CN116941532B - 一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，本发明采用白菜中的代表品种“苏州青”作为材料，将切丝后的叶片置于100000～150000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场，处理5～35min，再将叶肉细胞原生质体再生形成完整植物。本发明显著增加了原生质体细胞产量，显著增强了原生质体活性，提高了原生质体再生率，促进了再生植株生长，为不结球白菜种质培育奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法。
背景技术
等离子体是物质存在的第四种状态，是由正负离子、自由电子、离子自由基和各种活性基团构成，整体呈电中性，产生的活性氧、氮、紫外光子及高频电磁场可以穿透种子外壳并改变其表面性质。在植物研究领域发现利用低温等离子体处理，可加快种子萌发和胚根生长速度，同时植株幼苗会产生生理和表型变化。如等离子体处理胡麻种子可以促进种子在NaCl胁迫下的萌发率，可以降低质膜相对透性、叶绿素含量、类胡萝卜素含量、MDA含量，提高POD活性及可溶性蛋白含量。等离子体处理对开花和果实产量也会产生影响，如在油菜成熟期用低温等离子体诱变后，荚数和粒重都显著增加；利用低温等离子体处理会增加菊苣的花数和鲜重；在甜瓜中也发现等离子体处理可以增加甜瓜的开花数和直径，从而提高甜瓜产量和质量。等离子体处理能使番茄色泽指数显著增高、硬度增大，生物产量提高，类胡萝卜素和总酚含量显著降低。CN201710418337.8提出了使用低温等离子体对灵芝的原生质体进行诱变，然后筛选获得诱变品质更为优良的灵芝菌株。与传统技术相比，低温等离子体处理技术操作较为简便易行，应用成本较低，且对环境十分友好，在未来农业发展领域具有很高的应用价值。但利用低温等离子体处理植物材料提高原生质体活力，促进原生质体再生的研究未见报道。
不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)俗称“白菜”，起源于中国，栽培历史悠久，为一、二年生草本植物，以叶片为产品，属于十字花科芸薹属不结球白菜亚种，其中以苏州青为代表的普通白菜最为重要，栽培面积占该亚种的80％以上，是我国栽培面积最广泛，老百姓最喜爱的蔬菜之一，近年来，东南亚、日韩、欧美等国广泛引种，已逐渐成为世界性蔬菜，具有很高的经济效益。虽然常规育种育出了许多不结球白菜的优秀品种如：“黄玫瑰白菜”“紫秀丽006”“粉甘1号”等，但周期长；随着技术的发展，细胞工程育种育种作为创造优秀种质资源的重要细胞工程技术，在很多蔬菜菜的遗传育种中扮演了非常重要的角色，如胡萝卜、番茄、甘蓝等蔬菜，但在不结球白种质资源上菜的运用较少。特别是将低温等离子体技术和细胞工程技术相结合，运用于作物的种质资源培育在国内外属于一片空白。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，可以显著增加原生质体细胞产量，显著增强了原生质体活性，提高原生质体再生率，促进了再生植株生长，为不结球白菜种质培育奠定了基础。。
技术方案：本发明的提供了一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，将植物叶片置于低温等离子体电场下处理后，再将叶肉细胞原生质体再生形成完整植物。
优选的，所述离子体电场为100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场，叶片在离子体电场下处理时间为5～10min。
优选的，所述本发明所述的植物为十字花科芸薹属植物；优选的，所述植物为不结球白菜亚种。
作为本发明的一个实施方式：本发明中所述叶片为不结球白菜的叶片。
本发明的一个方面，本发明提供了一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，包括以下步骤：
(1)叶片切丝：选择植物的无菌苗，将无菌苗的叶片切成丝状备用；
(2)低温等离子体处理：将步骤(1)切成的丝状叶片置于低温等离子体设备中，在100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下处理5～10min；
(3)酶解叶片：低温等离子体处理后的丝状叶片放入无菌酶解液中酶解，得到原生质体溶液；
(4)原生质体提纯：将原生质体溶液用无菌提纯液提纯；
(5)原生质体再生：将提纯后的原生质体用添加植物激素的培养基培养形成细胞团；
(6)诱导愈伤组织形成，即将步骤(5)获得细胞团进行诱导形成愈伤组织；
(7)诱导再生完整植株，即将步骤(6)所获得的愈伤组织培养再生形成植株。
本发明的一个实施例，所述步骤(3)中无菌酶解液为，20～30mmol/L甲基磺酸乙酯、10～15mmol/L无水氯化钙、20～40mmol/L氯化钾、0.3～0.6mol/L甘露醇、1～5mmol/L维生素C、1～2％纤维素酶R-10、0.1～0.3％离析酶R-10、0.05～0.1％果胶酶、0.1～0.2％牛血清蛋白；酶解叶片是将步骤(2)低温等离子体处理后的丝状叶片放入无菌酶解液中，置于25～28℃、转速150～200r/min的黑暗环境下酶解4～6h，得到原生质体溶液。
本发明的一个实施例，所述步骤(4)中无菌提纯液的成分为，20～30mmol/L甲基磺酸乙酯、10～15mmol/L无水氯化钙、20～40mmol/L氯化钾、0.3～0.6mol/L甘露醇、1～5mmol/L维生素C；原生质体提纯是将步骤(3)得到的原生质体溶液通过细胞筛置于80～100g转速下离心，倒掉上清液后加入无菌提纯液，在80～100g转速下离心，倒掉上清液，重复提纯，待上清液清澈透明后即可。
本发明的一个实施例，所述步骤(5)中原生质体再生为将提纯后的原生质体用KM8P液体培养基进行重悬浮，添加植物激素6-BA、NAA，轻轻摇匀后，在室温下避光静置培养2～4天，2～4天后转入避光环境下20～25℃、60～80r/min摇床中进行培养，期间添加KM8P液体培养基及植物激素6-BA、NAA，直到形成细胞团，将细胞团转移到添加植物激素6-BA、NAA、TDZ的MS培养基中，使细胞团进一步膨大。
本发明的一个实施例，所述步骤(6)中诱导愈伤组织形成为将步骤(5)形成的膨大细胞团转移到添加植物激素NAA、TDZ的MS培养基中，直到形成愈伤组织。所述步骤(7)中诱导再生完整植株为将步骤(6)形成的愈伤组织切下转移至添加植物激素6-BA、NAA、TDZ的诱导出芽MS培养基；待芽长大后切割下来，转移至添加NAA的诱导生根MS培养基上，生根后即形成完整植株。
本发明中，无菌酶解液制备为将甲基磺酸乙酯、无水氯化钙、氯化钾、甘露醇、维生素C溶于超纯水中形成基础液，再向基础液加入纤维素酶R-10、离析酶R-10、果胶酶加热溶解，待冷却至室温后加入牛血清蛋白溶解，调节PH制备成酶解液，在无菌环境下用滤头抽滤制备成无菌酶解液。
本发明中，将甲基磺酸乙酯、无水氯化钙、氯化钾、甘露醇、维生素C溶于超纯水中制备成提纯液，在无菌环境下用滤头抽滤形成无菌提纯液。
本发明中，KM8P液体培养基中植物激素添加量为：0.5～1.0mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/LNAA，使细胞团膨大的MS培养基植物激素添加量为2～3mg/L 6-BA、0.5～1mg/LNAA、0.5mg/L TDZ。
本发明中，诱导愈伤组织的MS培养基植物激素添加量为0.1～0.3mg/L NAA、2～3mg/L TDZ；
本发明中，诱导出芽MS培养基植物激素添加量为6-BA2～3mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L、TDZ 2～3mg/L，诱导生根MS培养基植物激素添加量为NAA 4～5mg/L
本发明的一个方面，本发明提供了一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，包括以下步骤：
(1)叶片切丝：选择不结球白菜的无菌苗，将无菌苗的叶片切成丝状备用；
(2)低温等离子体处理：将步骤(1)切成的丝状叶片，置于低温等离子体设备中，在100000～150000VV、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下处理5～35min；
(3)无菌酶解液制备：将甲基磺酸乙酯、无水氯化钙、氯化钾、甘露醇、维生素C溶于超纯水中形成基础液，再向基础液加入纤维素酶R-10、离析酶R-10、果胶酶加热溶解，待冷却至室温后加入牛血清蛋白溶解，调节PH制备成酶解液，在无菌环境下用滤头抽滤制备成无菌酶解液；
(4)酶解叶片：将步骤(2)低温等离子体处理后的丝状叶片放入步骤(3)制备的无菌酶解液中，置于25～28℃、转速150～200r/min的黑暗环境下酶解4～6h，得到原生质体溶液；
(5)无菌提纯液制备：将甲基磺酸乙酯、无水氯化钙、氯化钾、甘露醇、维生素C溶于超纯水中制备成提纯液，在无菌环境下用滤头抽滤形成无菌提纯液；
(6)原生质体提纯：将步骤(4)得到的原生质体溶液通过细胞筛置于80～100g转速下离心，倒掉上清液后加入步骤(5)制得的无菌提纯液，在80～100g转速下离心，倒掉上清液，重复提纯，待上清液清澈透明后即可；
(7)原生质体再生：将步骤(6)提纯后的原生质体用KM8P液体培养基进行重悬浮，添加植物激素6-BA、NAA，轻轻摇匀后，在室温下避光静置培养2～4天，2～4天后转入避光环境下20～25℃、60～80r/min摇床中进行培养，期间添加KM8P液体培养基及植物激素6-BA、NAA，直到形成细胞团，将细胞团转移到添加植物激素6-BA、NAA、TDZ的MS培养基中，使细胞团进一步膨大；
(8)诱导愈伤组织形成：将步骤(7)形成的膨大细胞团转移到添加植物激素NAA、TDZ的MS培养基中，直到形成愈伤组织；
(9)诱导再生完整植株：将步骤(8)形成的愈伤组织切下转移至添加植物激素6-BA、NAA、TDZ的诱导出芽MS培养基；待芽长大后切割下来，转移至添加NAA的诱导生根MS培养基上，生根后即形成完整植株；
优选的，所述步骤(3)无菌酶解液成分为，0～30mmol/L甲基磺酸乙酯、10～15mmol/L无水氯化钙、20～40mmol/L氯化钾、0.3～0.6mol/L甘露醇、1～5mmol/L维生素C、1～2％纤维素酶R-10、0.1～0.3％离析酶R-10、0.05～0.1％果胶酶、0.1～0.2％牛血清蛋白。
优选的，所述步骤(5)无菌提纯液的成分为，20～30mmol/L甲基磺酸乙酯、10～15mmol/L无水氯化钙、20～40mmol/L氯化钾、0.3～0.6mol/L甘露醇、1～5mmol/L维生素C。
优选的，所述步骤(7)KM8P液体培养基中植物激素添加量为，0.5～1.0mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/L NAA，MS培养基植物激素添加量为2～3mg/L 6-BA、0.5～1mg/L NAA、0.5mg/LTDZ。
优选的，所述步骤(8)MS培养基植物激素添加量为0.1～0.3mg/L NAA、2～3mg/LTDZ；
优选的，所述步骤(9)诱导出芽MS培养基植物激素添加量为6-BA 2～3mg/L、NAA0.1～0.3mg/L、TDZ 2～3mg/L，诱导生根MS培养基植物激素添加量为NAA 4～5mg/L。
有益效果：
与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)提高了原生质体酶解产量；(2)明显提高了原生质体活性；(3)提高了原生质体再生率；(4)促进了再生植株生长。
附图说明
图1ACE分别为显微镜下，未经低温等离子体处理的原生质体细胞在第2、5、15天状态；BDF分别为显微镜下100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下处理10分钟的原生质体细胞在第2、5、15天的状态。可以明显的看出可以看出低温等离子体处理的材料(BDF)的分裂状态高于未进行低温等离子体处理的材料(ACE)。
图2AC分别为肉眼观察，未经低温等离子体处理的原生质体在第2、15天的状态；BD分别为肉眼观察，100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下处理10分钟的原生质体细胞在第2、15天的状态。观察经过10000V低温等离子体处理后在KM8P培养液中原生质体培养的各个时期，能明显看出原生质体在培养过程中逐步形成细胞团。
图3为100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下处理10分钟的原生质体形成的愈伤组织；可以明显看出愈伤组织生长旺盛。
图4为未经低温等离子体和100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下处理10分钟的原生质体再生形成的不定芽。可以明显看出100000V低温等离子处理10min后原生质体再生植株长势(侧芽数、生长量等)明显好于未处理植株。
图5为未经低温等离子体未处理和100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下处理10分钟的原生质体再生形成的完整植株。可以明显看出100000V低温等离子处理10min后原生质体再生植株不仅株高长势，生根量也明显好于未处理植株。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
MS培养基购自南京峥阳生物科技有限公司，货号：M519-100L。
KM8P培养基购自南京峥阳生物科技有限公司，货号：la8641。
进行原生质体计数及活性检测具体操作：取原生质体悬液20μL，加20μL台盼蓝溶液混匀，静置10s。将10μL混合液加入细胞计数板中，静置30s，插入细胞计数器计数，在普通光学显微镜下读取细胞密度D(个/mL)并计算成活率。每个样本设置3次重复。计算公式：
细胞总数＝细胞密度×溶液体积
成活率＝[染色原生质体细胞(死细胞)数/细胞总数]×100％
植株再生率＝再生植株数/总愈伤数。
实施例1
一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，包括以下步骤：
(1)叶片切丝：在南京苏曼等离子体工程研究院细胞工程实验室选择健壮不结球白菜—苏州青的无菌苗，将无菌苗的叶片切成丝状，置于培养皿中备用；
(2)低温等离子体处理：将符合标准苏州青叶片丝置于培养皿中，铺平后置于CPCS-I型低温等离子体设备中，分别在0V、100000V、120000V、150000V，50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下对苏州青叶片丝处理10min。
(3)无菌酶解液制备：在细胞工程实验室将20mmol/L甲基磺酸乙酯、10mmol/L无水氯化钙、20mmol/L氯化钾、0.3mol/L甘露醇、1mmol/L维生素C溶于1L超纯水中，加入10g/L纤维素酶R-10、1g/L离析酶R-10、0.5g/L果胶酶，50℃水浴10min，待冷却至室温后加入1g/L牛血清蛋白溶解，调节PH到5.2制备成酶解液，在无菌环境下用0.22μm的滤头抽滤制备成无菌酶解液；
(4)酶解叶片：取步骤(2)10g低温等离子体处理后的丝状叶片放入步骤(3)制备的20ml无菌酶解液中，用锡箔纸包裹避光后，在温度26℃、转速180r/min下酶解4h，得到原生质体溶液；
(5)无菌提纯液制备：将20mmol/L甲基磺酸乙酯、10mmol/L无水氯化钙、20mmol/L氯化钾、0.3mol/L甘露醇、1mmol/L维生素C溶于1L超纯水中形成提纯液，在无菌环境下用0.22μm的滤头抽滤形成无菌提纯液；
(6)原生质体提纯：将步骤(4)得到的原生质体溶液用70μm细胞筛过滤后，将滤液置于100g转速下离心10min，倒掉上清液加入20ml提纯液，在100g转速下离心5min，将上清液倒掉，重复提纯3次，待上清液清澈透明后倒掉上清液即可得到提纯的原生质体；
(7)检测步骤6获得的原生质体的产量及活性。
本实施例处理后的原生质体产量及成活率如表1所示。
表1
与不施加电压的0V组对比，存在显著性的差异(同一列数据后不同字母表示在0.05水平差异显著。)
通过表1可以看出利用低温等离子体设备中设置100000V电压、50HZ、极板距离4cm，处理10min的条件下，产生的原生质体细胞总数显著的优于不用使用等离子体处理以及在120000V、150000V条件下处理。等离子电场下会生成部分活化物质，该部分物质在适宜浓度范围内会增加酶活性，增加产量。当超过一定浓度后会导致酶活性降低，减少产量，同时破坏细胞膜稳定性，降低原生质体存活率，而100000V电压、50HZ、极板距离4cm，处理10min是一个比较合适的条件。
实施例2
步骤与实施案例1相同，不同之处在于：
(2)低温等离子体处理：将符合标准苏州青叶片丝置于培养皿中，铺平后置于CPCS-I型低温等离子体设备中，在100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下对苏州青叶片丝分别处理0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min；
本实施例处理后原生质体产量及成活率如表2所示。
表2
与处理时间为0min组对比，存在显著的差异(同一列数据后不同字母表示在0.05水平差异显著)。
实施例3
(1)叶片切丝：在南京苏曼低温等离子体工程研究院细胞工程实验室选择健壮不结球白菜—苏州青的无菌苗，将无菌苗的叶片切成丝状，置于培养皿中备用；
(2)低温等离子体处理：将符合标准苏州青叶片丝置于培养皿中，铺平后置于CPCS-I型低温等离子体设备中，在实施例1和实施例2得到的最佳(100000V、50HZ、极板距离4cm)低温等离子体电场条件下对苏州青叶片丝处理10min；
(3)无菌酶解液制备：在细胞工程实验室将25mmol/L甲基磺酸乙酯、15mmol/L无水氯化钙、30mmol/L氯化钾、0.5mol/L甘露醇、3mmol/L维生素C溶于1L超纯水中，加入15g/L纤维素酶R-10、2g/L离析酶R-10、0.75g/L果胶酶，50℃水浴10min，待冷却至室温后加入1.5g/L牛血清蛋白溶解，调节PH到5.5制备成酶解液，在无菌环境下用0.22μm的滤头抽滤制备成无菌酶解液；
(4)酶解叶片：取步骤(2)低温等离子体处理后的10g丝状叶片放入步骤(3)制备的20ml无菌酶解液中，用锡箔纸包裹避光后，在温度25℃、转速200r/min下酶解6h，得到原生质体溶液；
(5)无菌提纯液制备：将25mmol/L甲基磺酸乙酯、15mmol/L无水氯化钙、30mmol/L氯化钾、0.5mol/L甘露醇、3mmol/L维生素C溶于1L超纯水中形成提纯液，在无菌环境下用0.22μm的滤头抽滤形成无菌提纯液；
(6)原生质体提纯：将步骤(4)得到的原生质体溶液用70μm细胞筛过滤后，将滤液置于80g转速下离心10min，倒掉上清液加入20ml提纯液，在80g转速下离心5min，将上清液倒掉，重复提纯3次，待上清液清澈透明后倒掉上清液即可得到提纯的原生质体；
(7)原生质体再生：将步骤(6)得到的原生质体用20ml KM8P液体培养基重悬浮，并添加植物激素0.75mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA，轻轻摇匀后，在20℃避光环境下静置培养3天，3天后转入避光环境下20℃、60r/min摇床中进行培养，每隔7天添加含有植物激素0.75mg/L6-BA、0.2mg/L NAA的10ml KM8P液体培养基，培养20天左右形成细胞团，将细胞团转移到添加植物激素2.5mg/L 6-BA、0.75mg/L NAA、0.5mg/LTDZ的20ml MS培养基，在光暗周期16-8h、温度24℃的环境下进行培养，使细胞团进一步膨大，；
(8)诱导愈伤形成：再将步骤(7)得到的膨大细胞团转移到添加植物激素0.2mg/LNAA、2.5mg/L TDZ的20ml MS培养基，培养15天左右至愈伤膨大成形；
(9)诱导再生完整植株：将步骤(8)成形愈伤切下后转移至添加植物激素2.5mg/L6-BA、0.2mg/L NAA、2.5mg/L TDZ的20ml MS培养基上进行诱导出芽；待芽长大后切割下来，转移至添加4.5mg/L NAA的20ml MS培养基上诱导生根，生根后即形成完整植株。
实施例4
(1)叶片切丝：在南京苏曼低温等离子体工程研究院细胞工程实验室选择健壮不结球白菜—苏州青的无菌苗，将无菌苗的叶片切成丝状，置于培养皿中备用；
(2)低温等离子体处理：将符合标准苏州青叶片丝置于培养皿中，铺平后置于CPCS-I型低温等离子体设备中，在实施例1和实施例2得到的最佳(100000V、50HZ、极板距离4cm)低温等离子体电场条件下对苏州青叶片丝处理10min；
(3)无菌酶解液制备：在细胞工程实验室将30mmol/L甲基磺酸乙酯、5mmol/L无水氯化钙、40mmol/L氯化钾、0.6mol/L甘露醇、5mmol/L维生素C溶于1L超纯水中，加入20g/L纤维素酶R-10、3g/L离析酶R-10、1g/L果胶酶，60℃水浴20min，待冷却至室温后加入2g/L牛血清蛋白溶解，调节PH到5.7制备成酶解液，在无菌环境下用0.22μm的滤头抽滤制备成无菌酶解液；
(4)酶解叶片：取步骤(2)10g低温等离子体处理后的丝状叶片放入步骤(3)制备的20ml无菌酶解液中，用锡箔纸包裹避光后，在温度28℃、转速180r/min下酶解5h，得到原生质体溶液；
(5)无菌提纯液制备：将30mmol/L甲基磺酸乙酯、15mmol/L无水氯化钙、40mmol/L氯化钾、0.6mol/L甘露醇、5mmol/L维生素C溶于1L超纯水中形成提纯液，在无菌环境下用0.22μm的滤头抽滤形成无菌提纯液；
(6)原生质体提纯：将步骤(4)得到的原生质体溶液用70μm细胞筛过滤后，将滤液置于100g转速下离心10min，倒掉上清液加入20ml提纯液，在100g转速下离心5min，将上清液倒掉，重复提纯3次，待上清液清澈透明后倒掉上清液即可得到提纯的原生质体；
(7)原生质体再生：将步骤(6)得到的原生质体用20ml KM8P液体培养基重悬浮，并添加植物激素1mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA，轻轻摇匀后，在20℃避光环境下静置培养3天，3天后转入避光环境下20℃、60r/min摇床中进行培养，每隔7天添加含有植物激素1mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA的10ml KM8P液体培养基，培养20天左右形成细胞团，将细胞团转移到添加植物激素3mg/L 6-BA、1mg/L NAA、0.5mg/L TDZ的20ml MS培养基，在光暗周期16-8h、温度24℃的环境下进行培养，使细胞团进一步膨大，；
(8)诱导愈伤形成：再将步骤(7)得到的膨大细胞团转移到添加植物激素0.3mg/LNAA、3mg/L TDZ的20ml MS培养基，培养15天左右至愈伤膨大成形；
(9)诱导再生完整植株：将步骤(8)成形愈伤切下后转移至添加植物激素3mg/L6-BA、0.3mg/L NAA、3mg/L TDZ的20ml MS培养基上进行诱导出芽；待芽长大后切割下来，转移至添加5mg/L NAA的20ml MS培养基上诱导生根，生根后即形成完整植株。
对比例1
本实施例作为未采用冷等离子体处理的对照组进行比较研究。
本实施例的步骤除没有实施例3中的步骤(2)低温等离子体处理以外，其他与实施例3相同。在比较研究中，比较研究了实施例3和对比例1从原生质体细胞状态到原生质体诱导再生植株的整个过程，相关结果如图1-图5所示。从图1可以明显的看出可以看出低温等离子体处理的材料(BDF)的分裂状态高于未进行低温等离子体处理的材料(ACE)。图2是在KM8P培养液中原生质体培养的各个时期，能明显看出原生质体在培养过程中逐步形成细胞团。图3是100000V低温等离子处理10min后原生质体形成的愈伤组织，愈伤组织生长旺盛。图4是生长时间相同的原生质体再生植株，可以明显看出100000V低温等离子处理10min后原生质体再生植株长势(侧芽数、生长量等)明显好于未处理植株。图5是生长时间相同的原生质体再生植株，可以明显看出100000V低温等离子处理10min后原生质体再生植株不仅株高长势，生根量也明显好于未处理植株。
实施例3、4、对比例1低温等离子体处理后的原生质体产量和再生率如表4所示。
表4
同一列数据后不同字母表示在0.05水平差异显著。
Claims (7)
1.一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，其特征在于，将植物叶片置于低温等离子体电场下处理后，通过酶解法得到叶肉细胞原生质体，再将叶肉细胞原生质体再生形成完整植物，所述低温等离子体电场为100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场，叶片在低温等离子体电场下处理时间为5~10min，所述植物为不结球白菜亚种。
2.一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）叶片切丝：选择植物的无菌苗，将无菌苗的叶片切成丝状备用；
（2）低温等离子体处理：将步骤（1）切成的丝状叶片置于低温等离子体设备中，在100000V、50HZ、极板距离4cm的低温等离子体电场下处理5~10min；
（3）酶解叶片：低温等离子体处理后的丝状叶片放入无菌酶解液中酶解，得到原生质体溶液；
（4）原生质体提纯：将原生质体溶液用无菌提纯液提纯；
（5）原生质体再生：将提纯后的原生质体用添加植物激素的培养基培养形成细胞团；
（6）诱导愈伤组织形成，即将步骤（5）获得细胞团进行诱导形成愈伤组织；
（7）诱导再生完整植株，即将步骤（6）所获得的愈伤组织培养再生形成植株；
所述植物为不结球白菜亚种。
3.根据权利要求2所述的一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，其特征在于，所述步骤（3）中无菌酶解液为，20~30mmol/L甲基磺酸乙酯、10~15mmol/L无水氯化钙、20~40mmol/L氯化钾、0.3~0.6mol/L甘露醇、1~5mmol/L维生素C、1~2%纤维素酶R-10、0.1~0.3%离析酶R-10、0.05~0.1%果胶酶、0.1~0.2%牛血清蛋白；酶解叶片是将步骤（2）低温等离子体处理后的丝状叶片放入无菌酶解液中，置于25~28℃、转速150~200r/min的黑暗环境下酶解4~6h，得到原生质体溶液。
4.根据权利要求2所述的一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，其特征在于，所述步骤（4）中无菌提纯液的成分为，20~30mmol/L甲基磺酸乙酯、10~15mmol/L无水氯化钙、20~40mmol/L氯化钾、0.3~0.6mol/L甘露醇、1~5mmol/L维生素C；原生质体提纯是将步骤（3）得到的原生质体溶液通过细胞筛置于80~100g转速下离心，倒掉上清液后加入无菌提纯液，在80~100g转速下离心，倒掉上清液，重复提纯，待上清液清澈透明后即可。
5.根据权利要求2所述的一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，其特征在于，所述步骤（5）中原生质体再生为将提纯后的原生质体用KM8P液体培养基进行重悬浮，添加植物激素6-BA、NAA，轻轻摇匀后，在室温下避光静置培养2~4天，2~4天后转入避光环境下20~25℃、60~80r/min摇床中进行培养，期间添加KM8P液体培养基及植物激素6-BA、NAA，直到形成细胞团，将细胞团转移到添加植物激素6-BA、NAA、TDZ的MS培养基中，使细胞团进一步膨大。
6.根据权利要求2所述的一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，其特征在于，所述步骤（6）中诱导愈伤组织形成为将步骤（5）形成的膨大细胞团转移到添加植物激素NAA、TDZ的MS培养基中，直到形成愈伤组织。
7.根据权利要求2所述的一种利用低温等离子体促进原生质体再生的方法，其特征在于，所述步骤（7）中诱导再生完整植株为将步骤（6）形成的愈伤组织切下转移至添加植物激素6-BA、NAA、TDZ的诱导出芽MS培养基；待芽长大后切割下来，转移至添加NAA的诱导生根MS培养基上，生根后即形成完整植株。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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