CN1108096C - 不结球白菜原生质体培养及再生植株方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物原生质体培养及植株再生方法，专用于不结球白菜原生质体培养再生植株。所提供的不结球白菜原生质体培养及植株再生方法具体步骤如下：取5天苗龄的不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴或14～18天苗龄子叶，在1.0～2.0%(M/V)纤维素酶+0.1～1.0%(M/V)果胶酶+10mMCaCl2·2H2O+0.7mMKH2PO4+0.5M甘露醇的酶液中游离25～60hr，500rpm下离心收集原生质体；原生质体在KM8P1+2，4-D0.5mg/L+6-BA0.25mg/L+NAA0.5～1.0mg/L的培养基上，培养3周形成愈伤组织；经MS+2，4-D1.0mg/L增殖愈伤组织；在培养基为MS+6-BA10.0mg/L+NAA0.3mg/L上芽分化。将上述分化芽在MS培养基上生根，2周后即可获得完整的再生植株。使用该方法，植株再生率为1.8%。
Description
一、技术领域
本发明属于植物原生质体培养及植株再生方法，专用于不结球白菜原生质体培养再生植株。
二、技术背景
十字花科蔬菜具有非常明显的杂种优势，利用胞质雄性不育系制种则是杂种优势利用最经济且有效的根本途径，故世界各国都特别重视对细胞质雄性不育的研究和利用。近20年来，国内外在十字花科作物上发现和培育出多种不同来源的细胞质雄性不育类型，而研究最多、利用最广泛的是Ogu CMS(萝卜细胞质雄性不育)和PolCMS(波里马细胞质雄性不育)。不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)原产中国，近年来，东南亚、日、美及欧洲等国广泛引种，已逐渐成为世界性蔬菜。我校蔬菜研究所自70年代中期以来，在国内外率先选育和利用雄性不育两用系进行制种，并先后育成“矮杂”、“矮抗”系列优良杂种大面积推广应用于生产，但两用系制种法拔除可育株不仅费工、费时、增加成本，且不易保证杂种纯度。而利用不结球白菜细胞质雄性不育系(CMS)则可以克服这些缺点。故对其原生质体培养进行研究具有重要的理论和实践意义。在芸薹属植物中，Kartha等(1974)首次培养油菜叶肉原生质再生植株后，直到80年代中期才在甘蓝、芥菜、芥蓝、大白菜上取得突破，培养技术日趋完善，但不结球白菜叶肉、下胚轴和根原生质体培养未能再生植株。Ogura不育源是小仓于1968年在日本鹿儿岛一个萝卜品种留种田中发现的雄性不育个体(表现花蕾小，花柱弯曲，雄蕊瓣状化)，后经选育而成不育系。通过大量试验证明，其不育性是由细胞质基因和2对隐性细胞核基因共同控制，但不具有育性恢复基因。因小仓的拉丁语为Ogura，故把萝卜细胞质不育源称为Ogu CMS源。Ogu CMS现已传遍全世界，用于十字花科作物的雄性不育利用研究。
三、发明内容
技术问题：针对上述现有技术中存在的缺陷，提供一种不结球白菜原生质体培养及植株再生方法，使得不结球白菜叶肉和下胚轴原生质体培养能再生植株。
技术方案：本发明所提供的不结球白菜原生质体培养及再生植株方法，其具体步骤如下。
1)取5天苗龄的不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴或14～18天苗龄的子叶，在1.0～2.0％(M/V)纤维素酶+1.0％(M/V)果胶酶+10mMCaCl2·2H2O+0.7mMKH2PO4+0.5M甘露醇的酶液中游离25～60hr，500rpm下离心收集原生质体；
2)原生质体在KM8P1+2，4-D0.5mg/L+6-BA0.25mg/L+NAA0.5～1.0mg/L的培养基上，培养3周形成愈伤组织；
3)经MS+2，4-D1.0mg/L增殖愈伤组织；
4)在培养基为MS+6-BA10.0mg/L+NAA0.3mg/L上分化芽。
5)将上述分化芽在MS培养基上生根，2周后即可获得完整的再生植株。
有益效果：本发明所提供的不结球白菜原生质体培养及植株再生方法，植株再生率为1.8％。再生植株经驯化炼苗移入营养钵中，并套塑料袋保湿，一周后去掉塑料袋，再培养15天左右，移栽到大花钵中让其充分生长、现蕾、开花。近年来，芸薹属芸薹种中的菜心、红菜薹、花椰菜、均已从原生质获得再生植株，但在普通白菜中一直没有成功，故被认为是芸薹属芸薹种中最难再生植株的植物之一。本发明在国内外首次报道了不结球白菜子叶原生质体和萝卜细胞质雄性不育下胚轴原生质体培养均能再生植株。根据本发明所提供的实验结果，在下胚轴原生质体的培养过程中苗龄对其影响最大；其次，生长素和细胞分裂素必须按一定比例组合，比例不当不利于细胞的分裂和生长。
四、具体实施方式
(一)实施例1：不结球白菜子叶原生质体培养
1)供试材料为91H秋-21(保持系)，种子先流水冲洗10～20min，用70％的酒精消毒1min，在0.1％HgCl2溶液中浸30min后，再用无菌水洗5次，播种在MS培养基上，在25℃恒温条件下发芽。
2)取14～18天苗龄的子叶，切成2mm宽的细条，置于5种酶液中，在25℃黑暗条件下，经26、36、46、56hr消化，原生质体悬浮液用50μ尼龙筛过滤，离心15min(500rpm)，弃上清液后，加入CPW洗液离心洗涤3次，纯化的原生质体用改良KM8P培养基悬浮，并用0.1％酚藏红花染色，测定原生质体活力。
3)子叶原生质体培养设6种培养基：①MS；②B5；③DPD；④mKM8P；⑤DPD1：改良的DPD培养基--B5有机+2，4-D0.1mg/L+6-BA0.5mg/L；⑥KM8P1：改良的KM8P培养基--B5微量元素+KM8P有机成份、有机酸、糖醇+葡萄糖9.0％(M/V)+蔗糖1.0％(M/V)+半乳糖0.03％(M/V)+2，4-D0.5mg/L+NAA0.5mg/L+6-BA0.25mg/L；①～⑤的培养基，甘露醇均为0.45M；①～④培养基均附加2，4-D0.1mg/L+6-BA1.0mg/L。分别进行包埋(加1.2％低融点琼脂糖)和浅层液体培养，原生质体培养密度为1～1.5×105个/ml。
4)原生质体先在黑暗条件下培养，再转到弱光下培养，8天后补加少量新鲜培养基(共3次，甘露醇含量依次降到0.3M、0.15M、OM)。在培养后第5、10、15、和20天统计分裂频率。
5)将1～2mm大小的微愈伤颗粒转移至MS+2，4-D1.0mg/L和MS+2，4-D0.2mg/L+KT0.5mg/L固体培养基上增殖形成愈伤组织后到MS+6-BA10.0mg/L+NAA0.1mg/L；MS+ZT1.0mg/L+GA30.1mg/L和MS+Zea10.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基上诱导芽分化。
6)将伸长的芽转到无激素的MS培养基上，2周后生根，从而获得完整的再生植株。
(二)实施例2：不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体培养
1)采用南京农业大学园艺系白菜课题组经多代回交转育的萝卜细胞质雄性不育(91H秋-100)(BC7)为试材，无菌播种后，暗培养，取3、5、7、9、11、13、16天苗龄的下胚轴(先纵切一刀，再切成2mm长的段)分离原生质体，以2.0％(M/V)纤维素酶+1.0％(M/V)果胶酶+10mMCaCl2·2H2O，0.7mMKH2PO4+0.5M甘露醇的酶液游离原生质体，原生质体的清洗和收集均以500rpm离心。
2)在改良的KM8P附加2，4D0.5mg/L+NAA1.0mg/L+6-BA0.25mg/L培养基上，培养3周即形成肉眼可见的愈伤组织，5周左右即可达1mm大小。
3)在MS+2，4-D 1.0mg/L培养基上增殖愈伤组织，芽分化培养基为MS+6-BA10.0mg/L+NAA0.3mg/L。
4)生根培养基为MS。
实施结果如下：
1.原生质体游离
1)酶液浓度的影响：从表1中可以看出，1.0％(M/V)纤维素酶+0.1％(M/V)果胶酶酶解46hr，子叶原生质体产量和分裂频率均最高，而褐化及破碎率则较低。0.8％(M/V)纤维素酶+0.1％(M/V)果胶酶的处理，各项指标居第2位。在纤维素酶1.5％(M/V)+果胶酶0.2％(M/V)和纤维素酶1.0％(M/V)十果胶酶1.0％(M/V)的处理中，虽然完全去壁率达100％，但褐化及破碎较多，故产量和分裂频率明显降低。
2)酶解时间的影响：在1.0％(M/V)纤维素酶和0.1％(M/V)果胶酶的酶液浓度条件下，子叶原生质体与萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体的游离时间分别以46hr和36hr为佳，表现产量高，去壁完全及存活率高等综合优良效果。
3)苗龄对萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体游离的影响：结果表明，以5天苗龄的下胚轴分离原生质体的效果最好，其产量为2～3×106个/g，培养10天后的分裂频率为11.5％，均达最高；苗龄3天的次之，分别为1～2×106个/g和8.0％；苗龄7天后，则显著降低，分别为3～4×103个/g和3.5％；苗龄超过9天后，则分别降至3.0×102个/g和0.0％，已不能用作分离原生质体的材料。
4)离心速率的影响：在1500rpm下离心，原生质体大量破裂，产量不高，1000rpm速率下，破裂原生质体明显减少，产量有所提高(4×104个/g)；而在500rpm条件下，无论是子叶还是下胚轴原生质体破碎均较少，收集效果佳，产量可达104～106个/g。
2.原生质体培养
1)子叶原生质体培养：结果表明，在适宜的培养条件下，不结球白菜子叶原生质体培养1～2天即可开始第一次分裂，5～6天第二次分裂，很快形成细胞团，20天已形成球状或星状细胞团，1个月后即形成肉眼可见的愈伤组织。从不同培养基对培养效果的影响来看(表2)，KM8P1不仅原生质体分裂频率高，而且无褐化；mKM8P培养基，20天后的原生质体分裂频率为38.0％并有轻度褐化；MS、B5、DPD、DPD14种培养基，培养20天后原生质体分裂频率为5.0～11.5％，褐化程度中等～严重；可见，改良的KM8P1培养基最适于不结球白菜子叶原生质体的培养。
2)不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体培养：在12个激素处理组合中，下胚轴原生质体分裂表现不同(表3)，6-BA0.25mg/L+NAA1.0mg/L下胚轴原生质体分裂最旺盛；6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L原生质体也有较高的分裂频率；6-BA0.25mg/L和NAA分别为0.5、1.5、2.0mg/L的组合以及6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L的组合，原生质体分裂频率低：6-BA0.5mg/L和NAA分别为1.5、2.0mg/L的组合以及6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L的组合，原生质体分裂频率极低；其它3个处理组合，不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体均无细胞分裂。
下胚轴原生质体培养，48hr左右开始分裂，5天左右即可见到2～3次分裂。下胚轴原生质体在培养中也要形成若干个正常的集落，不形成集落者则易沉底、破裂或褐化，以至不能形成细胞团。萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体在KM8P1附加6-BA0.25mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D0.5mg/L的培养基上再生新壁和分裂启动快，分裂频率均高于其它组合，是进行不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体培养的最佳培养基。
3.愈伤组织的增殖
试验表明，不结球白菜子叶原生质体形成的愈伤组织在MS+2，4-D0.2mg/L+KT0.5mg/L培养基上生长迅速，结构致密，且具绿点，这些绿点易形成绿色愈伤组织，并且易分化出芽、叶等器官。而萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体形成的愈伤组织则在MS+2，4-D1.0mg/L培养基上增殖效果好，这表明2，4-D对愈伤组织的增殖极为重要，在不含2，4-D或含较高浓度(1.5～2.0mg/L)、较低浓度(0.2～0.5mg/L)的培养基上，愈伤组织的生长滞缓，故在不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体愈伤组织增殖阶段，必须严格控制2，4-D的浓度为1.0mg/L。
4.不定芽形成及植株再生
愈伤组织在分化培养基上，20天左右即形成不定芽，但下胚轴原生质体的愈伤组织比子叶原生质体的愈伤组织较难形成不定芽。子叶原生质体愈伤组织在MS+6-BA10.0mg/L+NAA0.1mg/L，MS+KT1.0mg/L+GA30.1mg/L，MS+Zea10.0mg/L+NAA0.1mg/L的分化培养基上，均能分化出不定芽，分化率分别为11.5％、6.5％、8.0％，平均分化芽数分别为1.3、1.0、1.0个。下胚轴原生质体愈伤组织在10种分化培养上(表4)，不定芽分化率很低，且分化的均为单芽。6-BA10.0mg/L+NAA0.3mg/L培养基的芽分化率最高，也只有5.5％；6-BA10.0mg/L与NAA0.2、0.4的组合以及6-BA5.0mg/L+NAA0.3mg/L培养基，不定芽分化率分别为1.0％、3.0％、0.8％，其它6个处理组合均不分化芽。
将子叶原生质体和不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴原生质体形成的不定芽，接种在不含任何激素的MS培养基上生根，两者间无明显差异。2周后生根，即可获得完整植株，植株再生率为1.8％。再生植株经驯化炼苗移入营养钵中，并套塑料袋保湿，一周后去掉塑料袋，再培养15天左右，移栽到大花钵中让其充分生长、现蕾、开花。
表1 酶液浓度对不结球白菜子叶原生质体游离效果的影响纤维素酶 果胶酶 原生质体产量 完全去壁率 分裂频率 褐化及破碎率(％，M/V) (％，M/V) (个数/g，叶) (％) (％) (％)1.5 0.2 2.5×104 100 8.5 30.01.0 1.0 2.0×104 100 3.5 33.01.0 0.5 2.5×104 78 13.0 21.51.0 0.1 2.0×105 96 14.5 6.50.8 0.1 1.5×105 94 11.5 5.0注：5种酶液均附加10mMCaCl2·2H2O+0.7mMKH2PO4+0.5M甘露醇；解离时间46hr，离心速率500rpm；原生质体产量以“血球计数板”统计，重复3次；分裂频率、褐化率在培养15天后统计。
表2 不结球白菜子叶原生质体不同培养上的培养效果
分裂频率(％)培养基 褐化程度
5天 10天 15天 20天MS 0 1.5 3.0 5.5 +++B5 0.5 3.0 4.5 7.5 +++DPD 1.5 5.0 8.5 11.5 ++DPD1 0 1.0 3.0 5.0 +++mKM8P 2.0 5.5 18.5 38.0 +KM8P1 5.0 12.5 28.5 53.5 -注：浅层液体培养；-为无褐化，+轻度褐化，++中等程度褐化，+++严重褐化。
表3 不同激素处理组合对不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料
下胚轴原生质体培养的影响6-BA NAA(mg/L)(mg/L) 0.5 1.0 1.5 2.00.25 ++ ++++ ++ ++0.50 ++ +++ + +1.0 + - - -注：基本培养基为KM8P1，均附加2，4-D0.5mg/L。-.无分裂；+.2～5个细胞，分裂频率极低；++.6～10个细胞，分裂频率低；+++.11～15个细胞，分裂频率高；++++.16～20个细胞，分裂频率极高。培养后20天调查。
表4 6-BA和NAA浓度对不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料
下胚轴原生质体愈伤组织不定芽形成的影响
分化率(％)6-BA NAA(mg/L)(mg/L) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.510.0 0 1.0 5.5 3.0 05.0 0 0 0.8 0 0注：基本培养基为MS。
Claims (2)
1.不结球白菜原生质体再生植物的方法，具体步骤如下：
1)取5天苗龄的不结球白菜萝卜细胞质雄性不育材料下胚轴或14～18天苗龄的子叶，在1.0～2.0％(M/V)纤维素酶+1.0％(M/V)果胶酶+10mMCaCl2·2H2O+0.7mMKH2PO4+0.5M甘露醇的酶液中游离25～60hr，500rpm下离心收集原生质体；
2)原生质体在KM8P1+2，4-D0.5mg/L+6-BA0.25mg/L+NAA0.5～1.0mg/L的培养基上，培养3周形成愈伤组织；
3)经MS+2，4-D1.0mg/L增殖愈伤组织；
4)在培养基为MS+6-BA10.0mg/L+NAA0.3mg/L上形成不定芽。
2.根据权利要求1所述不结球白菜原生质体再生植物的方法，是将上述不定芽在MS培养基上生根，2周后即可获得完整的再生植株。
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