变的特殊手段，利用非对称细胞融合获得“胞质杂种”正是有希望的手段之一。本发明通过具有正常叶绿体基因组的不结球白菜与带有萝卜胞质的不结球白菜雄性不育材料进行非对称细胞融合，创造出胞质型不育新种质，进而填补了国内外空白。

植物原生质体融合技术从70年代初诞生以来，人们就注意到它在创造新种质方面的潜力，而试图将其用于育种实践。本发明将OguCMS下胚轴原生质体与保持系子叶原生质体融合，获得了有利用价值的植株，是一次有益的尝试。再生植株ZS₆(A)与保持系授粉，其10株后代全部不育，在低温条件下也不黄化。一对一融合技术实为集原生质体融合、杂种细胞筛选、异核体培育成再生植株等过程于一体的实验体系。它具有程序简便、效率高的特点，最有希望成为能直接用于育种的简便途径。

原生质体融合作为植物的杂交手段，将会有效地应用于作物改良和新品种选育，日益受到人们的重视。通过胞质基因组的转移，与相应的保持系形成“胞质杂种”，便能向萝卜胞质掺入正常的不结球白菜胞质，以改善胞质与核的协调性，从而使其既保持CMS特性，又克服原有苗期低温黄化缺陷，并经过严格的鉴定筛选，便有希望获得无黄化、有蜜腺的CMS系。

四、具体实施方式

采用的植物材料，OguCMS不育材料为91H秋～100(90H秋～88×90H秋～89)，低温下黄化，无蜜腺；保持系为91H秋～21(90H秋～89)。采用南京农业大学细胞遗传研究所研制的“南京CY-II”型细胞融合仪，其交流输出电压为0～40V，频率50～2000KHz；直流方波脉冲电压为0～500V，脉冲幅宽5μs～2ms，脉冲次数1～9次可调。电极为两块平行放置的铜片嵌在25×76mm的光滑有机玻璃中，电极间距为2mm，容积为100μl，使用时将电极浸泡在75％酒精中30min，取出后用无菌重蒸水洗3次，融合液洗1次，备用。具体操作步骤如下：

2)OguCMS下胚轴原生质体核失活处理：将获得的OguCMS下胚轴原生质体，调整其密度为1.5×10⁵个/ml，分装在小玻璃指形管中(10滴/管)，以剂量率为15Gy/min的⁶⁰Co照射。设6种γ射线剂量100～350Gy为照射处理，以不照射为对照。辐照后5d，观察原生质体活力。

3)保持系子叶原生质体的钝化处理(线粒体)：碘乙酰胺(IOA)处理，IOA溶解于融合液(含0.5M甘露醇，0.5mMCaCl2·2H2O的重蒸水溶液)中，配成100mM的母液，用1NNaOH调pH为5.8，抽滤灭菌。使用时，在原生质体离心除去酶液后将适量的母液加入洗液中，调至所需浓度，在25℃的条件下处理20min(包括离心所需的5min)，融合液洗涤两次备用。诺丹明(R-6G)处理，R-6G溶解于含10.0g/100ml二甲基亚砜(DMSO)的融合液中，配成1mg/ml的母液，抽滤灭菌，处理方法同IOA，处理时间为30min(包括离心所需的时间)。

4)非对称原生质体的电融合和融合产物的培养：将核失活的OguCMS下胚轴原生质体与钝化线粒体后的保持系子叶原生质体按体积比1∶1的比例混合，在融合电极间进行融合。融合产物与等量的2倍改良KM8P培养基混合后，进行液体浅层培养或包埋培养，60h左右进行第一次分裂，前2周为暗培养，之后于散射光下培养，1个月后获得肉眼可见的愈伤组织，并将其增殖，转移到分化培养基中分化出不定芽，不定芽生根后，形成完整幼苗，经炼苗后，转移到盆钵中栽培，驯化后栽培成活8株，选出ZS₂、ZS₆、ZS₈三株不育，用保持系花粉授粉，分别收获种子。

对上述不结球白菜非对称细胞融合方法获得的再生植株ZS6的后代植株进行田间和实验室鉴定表明，该材料的不育率、不育度均为100％，低温下苗期叶片不黄化，并有4个蜜腺，自然条件下结实率与保持系相同，并极显著高于原不育材料；细胞核染色体为2n＝20，与保持系相同；胚根和子叶的POD同工酶与保持系和原不育系有显著差异，EST同工酶在下胚轴中差异较大；叶绿体DNA和线粒体DNA总量介于保持系和原不育材料二者之间，经PCR扩增叶绿体DNA和线粒体DNA的电泳证实ZS₆(A)₁₀为体细胞杂种，其后代98H秋-45为不结球白菜胞质雄性不育种质。

Claims

1.一种不结球白菜非对称细胞融合获得再生植株方法，其特征在于：

1)原生质体的制备：取5d苗龄的不结球白菜OguCMS下胚轴和14～18d苗龄的保持系子叶，分别在1.0～2.0g/100ml纤维素酶+0.1～1.0g/100ml果胶酶+10mMCaCl₂·2H₂O+0.7mMKH₂PO₄+0.5M甘露醇的酶液中游离25～60h，500rpm下离心收集原生质体；

2)OguCMS下胚轴原生质体核失活处理：将获得的OguCMS下胚轴原生质体，调整其密度为1.5×10⁵个/ml，以剂量率为15Gy/min的⁶⁰Co照射，以不照射为对照，OguCMS下胚轴原生质体的核失活剂量为100～150Gy；

3)保持系子叶原生质体线粒体的钝化处理：诺丹明溶解于含10.0g/100ml二甲基亚砜的融合液中，配成1mg/ml的母液，用1NNaOH调pH为5.8，抽滤灭菌，使用时调至所需浓度，在25℃的条件下处理30min，融合液洗涤两次备用；

4)非对称原生质体的电融合和融合产物的培养：将核失活的OguCMS下胚轴原生质体与钝化线粒体后的保持系子叶原生质体按体积比1∶1的比例混合，在融合电极间进行融合，融合产物与等量的2倍改良KM8P培养基混合后，进行液体浅层培养或包埋培养，60h左右进行第一次分裂，前2周为暗培养，之后于散射光下培养，1个月后获得肉眼可见的愈伤组织，并将其增殖，转移到分化培养基中分化出不定芽，不定芽生根后，形成完整幼苗，经炼苗后，转移到盆钵中栽培，选出其中的不育株用保持系花粉授粉，分别收获种子。

2.根据权利要求1所述不结球白菜非对称细胞融合方法获得的再生植株，其特征在于：所述不育株的不育率、不育度均为100％，苗期叶片不黄化，并有4个蜜腺，其后代为不结球白菜胞质雄性不育种质。